Contaminazioni cellulari, Tecnologie per terapia genica e cellulare

7.3 CONTAMINAZIONI

Esistono due tipi di contaminazioni più frequenti: le cross contaminazioni e le contaminazioni da mico-

plasmi.

La cross contaminazione si può avere quando si lavora contemporaneamente con due linee cellulari di-

e quindi può capitare, a causa di una distrazione dell’operatore, che alcune cellule di una linea cellulare

stinte

finiscano nell’altra. Ogni linea cellulare ha la propria identità. Nel corso del tempo cambia la morfologia

della linea contaminata, stentano a duplicarsi, non producono fattori per i quali sono selettivi. Se la cross

contaminazione si protrae nel tempo la linea cellulare ha perso la sua identità. Si fanno accertamenti per scon-

giurare cross-contaminazioni (cariotipo, fingerprinting). È una linea ibrida. Drexter identificò false linee cel-

lulari derivanti da cross-contaminazioni.

I micoplasmi rappresentano un grande gruppo di microrganismi e si possono trovare nei reagenti o anche

nell’uomo (sono tutti commensali, parassiti o patogeni). Le infezioni da micoplasma sono piuttosto difficili

all’operatore

da diagnosticare, la loro presenza può passare del tutto inosservata provocando profondi

cambiamenti nel metabolismo della linea cellulare in coltura (alterazione di livelli di sintesi proteica, altera-

Anche l’FBS

zioni del fenotipo, e del pattern immunofenotipico ossia caratteristiche esterne della cellula). e

tripsina porcina possono portare contaminazioni da micoplasmi. Le contaminazioni da micoplasmi possono

essere debellate con chinolone ed antibiotici se diagnosticate in tempo.

Per banca cellule si intende un archivio di cellule dove le cellule sono catalogate e conservate. Le cellule

vengono conservate in azoto liquido. Le cellule possono essere acquistate o direttamente da un ricercatore,

o indirettamente da altri ricercatori o dalle banche cellule. Alcune delle più importanti banche cellulari sono:

ATTC (americana), DSMZ (tedesca). Per scongiurare eventuali contaminazioni la linea cellulare è sottoposta

al controllo di identità ad esempio tramite il controllo del cariotipo, tramite profilo enzimatico, citogenetica o

DNA fingerprinting.

L’espansione processo che porta all’aumento del numero di cellule disponibili

è un con la perfetta con-

servazione delle caratteristiche biofunzionali delle cellule. Dopo una fase di espansione è corretto conside-

rare le cellule come archiviabili in una parte della cell bank (sono archiviate e conservate).

che porta all’aumento del numero di cellule disponibili allo scopo di

Il mantenimento è un processo

fornirle al gruppo di ricerca che le ha richieste. Il processo di mantenimento è unicamente finalizzato al

sacrificio sperimentale delle cellule e non alla loro re-archiviazione. È pertanto consentito utilizzare pro-

cedure non convenzionali nella fase di mantenimento (working bank: cellule usate per fini sperimentali).

Un processo fondamentale per una cellula è la sua conservazione. Le linee cellulari possono essere criocon-

servate in azoto liquido a -196°C (fase liquida) per oltre 10 anni senza significativi cambiamenti delle loro

caratteristiche biologiche. Non si modifica lo status delle cellule, se sono contaminate resteranno tali. Le cel-

lule vitali possono essere recuperate in qualsiasi momento. Le cellule che dovranno essere crioconservate

vengono raccolte nella fase logaritmica di crescita, viene determinato il numero di cellule e la loro per-

centuale di vitalità, vengono centrifugate con eliminazione del sovranatante e risospese nel medium di

congelamento composto da FBS e DMSO, successivamente viene posto in ghiaccio e le criovials vengono

siglate. Il DMSO (come anche il glicerolo) sono crioprotettivi, quindi proteggono la cellula da eventuali

danni che possono fare i cristalli di ghiaccio che si formano, ma a temperatura ambiente può provocare danni

alle cellule. Non c’è bisogno di sterilizzare il DMSO in quanto è

irreversibili naturalmente letale per i bat-

teri.

Sia le fasi di congelamento che quelle di scongelamento devono avvenire velocemente per non far soffrire le

cellule. Se la velocità è troppo lenta o troppo veloce si hanno danni. Se è troppo lenta si possono formare

troppo veloce i cristalli possono formarsi all’interno della cellula

dei cristalli di ghiaccio, se è e nella

soluzione. La velocità ottimale di raffreddamento è poco inferiore a 1°C al minuto. Questa velocità si può