3. Metodi sperimentali per la determinazione della struttura proteica

Metodi sperimentali per la determinazione della struttura proteica

Ci sono tre principali metodi che permettono di determinare sperimentalmente la struttura di una determinata proteina. Tra questi si annoverano la diffrazione a raggi X, la microscopia elettronica, e la risonanza magnetica nucleare (NMR).

A raggi X - Diffrazione

Lo schema sperimentale di questa tecnica prevede che un fascio di raggi X colpisca un cristallo, il quale devia questi raggi in più direzioni (fenomeno detto diffrazione o scattering) e questi raggi deviati vengono registrati ed elaborati fino a formare uno spettro di diffrazione. La sorgente di raggi X è tenuta fissa mentre campione e detector ruotano (schema Bragg-Mentano).

Questo schema potrebbe sembrare molto simile a quello di un microscopio. Tuttavia, in quest’ultimo caso il fascio di luce (e non di raggi X) viene focalizzato da una lente per ricreare l’immagine ingrandita. Nel caso della diffrazione non esistono lenti che permettono di focalizzare raggi X. Pertanto lo spettro di diffrazione viene elaborato attraverso l’impiego di software fino ad ottenere una mappa delle densità elettroniche, ovvero una mappa che indica dove sono posizionati i vari elettroni. Bisogna precisare che con la diffrazione non si vedono gli idrogeni perché la loro densità elettronica è molto bassa.

L’oggetto che viene colpito dal fascio di raggi X e che determina il fenomeno della diffrazione è un cristallo. Per definizione un cristallo è un sistema periodico, composto, cioè, da atomi equidistanti e paralleli. La distanza tra un atomo ed un altro dello stesso cristallo è dell’ordine di 1 Å, similmente alla lunghezza d’onda dei raggi X. Quindi, in un cristallo ci sono tante piccole fenditure che hanno dimensioni paragonabili a quelle dei raggi X. Per questo motivo quando un raggio X attraversa una fenditura del cristallo, esso viene diffratto in tante direzioni.

I solidi cristallini sono caratterizzati da una geometria ripetitiva che si estende nello spazio tridimensionale. Esiste un motivo nel cristallo che si ripete indefinitivamente per traslazione semplice nelle tre dimensioni. Si può individuare nel motivo che si ripete, costituito da ioni e atomi, una porzione di spazio che contiene tale motivo: questa è la cella elementare del cristallo (cioè la porzione di spazio con il più piccolo volume che contiene il motivo strutturale che si ripete). Il cristallo deve avere dimensioni tali da poter essere colpito dal fascio di raggi X, quindi deve essere più grande del fascio stesso.

I cristalli si ottengono mediante procedure di cristallizzazione. La cristallizzazione sfrutta il fatto che la solubilità di un soluto in un determinato solvente risulta maggiore a caldo che non a freddo. La cristallizzazione prevede diverse fasi:

• Nella prima si scioglie a caldo e nella minima quantità di solvente il soluto impuro.
• Nella seconda fase vengono filtrate le impurità insolubili.
• Nella terza fase si lascia raffreddare lentamente la soluzione in modo che il soluto si separa sotto forma di cristalli mentre le impurità solubili rimangono nella soluzione.

Dall’ultima fase di questa tecnica, come detto, si ricava una mappa delle densità elettroniche. In base a questa mappa bisogna capire come posizionare gli aminoacidi. La mappa di densità elettronica deve essere immaginata come se fosse il guscio della proteina. L’operatore prende la sua sequenza, la inserisce nel guscio in modo da riempire perfettamente il guscio. Si ottiene, così, la struttura.