Determinazione struttura delle proteine (NMR, cristallografia, microscopia elettronica)

Metodi di determinazione delle strutture proteiche

Risonanza magnetica nucleare (NMR)

Così come per la cristallografia, questa tecnica è stata sviluppata inizialmente per le piccole molecole e poi è stata traslata anche per lo studio della struttura della proteina. Per struttura si intende come sono disposti gli atomi in termini di distanze ed angoli di legame; pertanto, determinare la struttura significa creare un modello che, basandosi su dati sperimentali, si avvicina il più possibile alla realtà.

È una tecnica analitica che permette di ottenere informazioni sulla struttura di una molecola, misurando l’assorbimento di radiazione elettromagnetica (in particolare nel campo delle radiofrequenze) da parte del campione immerso in un forte campo magnetico. Questa proprietà è normalmente presente in questi atomi ma viene esaltata dal campo elettromagnetico forte.

Infatti, alcuni atomi hanno determinate proprietà quando si trovano in questa situazione, ossia sono in grado di assorbire energia. Andando quindi a sondare tutto il campo delle radiofrequenze, si misura l’energia assorbita e si può ottenere uno spettro:

Questo è importante perché si è scoperto che, anche a parità di composizione in atomi, lo spettro è diverso perché dipende dalla struttura in quanto l’assorbimento di radiazione elettromagnetica è influenzata dalla vicinanza tra particolari atomi. È importante quindi capire come interpretare questo spettro.

Esempio di piccole molecole: etanolo

Si osservano diversi picchi a diversi valori di frequenza per gruppi diversi della molecola in quanto parti diverse della molecola risuonano a valori diversi. Ogni picco, inoltre, è splittato e ha una forma diversa: queste costituiscono informazioni ulteriori che permettono di determinare una struttura.

Gli spettri monodimensionali, però, per le proteine sono piuttosto incomprensibili perché ci sono molti picchi tra loro sovrapposti (data la notevole quantità di atomi presenti). L’unica cosa che sono riusciti a fare su uno spettro monodimensionale è stata quella di valutare a cosa corrispondesse ciascun gruppo di picchi. Quindi, si è andati a scomporre lo spettro in due dimensioni, ossia su due assi frequenza, in modo da risolvere picchi sovrapposti. In questo caso si parla di NMR bidimensionale.

La proprietà di assorbimento delle radiofrequenze di alcuni atomi su cui si basa la tecnica NMR è riconducile ai nuclei dell’atomo che hanno una composizione in neutroni e protoni e proprio in virtù di questa composizione, può dare o no uno spettro NMR. Alla fine, quello che si ottiene sono quindi una serie di valori di distanze internucleari. Questi valori sono poi elaborati attraverso un computer che come output dà una famiglia di strutture che è altamente probabile essere quella reale. Tutto questo avviene attraverso una simulazione (che comunque si basa sui dati sperimentali di distanze ed angolazioni di legame più vincoli geometrici dovuti al fatto che la struttura è quella di una proteina -> il software ricerca possibili strutture compatibili a questi fattori) e quindi quello che si ottiene è un insieme di strutture probabilistiche, generalmente sovrapponibili perché molto simili (se l’esperimento è stato condotto correttamente e la proteina ha una struttura omogenea).

Vantaggi dell'NMR

I punti in cui le diverse strutture di una stessa molecola differiscono maggiormente sono il C, l’N terminale e altre regioni di maggiore variabilità e flessibilità. Oltre che essere uno svantaggio perché non si ottiene una struttura unica ma un insieme di strutture, questo è anche un vantaggio dell’NMR rispetto alla cristallografia perché permette di trovare zone mobili perché proprio la loro funzione e associata a questa flessibilità (ad esempio, loop che si apre e si chiude); in cristallografia, invece, queste porzioni non sono visibili perché è necessaria una struttura fissa e cristallizzata affinché la tecnica funzioni. L’NMR quindi dà anche informazioni di tipo dinamico.

Il momento magnetico di spin

Si basa sul fatto che i nuclei degli atomi sono caratterizzati da una proprietà che è il momento magnetico di spin, dovuto al fatto che i nuclei degli atomi si comportano come dei dipoli. I nuclei sono infatti costituiti da protoni e neutroni e hanno una carica positiva, ma, a seconda del numero di protoni e neutroni, in alcuni nuclei si crea una certa polarità generando un dipolo magnetico che fa sì che se il nucleo viene posto in un campo magnetico, questo si allinea in un certo modo.

Lo spin è una proprietà fondamentale della materia e una grandezza quantizzata (si manifesta in multipli) e può essere + o -. Se il numero di protoni è pari ed è uguale al numero di neutroni (come negli isotopi naturali di carbonio e ossigeno), non si ha nessun segnale NMR perché i (spin) = 0. Se il numero di protoni è diverso da quello di neutroni e la loro somma è dispari, il nucleo non è neutro da un punto di vista magnetico (i=1/2) e quindi dà un segnale NMR. È il caso del protone (¹H -> atomo su cui si basa maggiormente la tecnica NMR) perché ha un solo protone e nessun neutrone; la stessa cosa accede anche a altri atomi che però non si trovano normalmente nelle molecole (come ¹³C, ³¹P, ¹⁹F -> usati nelle marcature).

Infine, se il numero di protoni più il numero di neutroni dà un numero pari e sono uguali in numero (numero dispari), si ha un segnale NMR perché i =1. Questo accade con ¹⁴N e ²H.

Con il termine μ si indica il vettore momento magnetico che fa sì che il nucleo di un atomo dotato di spin si comporti come un magnete, nel senso che si allinea in maniera parallela o antiparallela (alcuni nuclei in un modo e altri in un altro) al campo magnetico (B₀) in cui sono immersi e la situazione cambia nel tempo. La situazione quindi non è costante ma si ha un continuo cambiamento della polarità secondo un moto di precessione che corrisponde ad una variazione di energia:

• C’è uno stato a minore energia dove lo spin è parallelo al campo magnetico esterno. (spin = - 1/2)
• C’è uno stato a maggiore energia dove lo spin è antiparallelo rispetto al campo magnetico esterno. (spin = + 1/2)

Se si aumenta l’intensità del campo magnetico in cui i nuclei sono immersi, aumenta il gap di energia tra i nuclei posti in maniera antiparallela e parallela rispetto al campo magnetico stesso.

Applicazione pratica dell'NMR

L’NMR implica la necessità di usare un grosso magnete che applichi un grosso campo magnetico in un punto della macchina in cui viene inserito il campione perché così si aumenta notevolmente la disparità energetica tra di due stati di spin. Quando il nucleo si posiziona all’interno del campo magnetico, si posiziona in maniera definita ed è quindi possibile definire un angolo teta tra il vettore di spin e il vettore che indica il campo magnetico. Il nucleo posto nel campo magnetico comincia a ruotare intorno al vettore campo magnetico in un moto definito moto di precessione con una frequenza definita frequenza di Larmor (ω).

E = μ*B₀*sen(teta) se è posto in maniera parallela (stato a maggiore energia)

E = - μ*B₀*sen(teta) se è posto in maniera antiparallela (stato a minore energia)

DeltaE = μ*B₀*sen(teta) – (- μ*B₀*sen(teta)) = 2 μ*B₀*sen(teta)

Poiché E = h*ν -> v = 2μB₀sen(teta) / h dove h = costante di Plank

Se al campione immerso in un campione magnetico i cui nuclei dotati di spin acquistano energia in modo da posizionarsi in maniera antiparallela o parallela al campo magnetico con una certa energia, io posso variare lo stato di spin fornendo energia nell’ambito delle radiofrequenze che è assorbita dai nuclei dotati di spin e provoca lo stato di transizione del nucleo dallo stato di spin a bassa energia a quello ad alta energia. La frequenza è pari all’equazione riportata sopra (ν).

Condizioni di risonanza

Queste condizioni sono definite condizioni di risonanza. Quando si verificano, si ha la transizione da uno spin all’altro. Queste condizioni di risonanza prevedono che la radiofrequenza (determinata dall’equazione precedente) che è stata fornita sia uguale alla frequenza di Larmor con cui quel nucleo effettua il moto di precessione.

Queste condizioni dipendono sia dal tipo di nucleo sia dal suo intorno chimico e quindi dalla misura della frequenza si possono ricavare informazioni sulla struttura della molecola a cui appartiene. Ad esempio, nel metanolo i tre protoni legati al carbonio sono identici e quindi si visualizzerà un picco unico per questi tre, ma le condizioni di risonanza del protone legato all’ossigeno è differente e quindi si osserverà un picco diverso.

Questo è dovuto al fenomeno del chemical shielding, nel senso che il campo magnetico effettivo che ogni nucleo dotato di spin sente non è B₀ (campo magnetico applicato) ma B_eff = B₀(1-σ) dove σ è la costante di schermo. Questo fenomeno è dovuto al fatto che ogni nucleo dotato di spin risente di una costante di schermo che dipende da tutti gli atomi dotati di spin presenti nella molecola che appunto schermano parte di B₀ e dunque per ciascun nucleo a cui è applicato un campo magnetico, la radiofrequenza in cui si verificano le condizioni di risonanza dipende dall’intorno chimico del nucleo (sia per legame chimico per vicinanza spaziale).

Apparato sperimentale

Prevede un potente magnete che generi B₀ elevato; il fenomeno avviene lo stesso anche se il campo magnetico è più limitato ma l’energia rilasciata che dipende dalla transizione da uno spin all’altro è bassa e quindi non si riuscirebbe a misurare (la strumentazione non è abbastanza sensibile). Quindi è meglio aumentare la differenza di energia tra i due stati in modo che quando avviene la transizione, l’energia che il campione emette sia più elevata e quindi più facilmente rilevabile. È necessario poi un generatore di radio-onde.

Il campione è inoltre circondato da un filo metallico che permette di misurare l’energia rilasciata; quando si verificano le condizioni di risonanza per un certo pool di nuclei, nel filo metallico viene indotta una corrente elettrica per via dell’energia rilasciata e questa corrente può essere misurata -> si osserva un picco nello spettro NMR. A partire dai picchi, si risale alla struttura della molecola.

Attualmente, l’NMR per le piccole molecole non è utilizzata tanto per scoprire la struttura di una molecola ma più che altro per capire quale molecola è presente nel campione confrontando il picco ottenuto con un database di picchi NMR.

Vettore di magnetizzazione totale

Per derivare i protocolli e gli algoritmi per analizzare un campione, si è definito anche il concetto di vettore magnetizzazione totale. Quello che andiamo a misurare è un picco che deriva da un pacchetto di spin, perché si hanno diversi tipi di nuclei facenti parte della molecola di interesse. Per pacchetto di spin si intende un gruppo di nuclei dotati di spin (generalmente protoni) che sentono lo stesso campo magnetico, ossia sentono tutti un valore di campo magnetico effettivo uguale; questi nuclei non sono necessariamente equivalenti (ossia appartenenti allo stesso gruppo chimico). Il vettore di magnetizzazione totale è riconducibile al vettore di spin ma fa riferimento ad un gruppo di nuclei accumunati dal fatto di sentire lo stesso campo magnetico effettivo perché stanno in un intorno chimico tale che la schermatura del campo magnetico esterno è uguale.

Quindi, quando si ha un gruppo di nuclei dotati di spin che vengono immersi in un campo magnetico, questi tendono ad allinearsi rispetto a B₀ in maniera parallela o antiparallela e il vettore di magnetizzazione totale (mz) è la somma di tutti i vettori che descrivono ciascun nucleo, tenendo conto del segno del vettore (+ o -).

Applicando una radiofrequenza, quando si verificano le condizioni di risonanza, si ha che il vettore di magnetizzazione totale che era sull’asse z viene flesso sull’asse x/y, ossia il suo moto di precessione totale effettuato intorno all’asse del campo magnetico esterno (asse z) si flette sul piano x, y effettuando un moto circolare su quel piano con una frequenza pari alla frequenza di Larmor (quella del moto di precessione) -> eccitamento del nucleo; la transizione tra due livelli energetici dei nuclei è definita risonanza.

Ad un certo punto, quando la radiofrequenza viene interrotta, si ha un fenomeno definito rilassamento per cui il vettore di magnetizzazione totale ritorna sul suo asse z (la componente trasversale torna a zero e quella longitudinale al valore di partenza), rilasciando energia.

Essendo che ci sono pacchetti di nuclei, quello che si ottiene è un fenomeno massivo, non posso scomporre il gruppo nei singoli atomi.

Rilassamento

Il concetto di rilassamento, definito come FID (free induction decay), è importante perché quando io faccio la rilevazione, osservo un picco di energia che poi diminuisce nel tempo perché l’energia emessa si disperde nel tempo perché la radiofrequenza che determina la transizione di spin viene interrotta. Questo decadimento corrisponde al fenomeno del rilassamento.

Questa misura è quella che viene effettuata nella pratica, ossia la rilevazione di un massimo di energia che poi diminuisce nel tempo (energia in funzione nel tempo); nello spettro NMR, invece, si ha un grafico che pone la frequenza in relazione all’intensità. Questo è reso possibile da un’equazione definita trasformata di Fourier, ossia una formula matematica che aiuta l’elaborazione i dati sperimentali ottenuti; permette di ricombinare una serie infinita di funzioni seno/coseno in un insieme discreto di valori (e viceversa, cioè scomporre un segnale in una somma di sinusoidi). Questo vuol dire che quando accendo l’emettitore di radiofrequenza, vengono passate le diverse radiofrequenze, una delle quali determinerà la transizione di un certo pacchetto di spin: ad una certa radiofrequenza, subisce la transizione un certo pacchetto di spin, ad un’altra, un altro pacchetto e così via. Si ottengono quindi diverse funzioni seno/coseno relative al rapporto tra tempo ed energia che è appunto una funzione periodica. Queste funzioni devono essere convertite in un singolo picco per ottenere un profilo dell’energia rilasciata dal campione in funzione della frequenza -> nello spettro NMR per ogni FID avremo un picco.

Chemical shift

Il range delle radiofrequenze non è molto ampio e a piccole variazioni di frequenza, risuonano pacchi di spin diversi. Questo rende difficile la misura accurata della frequenza. Inoltre, si vuole standardizzare le diverse misurazioni fatte in posti differenti. Dunque, per misurare accuratamente la frequenza e standardizzare le misure, nel campione viene incluso un composto di riferimento (oltre al campione da analizzare) a cui è associato un certo spettro NMR (distinto rispetto alla maggioranza delle molecole che si analizzano). Quello che si plotta non è la frequenza alla quale avviene il FID, ma si misura il chemical shift (o spostamento chimico) ossia uno spostamento della frequenza dei picchi che si osservano rispetto alla frequenza di quelli di riferimento (non si osserva la frequenza vera e propria a cui i gruppi di nuclei della molecola di interesse risuonano).

Un composto di riferimento molto usato è il tetrametilsilano, ossia un composto con nuclei dotati di spin contenente pacchi di 3 protoni. Questa molecola è stata scelta perché, essendo il silicio meno elettronegativo del carbonio, i protoni sono molto schermati e il suo segnale NMR è molto basso (ma non assente); quindi possono rappresentare il punto di partenza (0) indicato sulla destra dello spettro -> le frequenze osservate per la molecola in analisi sono sempre rapportati ai valori della molecola di riferimento. I picchi non sono considerati in maniera assoluta.

I gruppi elettronegativi aumentano il chemical shift del nucleo a cui sono legati, mentre i gruppi elettropositivi diminuiscono il chemical shift del nucleo a cui sono legati. Le tabelle dei chemical shift contengono diverse molecole (tutte con un protone) associate al loro spostamento chimico in base al gruppo in cui il protone è inserito. Queste tabelle derivano dal fatto che sono stati analizzati dei campioni noti e quindi si è scoperto che un certo gruppo chimico dà un certo valore di chemical shift. Esistono anche tabelle per il carbonio 13 in cui sono stabiliti i valori di chemical shift relativo a ciascun gruppo chimico.

Picchi splittati

Esempio spettro etanolo: Lo spettro dell’etanolo ha tre picchi corrispondenti a tre pacchetti di spin: i protoni di CH₃, i protoni di CH₂ e i protoni di OH. I picchi che si osservano sono splittati e alcuni sono più alti di altri. Questo dipende dall’accoppiamento di spin, ossia il fenomeno che genera lo splitting dei picchi. Questo fenomeno dipende dal fatto che, considerando la molecola dell’etanolo, si hanno tre protoni equivalenti che costituiscono un pacchetto, altri due che ne formano un altro e il terzo pacchetto è invece formato da un solo protone. Quindi i pacchetti di spin non sono equivalenti tra di loro perché sono formati da un numero diverso di nuclei e hanno un diverso intorno chimico ma i nuclei di uno stesso pacchetto di spin sono equivalenti tra loro.

Se ci sono due nuclei o gruppi di nuclei non equivalenti vicini (separati da un numero di legami covalenti non superiore a 3), si verifica una situazione in cui il campo magnetico effettivo sentito dai nuclei è alterato da questa vicinanza.