Colture cellulari, Tecnologie per terapia genica e cellulare

7.1 COLTURE CELLULARI

Le cellule staminali sono un importante target della terapia genica. Le cellule staminali sono cellule prima-

rie.

La coltura cellulare è un insieme di cellule mantenute in vitro derivanti dalla disgregazione di tessuti o

isolati da fluidi biologici. Con la crescita in vitro le cellule sono fatte crescere lontane dal loro ambiente

fisiologico. Le cellule sono quindi adattate (ambientamento) in vitro, si cerca quindi di riprodurre artifi-

cialmente quello che accade in vivo.

Grazie alle colture cellulari si possono eseguire vari tipi di analisi sulle cellule (in quanto comunque sono

facilmente manipolabili) in maniera riproducibile ed economica (ed inoltre possono essere congelare per la

conservazione), ma è da considerare (tra gli svantaggi) che le cellule in coltura non riproducono realmente

quello che farebbero nel loro ambiente fisiologico (ad esempio le cellule staminali in coltura più vanno

avanti con le divisioni più perdono la loro staminalità). Sulle cellule in coltura possono essere eseguiti diversi

tipi di analisi: biologia cellulare e molecolare, genetica, citogenetica, oncologica, farmacologica, immuno-

logica.

Per ottenere una buona coltura cellulare bisogna lavorare in condizioni sterili ed asettiche sia per prevenire

contaminazioni da parte dell’operatore o da parte di micoplasmi, sia per evitare la contaminazione di se stessi

o di terzi.

Il laboratorio di biologia cellulare si chiama camera cellula e deve essere sterile. Deve essere composto da una

stanza antecedente per permettere all’operatore di indossare gli indumenti necessari, i camici usati in camera

cellule devono essere monouso o specifici per la camera cellule.

Per evitare contaminazioni durante la manipolazione di cellule, tutte le operazioni dovranno essere effet-

tuate sotto cappe a flusso laminare. Le cappe a flusso laminare hanno un flusso unilaterale formato da filetti

paralleli tra loro. I filetti di aria sterile trascinano via dall’area di

di aria sterile, filtrata attraverso filtri HEPA

lavoro tutti i contaminati. I filtri HEPA prevengono la formazione particellare e sono costituiti da fogli di

microfibre di vetro ripiegati più volte. Tutto ciò che viene posto sotto cappa deve essere sterile, anche il

protezione dell’operatore

mezzo di coltura. La è data dal pannello di vetro (questo tipo di cappa è chiamata di

tipo 2) ma non protegge totalmente né l’operatore né l’ambiente. Il flusso laminare non permette a particelle

di polvere di poggiarsi sulla superficie della cappa. Di solito le cappe sono dotate anche di lampada ad UV

che permette un’ulteriore sterilizzazione. Per stabilizzare il flusso laminare ci vogliono 5 minuti. Le cappe di

tipo 3 invece sono caratterizzate da chiusura ermetica con presenza di guanti per manipolazione di mi-

hanno un filtro HEPA per l’aria in ingresso e due filtri HEPA per l’aria in

crorganismi di rischio maggiore,

uscita.

I terreni di coltura usati per coltivare le cellule devono essere sterili. Le tecniche di sterilizzazione più frequenti

sono:

 Sterilizzazione a calore rosso su fiamma

 mediante l’utilizzo di un forno a 160°C per almeno 2 ore. Indicato per

Sterilizzazione al calore secco

la vetreria da laboratorio

 Sterilizzazione al calore umido tramite utilizzo di autoclave a 121°C per almeno 15 minuti. Indicato

per mezzi non sensibili al calore e per la vetreria da laboratorio dopo l’utilizzo

I mezzi di coltura sono quelli in cui una cellula in coltura cresce. Di solito sono dotati di sistema tampone

che garantisce il mantenimento di pH. Si usa il rosso fenolo per valutare anche visivamente eventuali vi-

raggi di pH, di solito infatti il terreno, in presenza di rosso fenolo, è rosso, ed ha un pH compreso tra 7,2 e 7,4;

se il colore diventa blu-violetto il terreno è diventato alcalino quindi le cellule sono andate in apoptosi, se

quindi c’è una probabile

diventa giallo il terreno è diventato acido contaminazione batterica o da funghi. Il

mezzo di coltura contiene nutrimenti e deve essere cambiato quasi giornalmente.