Dispensa completa di appunti di Istologia

Microscopia

Anatomia generale dell'occhio

Il microscopio è strutturato come il nostro occhio. È fatto da una camera posteriore, una anteriore e una lente (cristallino) che divide le due camere. La camera posteriore è l’origine del nervo ottico → struttura nervosa fatta di assoni con il compito di trasformare il segnale luminoso in figura. Tra il rivestimento della camera anteriore (cornea) e il cristallino c’è l’iride, che può essere diversamente colorata in base al soggetto. L’iride è il diaframma del nostro occhio → grazie a un certo quantitativo di luce l’iride si apre e si chiude permettendo alla pupilla (forellino) di allargarsi o di restringersi. Sul fondo della camera posteriore (che è riempita di umor vitreo o corpo vitreo) ci sono dei vasi sanguigni e da lì parte il nervo ottico.

Cosa succede?

La luce passa attraverso la cornea, l’iride, il cristallino e si va a focalizzare sulla retina, in un punto ben preciso chiamato fovea, in cui sono presenti la maggior parte dei fotorecettori. A livello della fovea, la retina non è vascolarizzata. Cornea → strato di cellule formato da un tessuto di riempimento connettivo (stroma) + altro epitelio che delimita la camera anteriore. Il cristallino, che sta dopo l’iride, è fatto in modo regolare, così che non devii il fascio di luce. La retina è fatta da una serie di popolazioni cellulari: cellule che fanno da rivestimento alla camera posteriore e fotorecettori (coni e bastoncelli), i quali si connettono con dei neuroni che fanno da ponte con quelle che sono le cellule nervose che, con il loro prolungamento, costituiscono il nervo ottico.

Istologia dell’occhio

• Un epitelio pigmentato
• Degli strati dei fotorecettori
• Interneuroni → fanno da ponte tra i fotorecettori e i neuroni veri e propri, i cui assoni costituiscono il nervo ottico.
• Regione sinaptica → zona di contatto tra due cellule nervose
• Neuroni gangliari
• Assoni dei neuroni gangliari → nervo ottico

A livello della fovea lo spessore si riduce notevolmente → in questo modo lo spessore che la luce deve attraversare è minore e riesce più facilmente a convertire il segnale. La linea bianca divide la parte di epitelio e tutta la parte deputata alla trasformazione del segnale. È a livello dei fotorecettori che la luce va a colpire i recettori formando un’immagine che noi percepiamo → arriva il segnale luminoso, va sulla retina e la retina elabora tutto in un’immagine.

Limite di risoluzione

Naturalmente, per vedere i particolari si deve ridurre la distanza → questo perché se riduco la distanza tra il mio sistema ottico e ciò che sto guardando, l’area di rete occupata dall’immagine si allarga. I particolari che si riescono a vedere di un’immagine dipendono sia dallo strumento ottico utilizzato (l’occhio umano) sia dalle dimensioni di ciò che sto osservando. La capacità di vedere viene definita dal limite di risoluzione (o potere di risoluzione) → quello dell’occhio è di 0,2 mm. Ci sono infatti delle immagini che noi non vediamo tramite il solo uso del nostro occhio in quanto queste hanno dimensioni inferiori a 0,2 mm.

• Il microscopio ottico ha un limite di risoluzione di 200 nm;
• Il microscopio elettronico ha un limite di risoluzione di 0,2 nm.

È importante ricordare che noi vediamo distinta un’immagine in funzione del numero di fotorecettori che viene occupato sulla retina.

Il microscopio ottico

Il microscopio ottico ha un potere di risoluzione di 0,2 micron ed è costituito da:

• Sorgente luminosa → lampadina che ha un’apertura, coperta da un vetro, da cui passa il raggio luminoso.
• Condensatore → funziona come il diaframma della macchina fotografica: va ad aprire e chiudere per focalizzare un’area più o meno vasta. Fa convergere la luce al campione.
• Diaframma → controlla la quantità di luce che entra nel condensatore.
• Vetrino porta oggetto
• Vetrino copri oggetto
• Etichetta
• Obiettivi → lenti che migliorano il potere di risoluzione di 4 volte (4x), 20 volte (20x) o 50 volte (50x). Si deve agire sulla ghiera per spostare gli obiettivi.
• Oculare → ingrandisce l’immagine formata dall’obiettivo.

Quando la luce colpisce il preparato, un po’ di luce viene riflessa, un po’ di luce viene diffratta e un po’ di luce viene trasmessa → luce che raccoglie il microscopio e che andrà all’obiettivo. I preparati per la microscopia ottica vengono colorati.

Dove si forma l’immagine del microscopio?

Nel punto tra la lente dell’oculare e tra la lente dell’obiettivo. Le lenti dell’obiettivo non devono mai toccare i vetrini del preparato. Ciò che si vede tramite l’obiettivo si chiama campo: aumentando la risoluzione il campo diminuisce. Se l’immagine è sfocata, si aggiusta il fuoco tramite le rotelle sulla destra:

• La rotella grande ha un aggiustamento macrometrico → il tavolino si abbassa o si alza in funzione del giro che si dà alla manopola.
• La rotella piccola è quella micrometrica → serve per aggiustare il fuoco.

Esistono altre due manopole che servono per muovere il tavolino parallelamente e perpendicolarmente.

Teoria sulla microscopia

Dal condensatore fuoriesce un fascio luminoso che colpisce il preparato: un po’ di luce verrà riflessa, un po’ diffratta e un po’ trasmessa. La luce incidente forma un certo angolo; anche la luce che esce ne forma uno.

Da cosa dipende la risoluzione che ha come dimensioni una distanza? Da un rapporto tra una costante (0,61) per lambda (lunghezza d’onda = definisce la distanza tra un picco e l’altro di due onde) e il parametro n (indice di rifrazione = ci dà un’idea delle caratteristiche del sistema che si trova in mezzo tra la luce incidente e la luce trasmessa fino ad arrivare all’obiettivo) per il seno del semi angolo:

0,61risoluzione= n sin

Il limite di risoluzione diminuisce quando il numeratore è tanto piccolo oppure quando il denominatore è tanto grande (o entrambe le cose) → Per avere una buona risoluzione si può quindi diminuire la lunghezza d’onda portandola vicino all’ultravioletto. Si può migliorare la risoluzione anche modificando il denominatore → l’angolo della luce incidente si regola tramite il condensatore: più grande sarà l’angolo incidente, più grande sarà l’angolo della luce trasmessa. In questo modo maggiore sarà il seno, minore sarà il limite di risoluzione e maggiore sarà la risoluzione.

Per agire sul seno dell’angolo bisogna lavorare sulla curvatura delle lenti → lo fa il costruttore. Il parametro presente al denominatore può essere anche chiamato apertura numerica → lo stabilisce e lo esplicita il costruttore in quanto è lui che ha deciso la curvatura delle lenti. Si può anche agire sull’indice di rifrazione → esistono degli obiettivi (quelli con alti poteri di ingrandimento, 60x) che sono costruiti in modo tale da permettere l’aggiunta tra il preparato e la lente dell’obiettivo una goccia d’olio → l’indice di rifrazione, quindi, non è più quello dell’aria, ma aumenta da 1 a 1,3. Agendo sull’apertura numerica diventa molto più grande → Aumenta il seno dell’angolo e aumenta l’indice di rifrazione.

Ogni raggio che fuoriesce dall’obiettivo viene raccolto nel punto focale dove si forma l’immagine che noi vediamo.

Microscopio elettronico

Il microscopio elettronico, dal punto di vista del sistema ottico, è identico al microscopio ottico → l’unica differenza è la sorgente luminosa che non è più luce bianca ma un fascio di elettroni. Grazie all’utilizzo del fascio di elettroni si diminuisce il numeratore → la lunghezza d’onda degli elettroni è molto inferiore rispetto a quella della luce ultravioletta. Il microscopio elettronico, inoltre, è molto più grande.

Microscopio elettronico a trasmissione

Un filamento di tungsteno messo in un cannone sottovuoto e sottoposto a una differenza di potenziale costituisce la sorgente “luminosa” → genera il fascio di elettroni. Anche in questo caso si hanno due oculari, però l’occhio umano non può vedere l’immagine che si forma da una lunghezza d’onda così piccola come quella degli elettroni → esiste quindi un sistema che costruisce e proietta l’immagine su uno schermo associato ad una camera digitale che è attaccata ad un computer: l’immagine quindi si vede sul computer. Anche il microscopio elettronico ha il condensatore, che non è fatto da una lente di vetro come quello dell’ottico ma da un magnete cavo che attira gli elettroni e li focalizza su un picco. Anche le lenti degli “obiettivi” e degli oculari non sono di vetro ma sono dei magneti → infatti l’oculare è un proiettore. Il microscopio non ha l’obiettivo, ma ha comunque un sistema di lenti e delle manopole esterne con cui è possibile regolare l’ingrandimento. Il vetro non trasmette gli elettroni → per questo motivo i preparati per la microscopia elettronica non vengono depositati su un vetro ma su un retino di rame che ha le dimensioni di 3 mm; non si può manipolare con le mani ma con le pinzette.

Come funziona quindi?

Il filamento di tungsteno genera il fascio di elettroni che passa attraverso il condensatore; poi passa attraverso il retino di rame, viene convogliato verso l’obiettivo, poi verso il proiettore e poi si costruisce l’immagine che noi vediamo su uno schermo → l’immagine viene costruita solo con gli elettroni trasmessi (= microscopia elettronica a trasmissione). Mentre i preparati per la microscopia ottica vengono colorati, quelli per la microscopia elettronica a trasmissione vengono contrastati → si utilizzano delle sostanze che sono opache agli elettroni e che se si attaccano alle molecole del preparato impediscono agli elettroni di essere trasmessi. L’immagine costruita che si vede è quella data dagli spazi “vuoti” del preparato.

Microscopio elettronico a scansione

È sempre un microscopio elettronico → quindi c’è un fascio di elettroni prodotto dal filamento di tungsteno che passa per il condensatore, per il retino di rame, per l’obiettivo e poi per il proiettore. L’unica differenza è la presenza di un deflettore con cui è possibile modificare la direzione del fascio di elettroni, spostandolo in qualunque verso → si fa come una scansione del preparato. Il preparato, però, può avere le sue irregolarità → in questo caso al campione viene spruzzato sopra un metallo elettrondenso (come l’oro) così che nessuno degli elettroni venga trasmesso in quanto il metallo elettrondenso è opaco agli elettroni. Il singolo elettrone che colpisce il preparato può essere solo riflesso. Solo gli elettroni riflessi con una certa angolazione e con sufficiente forza da arrivare al rivelatore vengono utilizzati per costruire l’immagine:

• Se arrivano al rilevatore con molta forza lo “sbiancano” = punto bianco;
• Se non arrivano al rilevatore = punto nero;
• Se arrivano al rilevatore ma con poca forza = scala di grigi.

Un’altra differenza è che l’immagine non è bidimensionale ma tridimensionale.

Preparazione dei campioni per la microscopia ottica

Bisogna preparare i campioni così da poterli vedere al microscopio. Ci sono due condizioni:

• I campioni devono essere sufficientemente sottili da far passare il fascio di luce o di elettroni;
• Deve essere preservata la morfologia della cellula e degli organuli subcellulari.

Fasi della preparazione

1. Prelievo del campione → sempre inferiore al cm³. Va eseguito rapidamente.
2. Fissazione → dovendo preservare il campione, bisogna fissarlo, in modo tale da mantenerne la stabilità morfologica e strutturale. La fissazione può essere ottenuta tramite sistemi fisici (congelamento, essicamento) o tramite sistemi chimici → si usano dei reagenti per bloccare le caratteristiche del campione stesso, che in genere sono dei coagulanti oppure degli alcol, più comune l’etanolo. Può essere anche utilizzata una formalina, una molecola che deriva dalla formaldeide, oppure l’acido acetico. I fissativi sono usati in miscela.
3. Lavaggio → bisogna lavare il campione, soprattutto quando vengono usati fissativi chimici, con una soluzione tampone.
4. Disidratazione → il campione deve essere disidratato: si immerge il vetrino per qualche minuto in una soluzione di etanolo acqua al 50%, poi etanolo acqua al 70%, poi etanolo acqua al 90% e poi etanolo assoluto al 100%.
5. Chiarificazione (o diafanizzazione) → per poter studiare un campione, è necessario avere delle “fette” abbastanza sottili di quest’ultimo, di modo che il raggio luminoso possa passare senza problemi. Per poterlo maneggiare meglio e per poter eseguire il taglio c’è bisogno di fare l’inclusione nella paraffina → il campione viene immerso in xilene, solvente organico miscibile sia con l’etanolo che con la paraffina. Il preparato commerciale per la diafanizzazione si chiama Histolemon.
6. Inclusione in paraffina → la paraffina è una miscela di idrocarburi saturi e insaturi di 20-40 atomi di carbonio. Si presenta come una massa cerosa insolubile in acqua e in etanolo, ma solubile in xilene. L’inclusione viene effettuata in paraffina liquida, mantenuta a 60° in apposite stufe dove, preferibilmente, è possibile effettuare il vuoto. La paraffina viene poi lasciata solidificare a temperatura ambiente per 24 ore. In microscopia elettronica viene usata la resina → permette di tagliare il preparato in fettine più sottili e con essa non è necessario il processo di diafanizzazione.
7. Taglio al microtomo → è uno strumento che serve per tagliare in fette il campione incluso nella paraffina o nella resina. Lo spessore del taglio può andare dai 3 ai 10 micron.
8. Distensione delle fette su vetrini → la paraffina si arriccia perciò, dopo il taglio, bisogna distendere le fette sui vetrini, ognuna su una goccia d’acqua: con l’acqua, infatti, la paraffina si distende.
9. Sparaffinatura in solventi organici → si elimina la paraffina dalle fette tramite l’acqua.
10. Reidratazione delle fette tramite la serie discendente degli alcool → si immergono le fette in etanolo al 100%, poi etanolo al 90%, poi etanolo al 70%, poi etanolo al 50% e infine acqua.
11. Colorazione → Può avvenire in diversi modi:
    • Diretta/semplice: direttamente nella soluzione colorante monocromica;
    • Combinata: bicromica o tricromica → due o tre coloranti;
    • Indiretta: tramite l’azione preliminare di sostanze preparatorie (mordenti).
12. Disidratazione tramite la serie ascendente degli alcool;
13. Montaggio in balsamo (resine sintetiche) → il preparato sul vetrino viene chiuso con un altro vetrino copri-oggetto e viene fatto aderire con il balsamo del Canada o con altre resine sciolte in xilene. Il vetrino così è pronto per l’osservazione al microscopio ottico.

Preparazione dei campioni per la microscopia elettronica

Per il microscopio elettronico ci sono molti meno passaggi. La fissazione non viene fatta in formalina ma in glutaraldeide → molecola che ha la caratteristica di avere due gruppi aldeidici nella stessa catena che si agganciano ai gruppi amminici alle estremità. La fissazione è più efficiente. In genere, la glutaraldeide si usa insieme alla paraformaldeide in una soluzione chiamata fissativo di Karnovsky. Dopo la fissazione, il campione può essere conservato in una soluzione a base di cacodilato (molecola) prima di procedere alla fase di post fissazione. Successivamente è necessaria una post fissazione con tetrossido di osmio, in quanto non si ha una vera e propria colorazione. L’osmio è opaco agli elettroni e quando si lega ai lipidi li annerisce → non solo aiuta a preservare il campione ma dà anche un inizio di contrastazione, in quanto ossida i lipidi ed è opaco agli elettroni. L’inclusione viene fatta in resina, previo lavaggio dopo la post fissazione con un tampone e disidratazione (serie ascendente dell’etanolo). Includendo il campione in resina e non in paraffina non è necessaria la diafanizzazione. Il taglio si fa più o meno nello stesso modo di quello dei preparati per la microscopia ottica però le sezioni sono molto più sottili: 80-100 nm. Si utilizza sempre un microtomo (più precisamente un ultramicrotomo) dove la lama non è di metallo ma di vetro o di diamante (usato soprattutto per le fettine più “preziose”). Le fettine, invece di essere raccolte sul ripiano di acciaio e distese, galleggiano sull’acqua. Le fettine vengono poi prelevate non con un pennello, ma con una bacchetta di vetro che è stata messa sul fuoco per ammorbidirla e sopra alla quale è stesso messo un ciglio. Grazie al ciglio (e sfruttando la tensione dell’acqua) si preleva la fettina e la si deposita sul retino di rame → in realtà non si prende solo una fettina ma un “treno di fettine”. Il retino si lascia asciugare e poi, dopo la colorazione, è pronto per l’osservazione.

Come viene fatta la colorazione?

La colorazione è una contrastazione che viene fa