DNA ricombinante

Tecnologia del DNA ricombinante

Tecnologia di recente invenzione con cui è possibile modificare un DNA d’interesse ed usarlo per diversi scopi. È stata messa a punto nel 1973 da Boyer e Cohen, che hanno unito tutte le conoscenze raccolte fino a quel momento sul DNA (1953 doppia elica, codice genetico). Questa tecnica ha permesso il sequenziamento del genoma di molti organismi, compreso l’uomo (utile per capire i geni coinvolti nelle patologie e i meccanismi di regolazione dell’espressione genica) e la creazione di organismi geneticamente modificati per la produzione di farmaci (es. insulina).

Meccanismo di ricombinazione del DNA

Fondamentale per capire il meccanismo di ricombinazione del DNA è la capacità del DNA di ibridarsi con filamenti di DNA appartenenti anche a organismi diversi (genoma altamente conservato). La tecnologia del DNA ricombinante è stata messa a punto su E. Coli: possiede un unico cromosoma anulare ed è in grado di fare la trasformazione (ricombinazione del materiale genico), caratteristica molto utile per la creazione di organismi transgenici.

Meccanismi di variabilità genetica nei batteri

• Trasduzione: quando un batteriofago infetta un virus, può integrare il proprio materiale genetico in quello del batterio (ciclo lisogenico). Quando il ciclo litico si riattiva, il virus fuoriuscendo dalla cellula può per errore portarsi dietro frammenti del genoma batterico. Quando va a infettare un altro batterio, inietta il genoma batterico acquisito nel nuovo ospite.
• Coniugazione: passaggio di plasmidi tramite pili coniugativi.

E. Coli possiede vari plasmidi (rivelatisi strumenti efficaci per creare organismi transgenici). In laboratorio si fanno mantenere i plasmidi all’interno dei batteri ponendoli in terreni in cui sono indispensabili (ad es. ricchi di antibiotico).

Enzimi di restrizione

Nel batterio sono presenti anche enzimi di restrizione, endonucleasi in grado di idrolizzare i legami fosfodiesterei del DNA, utilizzate dai batteri per proteggersi dagli attacchi di DNA esogeno. Gli enzimi riconoscono regioni specifiche di nucleotidi sul DNA esogeno (siti di restrizione) e le idrolizzano. Ogni enzima di restrizione riconosce un proprio sito di restrizione specifico. Il DNA batterico è protetto grazie a metilazioni (non viene riconosciuto dall’enzima).

L’enzima può tagliare il DNA in due modi:

• Formando due tratti di DNA ciascuno con un’estremità a singolo filamento  coesive o aderenti, (più usate nella tecnologia del DNA ricombinante perché estremità adesive trattate con lo stesso enzima di restrizione e quindi complementari possono unirsi tramite DNA ligasi).
• Tagliando il DNA alla stessa altezza nei due filamenti generando due molecole con le estremità a doppio filamento  piatte (possono essere usate per creare molecole di DNA ricombinante ma in modo meno efficiente).

Esperimenti di Boyer e Cohen

Boyer e Cohen avevano scoperto alcuni plasmidi in E. Coli che li conferiscono resistenza ad alcuni antibiotici. Volevano scoprire se era possibile manipolare il materiale genetico del batterio: trattarono due plasmidi responsabili della resistenza a due diversi antibiotici con lo stesso enzima di restrizione creando frammenti di DNA con estremità adesive e ottennero – mettendo le due molecole nella stessa provetta – un unico plasmide ibrido. Indussero poi una colonia di batteri a trasformare e ad inglobare tale plasmide: verificarono che alcuni batteri avevano inglobato il plasmide ibrido dimostrando che, se posti in un terreno contenente entrambi gli antibiotici, essi sopravvivevano (esprimevano correttamente entrambi i geni). Questi batteri furono i primi organismi transgenici mai creati (qualsiasi organismo che inglobi materiale genetico esogeno).

Cellule di mammifero e traspezione

Anche le cellule di mammifero possono essere rese transgeniche se indotte ad eseguire la traspezione di vettori ricombinanti (plasmidi artificiali). I vettori sono piccole molecole di DNA circolare in grado di introdurre geni esogeni all’interno di un organismo ospite. Una volta entrati nell’ospite, i vettori devono moltiplicarsi e fargli produrre, ad esempio, una proteina d’interesse.

Creazione di vettori ricombinanti

Per ottenere un vettore ricombinante:

• Si taglia la molecola di DNA d’interesse con un enzima di restrizione (se non presenta siti di restrizione, possono essere aggiunti legando con legame fosfodiestereo una nuova sequenza di nucleotidi all’estremità 5’ e 3’).
• Si taglia un plasmide con lo stesso enzima.
• La DNA ligasi unisce il DNA d’interesse e il plasmide formando un vettore ricombinante.

Clonazione molecolare

Con i vettori ricombinanti è possibile eseguire la clonazione molecolare o genica: si introduce una molecola di DNA ricombinante – trasportata dal vettore plasmidico – all’interno di un organismo ospite (batterico), che la accetta e si riproduce (ogni 20 min) generando una colonia di organismi transgenici, che contengono ciascuno una molecola del DNA ricombinante. Si utilizza questa tecnica per amplificare il DNA ricombinante perché creare un plasmide contenente un gene esogeno è piuttosto complesso. In questo modo infatti il DNA ricombinante può essere facilmente conservato.

Conservazione del DNA ricombinante

I batteri sono un ottimo organismo modello in questo senso perché crescono normalmente a 37°C, quelli usati in laboratorio sono GM per cui non sono più patogeni e possono essere congelati a -80°C (soluzione di batteri transgenici + glicerolo). Il DNA da solo può essere conservato a -20°C, ma per poco tempo. La conservazione del plasmide può essere fatta anche in cellule di mammifero conservate in azoto.