Cromatografia

Attivazione della silice e utilizzo nella cromatografia

La silice tuttavia non può essere usata direttamente ma prima dev'essere attivata:

1. Si tratta con HCl 1M e si porta all'ebollizione per 10-20 ore in modo che i gruppi silossanici si idrolizzano per dare gruppi silanolici.
2. I gruppi silanolici ottenuti sono però legati a molecole d'acqua che bloccano i siti attivi quindi si fa essiccare in stufa a 300°C (se si supera questa temperatura si riformano i gruppi silossanici).
3. Si ottiene così la silice silanolizzata che viene usata sia nella cromatografia di adsorbimento sia come supporto in quella di ripartizione.

Tuttavia, non tutti i gruppi silanolici hanno la stessa attività:

• Quelli più schermati dalla struttura dei gruppi silossanici danno interazioni deboli.
• Quelli che hanno attività fortissima legano subito le molecole di soluto ma non consentono lo scambio con le molecole di solvente oppure rilascerebbero gli analiti troppo tardi provocando una codatura dei picchi.

fasi mobile e stazionaria. Queste isoterme possono essere lineari o non lineari, a seconda del tipo diadsorbente e della sostanza analizzata. In generale, le isoterme di adsorbimento sono utilizzate per studiarela selettività dell'adsorbente nei confronti di diverse sostanze e per determinare i parametri di equilibrio delsistema.La cromatografia di adsorbimento può essere utilizzata per diverse applicazioni, come l'analisi di miscelecomplesse, la separazione di composti chimici e la purificazione di sostanze. Questa tecnica è particolarmenteutilizzata in ambito farmaceutico, chimico e alimentare, ma trova applicazione anche in altri settori.La cromatografia di adsorbimento è una tecnica relativamente semplice ed economica, ma richiede un buonconoscenza delle proprietà dei diversi adsorbenti e delle condizioni di separazione ottimali. Inoltre, è importantescegliere il tipo di adsorbente più adatto per l'analisi desiderata e ottimizzare i parametri di separazione, comeil tipo di fase mobile, la temperatura e il flusso del solvente.In conclusione, la cromatografia di adsorbimento è una tecnica di separazione molto utile e versatile, chepermite di ottenere risultati accurati e riproducibili. Grazie alla sua flessibilità e alle sue numerose applicazioni,è diventata uno strumento indispensabile per molti laboratori di ricerca e analisi.

due fasi e che possono essere di 3 tipi:

• Isoterma lineare: il coefficiente di ripartizione K è costante e il picco è simmetrico (S=1)
• Isoterma di tipo L: Il coefficiente di ripartizione K è elevato per basse quantità di soluto, perciò le prime molecole di soluto sono fortemente trattenute dall'adsorbente, il picco è dunque asimmetrico (tailing, S>1)
• Isoterma di tipo S: Il coefficiente di ripartizione K è basso per basse quantità di soluto, perciò le prime molecole di soluto sono poco trattenute dall'adsorbente (fronting S<1)

Per ridurre il problema della scodatura dei picchi si può:

• Riscaldare a 700-800°C (caso dell'allumina)
• Trattare con una sostanza che venga fortemente adsorbita come l'acqua (caso della silice).

10-Cromatografia di ripartizione (o LL)

In questo caso il soluto si ripartisce tra la fase mobile e quella fissa che sono entrambe liquide e immiscibili fra loro.

competizione s'instaura tra la fase fissa e quella mobile nei confronti del soluto, infatti molecole di soluti diversi si ripartiscono in maniera diversa fra le due fasi. Si può lavorare sia in fase normale (fase stazionaria più polare di quella mobile) sia in fase inversa (fase mobile più polare di quella stazionaria). La fase stazionaria è un liquido, in base a come è legata al supporto solido esistono due tipi di cromatografia: 1. Cromatografia LL classica: la fase stazionaria liquida viene fatta adsorbire sul supporto solido inerte (silice di solito) mettendo in sospensione la silice nel solvente e facendolo poi evaporare, tuttavia il liquido non è irreversibilmente legato al supporto solido e può accadere che l'eluente della fase mobile disciolga progressivamente la fase stazionaria (infatti non esistono coppie di liquidi completamente immiscibili), il liquido della fase fissa viene quindi rilasciato con.

conseguentedeterioramento della colonna (bleeding).

2. Cromatografia LL a fase legata: la fase stazionaria liquida è ottenuta legando chimicamente deigruppi con una certa mobilità conformazionale (che conferiscono caratteristiche simili a quelle diun liquido) a un supporto solido che deve avere determinate caratteristiche:

• Essere in grado di legare i gruppi funzionali della fase stazionaria
• Dev'essere inerte, non deve cioè interagire né con le catene legate né con la fase mobile.
• Dev'essere meccanicamente resistente, deve cioè resistere alle pressioni operative dellacolonna.

La silice silanolizzata è il supporto più utilizzato, si ottiene facendo reagire la silice con unreagente silanolizzante (Cl-SiR(R')₂) in sospensione in un solvente aprotico in cui si porta aebollizione liberando HCl :

In base ai gruppi R e R' legati è possibile cambiare le caratteristiche chimiche dei

granuli superficiali della silice, mentre non di quelli che costituiscono il nucleo della particella.

Ad esempio, usando come reagente silanolizzante il cloruro di dimetilottadecilsilano si legano gruppi apolari che cambiano la natura polare della silice.

Altri reagenti silanolizzanti sono:

• Cianoetilici (CH₂CH₂CN): per separare zuccheri e dioli.
• Idrossietilici (CH₂CH₂OH)
• Amminoetilici (CH₂CH₂NH₂): usata come resina scambiatrice.
• Fenilici: per separare composti aromatici.
• C18 e C8: più utilizzati
• C4: per separare proteine
• C2: per separare alcoli a basso PM

Si possono usare mono (ClSiR₃), di(Cl₂SiR₂), triclorosilani (Cl₃SiR):

Con ClSiR₃ (fase monomerica) per motivi di ingombro sterico non tutti i gruppi OH legati al Si tendono a reagire e quindi ci sono dei gruppi silanolici residuali. C'è il vantaggio che, a causa della maggiore mobilità delle catene, viene favorita l'interazione con le molecole

disoluto. Con Cl₂SiR₂ (fase polimerica) due gruppi OH sono legati allo stesso diclorosilano. Con Cl₃SiR (fase polimerica) due gruppi OH sono legati allo stesso triclorosilano e c'è un Cl residuo che per idrolisi passa in soluzione. Per le fasi polimeriche c'è il vantaggio di una maggiore schermatura dei silanoli alla base del granulo. I gruppi silanolici residuali, che sono in realtà presenti anche nelle fasi polimeriche, sono responsabili di scodature (peak tailing), quindi si cerca di diminuire la concentrazione di questi gruppi SiOH liberi utilizzando TMS (end-capping o capping-off). Esistono due tipi di silice: - Silice di tipo A (o acida) veniva usata negli anni 60-70, poiché è preparata a partire dalla terra di diatomee e presenta molte impurezze, come ioni metallici che se si trovano vicino a gruppi silanolici ne incrementano la polarità e li rendono in grado di scambiare cationi in ambiente basico, provocando una scodatura.dei picchi.
Silice di tipo B è invece più recente e non ha impurezze quindi viene usata preferibilmente.
Stabilità delle fasi legate alla silice in base al pH: Le colonne a fasi legate devono essere utilizzate tra pH 2 e 8, infatti:
- Ambiente acido (pH<2): il legame Si-O si idrolizza.
- Ambiente basico (pH>8-9): per la natura acida della silice i suoi granuli si disciolgono.
Per stabilizzare la silice fuori dal range di pH ideale si può:
- Produrre silice con minore sviluppo superficiale, quindi minore porosità e maggiore resistenza chimica e meccanica.
- Usare fasi legate bidentate che leghino i silanoli adiacenti e proteggano la silice sottostante.
Le catene di film liquido si possono disporre in due modi, in base alla polarità/apolarità della fase mobile:
- A pelliccia: viene utilizzata tutta la lunghezza della catena di film liquido rendendo le interazioni con il soluto più efficaci.
- A palizzata.
Dato che lemobile, un soluto apolare avrà una maggiore affinità per la fase stazionaria rispetto a un soluto più polare. La cromatografia di ripartizione è ampiamente utilizzata in diversi settori, come ad esempio l'analisi di composti organici, la separazione di miscele complesse e la purificazione di sostanze chimiche. Per ottenere una separazione efficace, è importante scegliere il solvente adeguato per la fase mobile. I solventi comunemente utilizzati includono il tetraidrofurano, l'acetonitrile, il metanolo e l'acqua. La fase mobile deve essere caratterizzata da alcune proprietà specifiche. Innanzitutto, deve avere un alto punto di ebollizione per evitare la formazione di bolle durante l'analisi. Inoltre, deve essere poco viscosa in modo da non richiedere alte pressioni per il flusso. Infine, deve avere una differenza minima di polarità rispetto alla fase stazionaria per migliorare la selettività. Infatti, i soluti da separare devono avere una polarità intermedia tra le due fasi per ottenere una separazione efficace. Il meccanismo di separazione si basa sulla teoria solvofobica. Un soluto poco polare in una fase mobile polare tende a ripartirsi nella fase stazionaria per minimizzare la superficie di contatto con la fase mobile polare. Pertanto, a parità di polarità della fase mobile, un soluto apolare avrà una maggiore affinità per la fase stazionaria rispetto a un soluto più polare.

mobile i soluti più apolari passano e rimangononella fase fissa maggiormente di quelli più polari, in altre parole a parità di fase fissa i soluti più apolarihanno tempi di ritenzione più lunghi. Le interazioni che si instaurano con la fase fissa sono le stesse cheintervengono nella cromatografia ad adsorbimento quindi, soprattutto in quella a fase diretta, è impossibileevitare che una parte del soluto venga adsorbito; tali interazioni sono:

• Dipoli istantanei
• Dipoli permanenti
• Legami a idrogeno

Selettività di soluti appartenenti a una serie omologa: se occorre separare soluti che appartengono a unaserie omologa, cioè che hanno stessa formula di base ma che differiscono per una certa unità di pesomolecolare (es: serie omologa degli alcani) occorre conoscere la selettività con cui è possibileeffettivamente separarli.

Se riportiamo in un grafico il valore di lnK’ in funzione di n (numero di

unità ripetute nella serie) si ottiene un andamento lineare dove la pendenza rappresenta la selettività del sistema cromatografico nei confronti di quella serie omologa, ossia l'intervallo di tempo che separa due termini successivi della serie. Ripetendo questo ragionamento per diverse classi di sostanze (aldeidi, alcol, ...) si può individuare la selettività relativa a ciascuna classe. La stessa cosa si può dire considerando una sostanza specifica e aumentando progressivamente il numero dei sostituenti, in questo modo si può quindi stabilire una scala di selettività di vari sostituenti e capire quale di questi influenzi maggiormente la selettività del sistema cromatografico.

• Il primo gruppo della scala (-CH₂): all'aumentare del numero di unità metileniche aumentano i tempi di ritenzione e quindi la pendenza della retta.
• I gruppi centrali della scala (Cl, ...CHO): bassa selettività,

pendenza quasi zero.