Determinazione struttura delle proteine (NMR, cristallografia, microscopia elettronica)

Generatori ad anodo rotante e sincrotroni

Si possono usare generatori ad anodo rotante con un filamento che genera un fascio di elettrodi che colpisce un anodo rotante di rame, ossia un oggetto continuamente posto in rotazione, che genera un fascio di raggi X con una lunghezza d'onda che dipende dal tipo di metallo con cui è composto l'anodo rotante. Questo sistema ora è poco usato ed è stato soppiantato dai sincrotroni, delle strutture che si trovano in giro per l'Europa e che sono degli acceleratori di particelle: gli elettroni vengono accelerati lungo una traiettoria circolare e sulla tangente di questa traiettoria si genera il fascio di raggi X. Queste strutture sono usate per diversi scopi, non solo la cristallografia a raggi X.

I vantaggi di usare il sincrotrone (anche se più scomodo) sono:

• migliaia di volte più potente: minore la lunghezza d'onda, maggiore l'energia. Comunque ci sono una serie di altri parametri di tipo fisico che determinano la potenza del sincrotrone.

fascio di raggi X.- più collimato- varie lunghezze d’onda (“tunable”) 23/05/19

Montaggio del cristallo

Il cristallo viene montando di fronte ai raggi X in diversi modi:

• In un capillare di vetro a temperatura ambiente. Il cristallo viene prelevato con una pipetta abbastanza grande assieme al liquido in cui è cresciuto per metterlo in un capillare sigillato a una estremità; con un pezzo di carta assorbente si cerca di rimuovere la maggioranza del liquido (per evitare che continui a muoversi), facendo attenzione a lasciare un velo di solvente per evitare che il cristallo si disidrati. Si sigilla anche l’altra estremità del capillare e si monta sulla testina goniometrica. È un sistema molto laborioso e avviene a T ambiente (non sempre compatibile) e per questo non più molto usato a meno che proprio non si voglia fare una determinazione a T ambiente.
• In Cryoloop. Si lavora a condizioni di concentramento in azoto liquido (100 K),

In cui si utilizza un loop, ovvero un filo di nylon piegato a formare un'ansa che viene usata per pescare il cristallo (per tensione superficiale una piccola parte di liquido rimane bloccata nell'ansa, proprio perché quest'ultima è molto piccola). Il filo viene poi infilato in una bacchetta di ferro, a sua volta fissata a una base. È conservato in una beamline, in cui è spanso azoto liquido e di fatto il cristallo viene congelato, in modo da essere protetto dall'aria e anche dal fascio di raggi X (che lo danneggiano a causa della loro elevata energia).

In entrambi i casi, il cristallo viene messo su un supporto detto testina goniometrica, che è in grado di reggere il cristallo e di ruotarlo di 360° in maniera molto precisa. Questa possibilità di ruotare il cristallo è fondamentale perché la produzione di raggi difratti da parte del cristallo cambia nel momento in cui il cristallo ruota, nel senso che il pattern di...

La diffrazione che si ottiene è diversa a seconda dell'orientamento del cristallo. La diffrazione dei raggi X da parte di un cristallo dà origine ad un pattern matematicamente correlato al pattern del reticolo cristallino; tuttavia, il pattern di diffrazione è bidimensionale ma il pattern del reticolo cristallino è tridimensionale. Per ottenere info 3D da un pattern 2D, bisogna quindi ruotare il cristallo così da variare il pattern di diffrazione perché i raggi difratti che si generano in un'orientazione sono diversi da quelli che si generano in un'altra orientazione (idealmente per 360°). La raccolta dati di raggi difratti è un esperimento che si compone di più dati. Se metto insieme tutti questi dati si ottiene un reticolo reciproco (reticolo di spot) costituito ai punti dei raggi difratti che sono matematicamente correlati al reticolo reale. Si potrebbe tenere attivo il detector nel mentre si fa ruotare il detector.

di un nuovo pattern di diffrazione. Questo permette di ottenere un maggior numero di dati in un tempo più breve. Software di analisi Una volta acquisiti i dati, è necessario utilizzare un software di analisi per elaborarli e ottenere la struttura tridimensionale della proteina. Questo software utilizza algoritmi complessi per determinare la posizione degli atomi nella struttura e per risolvere eventuali problemi di sovrapposizione degli spot. Risultati Una volta completata l'analisi, si ottiene la struttura tridimensionale della proteina. Questa informazione è fondamentale per comprendere il funzionamento della proteina e per sviluppare nuovi farmaci e terapie. Conclusioni La cristallografia a raggi X è una tecnica potente e versatile per determinare la struttura tridimensionale delle proteine. Grazie ai continui progressi nella tecnologia dei detector e dei software di analisi, è possibile ottenere risultati sempre più precisi e dettagliati.

La qualità degli spot comunque non è dovuta solo alla qualità del detector ma anche alla qualità del cristallo; se il cristallo diffrange bene ottengo spot molto vicini ma ben distinti, ma questo non sempre accade.

Nelle immagini c'è un cerchio bianco che corrisponde al beam stop, cioè qualcosa che sta tra il cristallo e il detector e stoppa il fascio dei raggi incidenti. Questo serve perché solo una piccola parte del fascio (beam) interagisce con il cristallo e viene diffratto mentre la maggior parte passa oltre il cristallo immodificata; quindi se non ho il beam stop, quei raggi immodificati vanno a bruciare il detector perché il raggio è molto collimato e potente e quei raggi non sono stati diffratti (l'energia associata ai raggi diffratti è molto minore).

Si perde magari qualche spot centrale ma successiva con un'angolazione diversa. In questo modo raccogliere i dataset è molto più semplice.

sulla totalità degli spot è trascurabile.

Teoria della diffrazione

La dimostrazione matematica della teoria della diffrazione risale a circa un centinaio di anni fa: 1912 scoperta del fenomeno di diffrazione dei raggi X da parte dei cristalli (nobel nel 1912 per Max von Laue).

Il fenomeno della diffrazione è stato poi studiato ulteriormente da Bragg (padre e figlio) che scoprono il fatto che il fenomeno della diffrazione dei raggi X può essere spiegato con un modello teorico e matematico se si considera il cristallo nella sua valenza chimica di array periodico come una serie di piani paralleli che si comportano come degli specchi che riflettono i raggi X. Quindi, è stato definito il concetto di piani reticolari, ossia piani che tagliano il reticolo cristallino.

Ad esempio, nell'immagine ciascuna unità di cella contiene 4 molecole (verde, viola, bianco, giallo); si possono immaginare una serie (famiglia) di piani paralleli tra loro che mette in

relazione gli atomi verdi, un'altra famiglia di bianchi per gli atomi gialli (paralleli tra loro ma con diversa orientazione rispetto alla prima famiglia) ecc. Ci possono essere famiglie di piani diversi che mettono in relazione gli stessi atomi.

In un array periodico di atomi, quindi, il cristallo può essere descritto come un insieme di famiglie di piani paralleli tra loro che mettono in relazione atomi equivalenti nelle varie unità di cella. Essendoci migliaia di atomi, in un cristallo di proteina si possono identificare migliaia di piani reticolari.

Per questo motivo, più che di raggi difratti si parla di raggi riflessi (riflections) in quando il fenomeno di diffrazione non è altro che una riflessione dei raggi su queste famiglie di atomi! Ad ogni orientazione assunta dal cristallo, si possono avere famiglie di piani diversi e quindi fenomeni di riflessione diversi per cui gli spot del pattern di diffrazione sono diversi.

Quindi, rimane da capire come

interpretando gli spot (raggi riflessi che dipendono da famiglie di piani che esistono in virtù della struttura) per interpretare la struttura. Per fare ciò è importante definire gli indici di Miller (h, k, l) che rapportano l'unità di cella ai piani reticolari. Il piano reticolare di una famiglia taglia l'unità di cella in tre punti (a', b' e c'). Da qui ricavo i tre indici che sono tutti numeri interi e assumono valori inferiori a 6 per la maggior parte dei cristalli (in quanto a', b', c' non possono avere qualsiasi valore). La terna h, k, l definisce ciascun riflesso in quanto la riflessione dovuta a ciascuna famiglia di piani determina uno spot sul pattern di diffrazione. Per avere diffrazione da parte di un cristallo, però, è necessario che i piani reticolari taglino i lati dell'unità di cella per un numero intero di volte. In questo caso, l è sempre zero perché sto

Considerando un reticolo bidimensionale. Il cristallo di una piccola molecola ha meno atomi, quindi il numero di famiglie di piani è minore e dunque è minore il numero di spot che osservo, mentre per una proteina, poiché si hanno molti atomi, si hanno molto più spot.

Il fatto che per avere diffrazione, i piani reticolari devono tagliare la cella per un numero di volte, spiega anche il perché onde in fase danno un segnale più intenso proprio perché differiscono di un multiplo intero della lunghezza d'onda.

Tutto questo porta alla legge di Bragg su cui si basa tutta la cristallografia a raggi X: si ha interferenza costruttiva tra i raggi riflessi dai due piani quando i loro percorsi differiscono per un multiplo intero della lunghezza d'onda.

Dimostrazione: il fenomeno di diffrazione non è altro che un fenomeno di riflessione su famiglie di piani reticolari; in ogni famiglia tutti i piani sono paralleli e alla stessa distanza (d).

reticolari. La legge di Bragg permette di determinare l'angolo di diffrazione dei raggi X in base alla distanza tra i piani reticolari e la lunghezza d'onda dei raggi X utilizzati. Per portare in riflessione tutte le famiglie di piani reticolari è necessario ruotare il cristallo. È anche possibile spostare la sorgente dei raggi X, ma la prima opzione è più comoda. Tuttavia, la legge di Bragg non è ancora l'algoritmo matematico per analizzare gli spot del pattern di diffrazione. La distribuzione periodica delle molecole può essere descritta come una serie di piani reticolari e la diffrazione è descritta come un insieme di raggi riflessi dalle diverse famiglie di piani reticolari.alla posizione degli spot nel reticolo cristallino. Questa relazione è descritta dalla formula di Bragg: nλ = 2d sin(θ) Dove: - n è l'ordine del picco di diffrazione - λ è la lunghezza d'onda della radiazione incidente - d è la distanza tra i piani del reticolo cristallino - θ è l'angolo di incidenza della radiazione Utilizzando questa formula, è possibile determinare la distanza tra i piani del reticolo cristallino conoscendo l'ordine del picco di diffrazione, la lunghezza d'onda della radiazione incidente e l'angolo di incidenza. Inoltre, è possibile determinare l'angolo di incidenza conoscendo la distanza tra i piani del reticolo cristallino, l'ordine del picco di diffrazione e la lunghezza d'onda della radiazione incidente. Il reticolo reciproco è un concetto fondamentale nella diffrazione dei raggi X e nella cristallografia. Rappresenta una rappresentazione spaziale dei vettori di diffrazione associati ai piani del reticolo cristallino. I punti del reticolo reciproco corrispondono alla posizione degli spot sul detector nella diffrazione dei raggi X. La distanza tra i punti nel reticolo reciproco è inversamente proporzionale alla distanza tra i piani del reticolo cristallino. In altre parole, se i piani del reticolo cristallino sono più vicini tra loro, i punti nel reticolo reciproco saranno più distanti l'uno dall'altro e viceversa. La conoscenza della relazione tra la posizione degli spot e il reticolo cristallino è fondamentale per l'interpretazione dei dati di diffrazione dei raggi X e per determinare la struttura cristallina di un materiale.