Cromatografia

Cromatografia

La cromatografia è un metodo analitico largamente utilizzato per la separazione di uno o più molecole presenti all'interno di una miscela. Esistono diversi tipi di cromatografia, ma tutti hanno in comune l'uso di una fase stazionaria e di una fase mobile. I componenti della miscela sono trasportati dalla fase mobile nella fase stazionaria e la separazione è basata sulle differenti velocità di migrazione degli analiti presenti nella miscela.

I metodi cromatografici sono prevalentemente di due tipi:

• Cromatografia su colonna
• Cromatografia planare

Nel primo caso la fase stazionaria è impaccata in una colonna e la fase mobile è forzata a passare all'interno di essa dalla pressione o dalla gravità; la seconda prevede che la fase stazionaria sia supportata su una superficie piana o nei pori della carta, mentre la fase mobile si muove attraverso la fase stazionaria per capillarità o sotto l'influenza della gravità.

Cromatografia a eluizione su colonna

Due analiti presenti all'interno di una stessa miscela possono essere separati tramite cromatografia su colonna mediante eluizione su colonna impaccata. La colonna consiste in un tubo di piccolo diametro impaccato con un solido inerte che sostiene la fase stazionaria. La fase mobile occupa gli spazi vuoti tra le particelle del materiale impaccato.

Supponiamo di voler separare una miscela contenente due analiti da separare: A e B. Inizialmente la miscela viene introdotta nella colonna al tempo t₀ nella parte più alta della colonna. Con la prima aggiunta della fase mobile, la miscela inizia a scendere, cioè a eluire, lungo la colonna dove avviene una ripartizione tra fase mobile e fase stazionaria (tempo t₁). Ulteriori addizioni di solvente continuano a spingere la miscela all'interno della colonna. Poiché il movimento del soluto può avvenire solo nella fase mobile, la velocità media con cui il soluto migra dipende dalla frazione di tempo che esso trascorre nella fase mobile. Questa frazione è piccola per soluti che sono fortemente trattenuti dalla fase stazionaria, ma aumenta al diminuire dell'affinità.

Nell'esempio dell'immagine, l'analita B ha un'affinità maggiore per la fase stazionaria e quindi il tempo che impiega a percorrere l'intera colonna è maggiore e la velocità minore, mentre l'analita A ha meno affinità e quindi eluisce prima dalla colonna. Nella parte finale della colonna è inoltre presente un rivelatore, ovvero uno strumento in grado di rispondere alla concentrazione del soluto e il suo segnale viene riportato in funzione del tempo in un grafico noto come cromatogramma. Questo grafico risulta utile sia per l'analisi qualitativa che quantitativa. La posizione dei picchi sull'asse del tempo è utile per identificare i diversi componenti nel campione, mentre le aree sotto ai picchi indicano la misura quantitativa del contenuto di ogni analita.

Esistono dei metodi per migliorare i risultati cromatografici. Supponiamo per esempio di avere sempre come campione la miscela contenente i due analiti A e B in cui A ha meno affinità per la fase stazionaria rispetto a B. Ciò che succederà sarà una separazione dei due analiti nella colonna che sarà maggiore tanto maggiore sarà la lunghezza della colonna; non solo, tanto più tempo passerà durante l'eluizione tanto maggiore sarà la banda formata dai due analiti. L'allargamento della banda è in realtà un evento inevitabile, ma si possono comunque trovare dei compromessi affinché l'allargamento delle bande si verifichi in tempi più lunghi. In questo modo diventa possibile una netta separazione delle specie analitiche a patto che la colonna sia sufficientemente lunga. Esistono parecchie variabili chimiche e fisiche che influenzano la velocità di separazione e l'allargamento delle bande. Di conseguenza la separazione può essere migliorata attraverso il controllo di queste variabili.

Velocità di migrazione dei soluti

La velocità con cui gli analiti migrano attraverso la colonna dipende dalle velocità relative con cui questi vengono eluiti. Le velocità relative di ogni analita sono però determinate dalle concentrazioni del soluto in ciascuna delle due fasi. Questo significa che l'analita A possiede un suo equilibrio tra fase mobile e fase stazionaria e lo stesso l'analita B:

• A (mobile) ↔ A (stazionaria)
• B (mobile) ↔ B (stazionaria)

La costante di equilibrio che regola questa reazione è la costante di distribuzione. Un altro fattore importante da osservare nel cromatogramma è il tempo che un analita impiega ad eluire dalla colonna. In questa immagine sono presenti due picchi. Il picco più basso sulla sinistra appartiene a una specie che non viene trattenuta dalla fase stazionaria. Il tempo t_M tra l'iniezione del campione e la comparsa del primo picco prende il nome di tempo morto o vuoto. Il tempo morto dà una misura di quanto impiega la fase mobile a eluire. Per calcolarlo, infatti, si può inserire nella fase mobile una sostanza che non venga trattenuta in alcun modo dalla fase stazionaria. Il picco maggiore a destra invece corrisponde all'analita che è stato trattenuto dalla fase stazionaria. Il tempo necessario affinché l'analita eluisca dalla colonna dopo la sua iniezione viene definito tempo di ritenzione (t_R), mentre il tempo che esso trascorre interagendo con la fase stazionaria è il tempo t_s. Un altro parametro importante è il fattore di selettività α della colonna. Il fattore di selettività è definito come il rapporto tra la costante di distribuzione del soluto maggiormente trattenuto e la costante di distribuzione di quello meno trattenuto. Per questo motivo, questo parametro dà una misura di quanto una fase stazionaria sia in grado di separare i due analiti.

Allargamento della banda

L'efficienza di una colonna cromatografica è influenzata da quanto una banda di un analita si allarghi durante la corsa. Ma perché la banda si allarga? La banda si allarga a causa dei movimenti che l'analita compie passando tra la fase stazionaria e la fase mobile. Durante la percorrenza della colonna, l'analita si muove, è una molecola dinamica, che riesce quindi a interagire sia con la fase mobile che con la fase stazionaria. Tanto più la corsa cromatografica procede, tante più molecole rimarranno "intrappolate" momentaneamente nella fase stazionaria mentre altre procederanno la corsa con la fase mobile. Successivamente queste si staccano dalla fase stazionaria e se ne legano altre; tuttavia, quelle presenti nella fase mobile (sempre in movimento) procedono in avanti generando quindi questa sorta di scia: la banda.

Efficienza della colonna

Due termini tra loro correlati sono largamente utilizzati per valutare l'efficienza quantitativa di una colonna cromatografica:

• Altezza del piatto H
• Conteggio dei piatti o numero di piatti teorici N

Per poter capire cosa si intende per piatti teorici e altezza del piatto, bisogna immaginarsi la colonna come una sorta di tubo diviso in tante piccole frazioni, esattamente in N sezioni. I piatti teorici infatti non sono altro che le piccole porzioni con cui, in modo immaginario, è possibile dividere una colonna e l'altezza di ogni singolo piatto è proprio H. L'efficienza della colonna aumenta con l'aumentare del numero dei piatti teorici e con la diminuzione dell'altezza del piatto teorico. Questa teoria nacque dallo studio di Martin e Synge e si fondava sull'assunzione che in ciascun piatto gli analiti fossero in equilibrio fra fase mobile e fase stazionaria. Il movimento dell'analita lungo la colonna risultava essere un trasferimento discontinuo della fase mobile in equilibrio tra un piatto teorico e il successivo. Tuttavia, questa teoria può essere utilizzata solo per valutare l'efficienza della colonna virtualmente ma non l'allargamento delle bande. Questo perché nella realtà la cromatografia possiede un andamento dinamico in cui le fasi si muovono una accanto all'altra a una velocità tale da non esserci il tempo necessario per raggiungere l'equilibrio.

Variabili che influenzano l'efficienza della colonna

L'efficienza della colonna dipende dall'entità di alcuni processi che avvengono nella colonna e che dipendono dal tempo in cui la fase mobile e la fase stazionaria rimangono in contatto. Questo tempo dipende chiaramente dalla velocità di flusso della fase mobile ovvero tanto più è veloce la fase mobile tanto più breve sarà il tempo di interazione con la fase stazionaria e viceversa. Esiste un'espressione di H, ovvero dell'altezza del piatto teorico, espressa in cm rapportata alla velocità lineare della fase mobile espressa in cm/min (u). Questa espressione è l'equazione di Van Deemter:

H = A + (B/u) + C*u

Dove A, B e C sono rispettivamente i coefficienti per la diffusione turbolenta, la diffusione longitudinale e il trasferimento di massa della fase stazionaria. Se si riportano in grafico questi 3 termini in funzione della velocità della fase mobile e la somma di tutti questi effetti si osserva che il flusso ottimale corrisponde al valore minimo dell'altezza del piatto e alla massima efficienza di separazione.

Cosa si intende per diffusione turbolenta, diffusione longitudinale e trasferimento di massa nella fase stazionaria? L'allargamento della banda, abbiamo visto, essere dovuto al modo in cui l'analita si distribuisce tra fase stazionaria e fase mobile durante la corsa nella colonna. L'analita quindi compie diversi cammini tra le due fasi che non sono cammini dritti ma bensì sono percorsi curvi, o ancor meglio turbolenti. Questo fenomeno di diffusione turbolenta dipende dalla velocità della fase mobile. Questo perché se la velocità della fase mobile è elevata, gli analiti vengono spinti con maggiore forza verso la fine della colonna; se la velocità è invece lenta, interagiranno in modo più lento con le due fasi e percorreranno dei percorsi più lunghi, eluendo quindi più tardi.

In cromatografia, la diffusione longitudinale è lo spostamento di un soluto dal centro della banda a regioni in cui la concentrazione è minore, ovvero alle due estremità della banda. La diffusione longitudinale infatti è causa dell'allargamento della banda in gascromatografia dove la velocità di diffusione delle molecole è molto elevata, ma risulta insignificante in cromatografia liquida dove la velocità di diffusione delle molecole è bassa.