Cromatografia

CROMATOGRAFIA

1-Principi generali e introduzione

La cromatografia è fondamentalmente una tecnica che consente di separare sostanze chimiche fra loro

diverse inizialmente in miscela, o meglio in soluzione, restituendole singolarmente nel tempo e, come

implicito nel concetto stesso di “separazione”, isolandole anche nello spazio.

Il chimico Cvet (Tswett) lavorò proprio su un estratto di origine vegetale, dal quale riuscì ad isolare la

clorofilla in forma pura. Per realizzare questa separazione utilizzò una colonna in vetro (quindi trasparente)

riempita da una fase stazionaria costituita da minuscoli granuli di argilla, e come fase mobile una sostanza

altamente apolare, l’etere di petrolio, che scioglie bene tutti i pigmenti estratti dalla pianta e non intacca

l’argilla stessa. Dopo aver introdotto il campione di estratto nella parte sommitale (come si sul dire “in

testa”) della colonna, iniziò ad aggiungere gradualmente etere di petrolio, notando così, grazie alla

trasparenza del vetro, come man mano che questo liquido scendeva attraverso l’argilla, il campione di

estratto vegetale scendeva e si muoveva anch’esso dall’alto al basso all’interno della colonna, seppur con

un certo ritardo rispetto all’etere di petrolio. In particolare, notò che nel corso del tempo esso si

differenziava in bande, ovvero in strati colorati differenti che, scendendo a velocità differente, si

separavano sempre di più nella colonna. Da questa sorta di disegno costituito da strati di colore separati e

disposti l’uno sotto l’altro, prese inizialmente origine il riferimento alla scrittura contenuto nella parola

“cromatografia”.

Quello che caratterizza il complesso delle tecniche cromatografiche è però relativo alla modalità secondo la

quale questa separazione è effettuata. Tutte le tecniche cromatografiche si basano sulla capacità delle

singole specie chimiche contenute nella miscela di ripartirsi in modo differente tra una fase detta

“stazionaria”, ovvero una sostanza chimica che possiamo considerare virtualmente immobile, ed un media

di trasporto differente, costituito da un’altra sostanza chimica che si muove rispetto alla prima ed è

pertanto detta “fase mobile”.

Una sostanza chimica in grande quantità, allo stato solido oppure liquido ma in qualche modo ferma,

legata, stazionaria appunto, ed una quantità altrettanto grande di un’altra sostanza chimica, quest’ultima

necessariamente fluida (liquida o gassosa) che vi passa sopra, o vi scorre attraverso. Le sostanze da

separare, introdotte invece sempre in piccola quantità, devono potersi sciogliere completamente nella fase

mobile e devono inoltre avere la capacità di interagire in qualche modo, secondo un qualsiasi principio

chimico o chimico-fisico, con la fase stazionaria.

Se immaginiamo di organizzare tutto questo come un tubo, possiamo riempire questo tubo con dei granelli

regolari, magari delle minuscole sferette, di un materiale solido (la fase stazionaria) e far passare attraverso

di esso un liquido (la fase mobile), per caduta o pompandolo attivamente. Introducendo la miscela di

sostanze da separare nel punto di ingresso della fase mobile, se un componente chimico della miscela non

mostra alcun tipo di interazione con la fase stazionaria uscirà alla stessa velocità della fase mobile nella

quale invece si scioglie molto bene; al contrario, se dovesse interagire in modo fortissimo, praticamente

irreversibile, con la fase stazionaria si fisserebbe irrimediabilmente su questa e non uscirebbe più dal tubo.

Nel corso del tempo, man mano che la fase mobile fluisce, si assisterà pertanto ad un passaggio continuo e

ripetuto delle singole sostanze della miscela dalla fase mobile a quella stazionaria e viceversa: più una

sostanza tenderà ad interagire con la fase stazionaria più passerà del tempo legata a questa e tarderà la sua

uscita dal tubo insieme alla fase mobile, che nel frattempo continua a fluire regolarmente.

Quello che ne risulterà sul lungo periodo, magari nel corso dei minuti, sarà un ritardo differente nell’uscita

dal tubo delle sostanze che componevano la miscela introdotta, con il risultato di una separazione nel

tempo delle stesse sostanze in soluzione.

L’uscita di ogni sostanza occuperà un certo lasso di tempo entro il quale la concentrazione della stessa

sostanza salirà velocemente fino ad un massimo, per poi scemare in modo altrettanto veloce, descrivendo

rispetto alla coordinata del tempo una curva di concentrazione simile ad una gaussiana.

Il tempo impiegato da ciascun componente della miscela impiegato per percorrere l’intero sistema, dal

momento della sua introduzione a quello della sua uscita, valutato sul massimo di questa gaussiana, prende

il nome di tempo di ritenzione.

2-Tipi di Cromatografia

3-Picco cromatografico

Consiste in una serie di picchi che rappresentano l'eluizione dei singoli analiti, separati dal processo

cromatografico. Oggi è generato il più delle volte da software dedicati, che raccolgono il segnale del

rivelatore e lo elaborano arrivando eventualmente a produrre anche il risultato dell'analisi cromatografica

in termini di composizione per confronto dei tempi di ritenzione o delle proprietà degli analiti relativi ai

singoli picchi.

Il successo di una separazione cromatografica è giudicato in base alla capacità del sistema di separare il

picco di ogni analita presente nel campione da ogni altro.

Con il procedere della separazione, le sostanze usciranno dalla colonna dopo il passaggio di un certo tempo

(tempo di ritenzione) durante il quale è fluito un certo volume di solvente (volume di ritenzione). Se si

misura la concentrazione delle sostanze in uscita dalla colonna si ottiene il cosiddetto cromatogramma (che

riporta le concentrazioni di sostanza in uscita in funzione del tempo o del volume di eluente).

Le grandezze fondamentali da tenere in considerazione sono:

• Tempo di ritenzione (t ): tempo necessario alla sostanza iniettata per essere eluita dall'inizio

R

all'uscita della colonna, cioè tempo dall’iniezione alla comparsa del secondo picco.

• Tempo morto (t ): tempo di ritenzione di un composto che non è trattenuto e che passa attraverso

M

la colonna alla stessa velocità con cui fluisce la fase mobile, cioè tempo dall’iniezione alla comparsa

del primo piccolo picco.

• ):

Tempo di ritenzione effettivo (′ è il tempo in cui effettivamente avviene l’eluizione dell’analita

= − )

ed è dato dalla differenza fra tempo di ritenzione e tempo morto (′

• ):

Volume morto ( piccola quantità di volume di fase mobile che esce vuota.

0

• ):

Volume di ritenzione ( volume di fase mobile totale dall’iniezione a quando esce con l’analita, è

dato dalla somma del volume morto più la fase mobile che contiene l’analita.

= + = (1 + ′)

Dove K e K’ sono rispettivamente la costante di ripartizione e il fattore di capacità, che vedremo a

breve.

• Fattore di ritenzione, detto anche Fattore di capacità (K') o Rapporto di distribuzione di massa

(D ): è un parametro che mette in relazione il tempo di ritenzione di un analita col tempo morto.

m

Indica cioè quanto tempo una sostanza è trattenuta da una colonna rispetto al tempo morto .

0

Nelle separazioni ideali è compreso fra 1 e 5, se è minore di 1 le sostanze da separare eluiranno a

tempi molto vicini e quindi sarà difficile distinguere i tempi di ritenzione, se è maggiore di 20-30

invece i tempi di ritenzione diventano eccessivamente lunghi.

′ −

0

′

= =

0 0

La differenza tra tempo di ritenzione e tempo morto, ed il tempo morto stesso sono direttamente

ricavabili dal cromatogramma. Il fattore di ritenzione (o di capacità) è determinato dal rapporto delle

quantità del componete nelle due fasi (stazionaria e mobile):

[]

′

= = =

[]

Qs: quantità del componente nella fase stazionaria

Qm: quantità del componente nella fase mobile

Kc: costante di distribuzione

Vs: volume della fase stazionaria

Vm: volume della fase mobile

Φ: caratteristico della colonna

•

=

Velocità di flusso (F): fattore che lega il tempo di ritenzione con il volume di ritenzione

4-Interazione fra fase mobile e fase fissa. Piatti teorici.

Per quanto riguarda i meccanismi di interazione tra le molecole da separare e le fasi mobile e stazionaria,

possono essere sfruttati un po’ tutti i meccanismi di natura chimica e chimico-fisica dei quali siamo a

conoscenza. La differenza di interazione fra le diverse molecole che compongono la miscela si realizza per

lo più nei confronti della fase stazionaria, mentre la fase mobile rappresenta di solito un mezzo di trasporto

passivo, nel quale le stesse molecole si sciolgono agevolmente e in modo concorrenziale rispetto alla stessa

fase stazionaria e che, essendo in movimento rispetto a quest’ultima, consente il deflusso delle stesse

sostanze al di fuori della colonna. Nel caso della gascromatografia, addirittura, la fase stazionaria è spesso

costituita da un gas inerte come l’elio: in un sistema del genere, anche grazie alle altissime temperature

utilizzate (spesso >350°C) le molecole da separare si muovono nella fase mobile sotto forma di vapore, e

sotto forma di vapore entrano in contatto con la fase stazionaria liquida legata, sciogliendosi in essa.

Tra i meccanismi di interazione possiamo avere una interazione polare, tramite la realizzazione di legami

idrogeno, una repulsione idrofobica, interazioni di Van der Waals, interazioni pi-greco/pi-greco tra anelli

aromatici presenti sulla fase stazionaria con analoghi anelli aromatici contenuti nella nostra sostanza,

scambio ionico (anionico e cationico), chelazione, esclusione dimensionale basata su proprietà steriche (in

primo luogo sul diametro medio della molecola in soluzione), ecc

In ogni caso quello che verrà a realizzarsi sarà una ripartizione tra la fase mobile e la fase stazionaria,

caratterizzata da una costante di ripartizione (K) del tutto analoga a quella che si riscontra nella ripartizione

di una specie chimica tra due fasi liquide fra loro immiscibili. In condizioni di equilibrio, questa costante non

dipende dalla quantità di partenza della sostanza o da quanto essa era inizialmente abbondante in una

delle due fasi, ma unicamente dalla natura chimica della terna costituita da fase mobile, fase stazionaria e

molecola da separare. Una volta fissate le prime due variabili, ovvero scelto il sistema cromatografico di

riferimento, la costante di ripartizione sarà funzione unicamente della natura chimica della molecola da

separare. In una miscela costituita anche da molti componenti, ciascuna specie chimica dovrebbe avere

almeno in linea di principio una costante di ripartizione differente, che si ripercuoterà sul suo diverso

fattore di ritardo nell’uscita dalla colonna. []ₛ

= []ₘ

K elevato indica una preferenza del componente da separare per la fase stazionaria, K basso invece per la

fase mobile.

Da qui il concetto di “piatto teorico”, cioè luogo in cui si instaura un equilibrio di ripartizione,

tradizionalmente utilizzato per quantificare comparativamente l’efficienza separativa anche delle colonne

cromatografiche: anche se in cromatografia una colonna è un continuo e non è di certo divisa in settori,

tantomeno in piatti, possiamo comunque immaginare che lo sia, sulla base delle performances separative

ottenibili su miscele standardizzate di sostanze.

Una colonna con un maggior numero di piatti teorici sarà maggiormente performante, in quanto riuscirà a

separare meglio sostanze anche molto simili tra loro, per struttura molecolare e quindi per proprietà

chimico-fisiche, rispetto ad una con un numero minore di piatti teorici. Allo stesso modo, a parità di

lunghezza complessiva della colonna cromatografica, sarà obiettivo del costruttore pervenire alla massima

riduzione possibile dell’altezza del piatto teorico, in modo tale da rendere maggiormente performante la

separazione nell’unità di spazio. Dal punto di vista della definizione, l’altezza del piatto teorico è la costante

di proporzionalità tra la varianza della banda (si ricordi l’approssimazione gaussiana del profilo di

concentrazione della sostanza in corso di separazione, rispetto al tempo) e la distanza che essa ha percorso

all’interno della colonna.

N= numero di piatti teorici

L=lunghezza della colonna

H=altezza di un piatto teorico

σ = deviazione standard del picco

σ ^2 =varianza, usata per esprimere l’efficienza della colonna in relazione ad H

=

2

=

Un altro modo per calcolare N è il seguente:

2

= 16( ) (1)

Dove W=ampiezza del picco

Se uso l’ampiezza a metà picco il parametro N risente meno dell’asimmetria del picco:

1/2

2

= 5,54( ) (2)

1

2

Il parametro di simmetria S è il rapporto dei segmenti a e b misurati al 10% dell’altezza h del picco,

l’asimmetria di un picco dipende da una variazione della costante di ripartizione K.

➢ Se 0,8 < S < 1,2 il picco è simmetrico e si usa l’equazione (1)

➢ Se 1,2 < S < 2 il picco è asimmetrico e si usa l’equazione (2)

➢ Se S>2 l’asimmetria del picco è inaccettabile

Tipi di asimmetria:

➢ Tailing: il picco ha una scodatura a destra dell’asse di simmetria cioè verso gli alti tempi di

ritenzione, quindi l’analita viene leggermente trattenuto alla fine dell’eluizione.

➢ Fronting: il picco ha una scodatura a sinistra

dell’asse di simmetria cioè verso bassi tempi di

ritenzione, quindi l’analita viene leggermente

trattenuto all’inizio dell’eluizione.

5-Equazione di Van Deemter

L’allargamento di una banda dipende dal tempo che il soluto trascorre nella colonna, maggiore è il

tempo di ritenzione maggiore è l’allargamento della banda. Con l’aumento di H diminuisce inoltre

l’efficienza di una colonna. I fattori che generano l’aumento di H sono:

1. Percorsi multipli: a causa dell’impaccamento irregolare e della disomogeneità delle

particelle di fase stazionaria si formano dei cammini diversi e quindi a parità di

lunghezza della colonna le molecole di una stessa specie seguono cammini diversi

giungendo infine al rilevatore distribuite nel tempo e generando quindi un

allargamento della banda e del picco. Si parla quindi di diffusione Eddy (o tortuosità

dei percorsi) che è riassunta nella seguente espressione:

= 2

Dove:

▪ λ è una costante legata all’irregolarità dell’impaccamento

▪ è il diametro delle particelle della fase stazionaria.

La diffusione Eddy dipende da questi due parametri ed è invece indipendente dalla

velocità lineare media di flusso della fase mobile.

2. Diffusione longitudinale: In una colonna cromatografica l’analita diffonde nella fase

mobile dalle zone centrali (più concentrate) a quelle periferiche (meno

concentrate). Maggiore è il tempo che il soluto resta nella colonna, maggiore è il

tempo che ha per diffondere, quindi più lento è il flusso maggiore sarà la

diffusione. Tale effetto è più importante nella GC infatti i gas diffondono

maggiormente dei liquidi. L’effetto è riassunto nell’espressione:

= 2

Dove:

▪ γ dipende dalla distribuzione delle particelle della fase stazionaria

▪ è il coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobile

▪ v la velocità media di flusso della fase mobile

3. Trasferimento di massa in fase mobile:

Quando il soluto passa attraverso la colonna si muove tra la f.m. e la f.s., questo

movimento tra le due fasi è detto trasferimento di massa. Quindi, se il movimento

del soluto attraverso la f.m. o la f.s. non avviene a velocità comparabili per

mantenere l'equilibrio di partizione tra le due fasi, il picco si allarga. Mediamente le

molecole si muovono più velocemente nella f.m. che nella f.s., quindi per ridurre

l'effetto di allargamento di picco dovuto al trasferimento di massa bisogna ridurre

la velocità della f.m. per consentire il mantenimento dell'equilibrio di partizione tra

le due fasi. In un canalicolo (percorso delimitato da particelle di fase stazionaria) le

particelle di analita che si trovano al centro percorrono una distanza maggiore di

quelle che si trovano ai bordi (vicino alle particelle di fase stazionaria) e quindi

arrivano al rivelatore in tempi diversi.

4. Trasferimento di massa in fase mobile stagnante: se la fase stazionaria è solida e

porosa le particelle restano intrappolate (ristagnano), passando meno tempo nella

fase mobile e percorrendo uno spazio minore lungo la colonna. L’effetto aumenta

all’aumentare della velocità di flusso.

Entrambi gli effetti 3 e 4 sono descritti dalla seguente equazione:

2

=

Dove:

▪ Ω dipende dal diametro della colonna

▪ gli altri parametri sono già stati definiti

5. Trasferimento di massa in fase stazionaria: è particolarmente importante nella

cromatografia di ripartizione, infatti in base all’interazione diversa tra le particelle

di analita e quelle di fase stazionaria (film li