Colture cellulari

Lezione 1: Colture cellulari

Le colture cellulari riguardano diversi campi della biologia, come le tecniche di riproduzione assistita (modulo di riproduzione), cioè il coltivare cellule germinali al di fuori del corpo, facciamo la fecondazione extracorporea e coltiviamo gli embrioni al di fuori del corpo fino ad un certo stadio per poi trasferirli in utero. Quindi le colture cellulari rappresentano il tentativo di tanti anni fa, perfezionatosi col tempo, anche se perfetto non lo è diventato, cioè quello di mantenere in vita e far proliferare cellule di varia natura al di fuori del corpo.

Tuttavia, come già accennato, non si è ancora riusciti a fare tutto, come una cellula che vive in un determinato tessuto o organo all’interno dell’organismo è sottoposta a delle interazioni cellulari e dei segnali diffusibili nel suo micro ambiente che alla fine promuovono il differenziamento di questa cellula; quindi, a volte, quando la suddetta cellula viene estrapolata dall’ambiente in vivo e coltivata in vitro, essa si comporta come una brutta copia delle cellule in vivo. Per capire come agisce questa cellula in vivo, e confrontarla con la sua attività in vitro, si utilizzano dei markers (markers differenziativi) e si utilizza un tipo di microscopia detta in fluorescenza.

Microscopia e colture cellulari

La microscopia e le colture cellulari sono due aspetti interdipendenti. Nell’ambito delle colture cellulari, quando si crescono cellule in coltura, abbiamo bisogno di osservarle e per farlo usiamo diverse tecniche di microscopia (dipende dal tipo di cellule).

Argomenti del corso

• Microscopia in campo chiaro: Serve ad osservare campioni biologici purché siano colorati.
• Microscopia in contrasto di fase
• Microscopia in contrasto interferenziale: Per vedere cellule viventi, incolore e trasparenti.
• Microscopia in fluorescenza: Ce ne sono sostanzialmente di due tipi, e si basa sull’utilizzo di sonde che sono molecole o macromolecole capaci di interagire specificamente con qualche sostanza, per verificare l’assenza e presenza e la sua distribuzione; e sono ad esempio gli anticorpi, cDNA ecc. Dato che abbiamo bisogno di un segnale visibile, quindi dobbiamo coniugare in modo covalente a questa sonda un segnale visibile che nel caso della microscopia in fluorescenza è il fluorocromo. Le due tipologie di microscopia in fluorescenza sono la epifluorescenza (ha delle limitazioni sullo spessore del campione) e confocale a scansione laser.

Storia delle colture cellulari

La storia delle colture cellulari ha inizio il secolo scorso, prima di allora era estremamente impensabile che cellule estrapolate da un organismo potessero vivere al di fuori di un corpo. Ross Harrison nel 1907 tentò di coltivare determinate cellule per rispondere a un problema scientifico che c’era a quel tempo, cioè quale fosse la natura delle fibre nervose. C’erano due teorie, la prima affermava che la fibra nervosa fosse costituita da tanti ponti cellula-cellula, mentre nella seconda la fibra nervosa era considerata un prolungamento di una cellula nervosa (oggi sappiamo che la seconda è vera).

Per dimostrare quale fosse la natura di questa fibra nervosa prelevò il precursore (tubo neurale) del sistema nervoso da un girino (da un embrione di anfibio), e sono cellule tonde senza prolungamenti. Harrison mise queste cellule (pezzo di tessuto - 3mm) in una goccia di un liquido biologico, in particolare di linfa prelevata dai sacchi linfatici di una rana adulta, che coagula, il tutto viene fatto a livello di un copri oggetto che successivamente viene messo capovolto su un vetrino a orologio (con una depressione al centro), poi sigillò con paraffina il bordo tra il vetrino copri oggetto e il vetrino cavo al di sotto, e lasciato riposare. Queste cellule rimasero vive e da tonde iniziarono a nascere dei prolungamenti. Questo metodo si chiama della goccia pendente.

Un problema delle colture cellulari è mantenere l’asetticità. Infatti, quando vengono prese le precauzioni asettiche necessarie, il tessuto/cellule riescono a vivere in queste condizioni, al di fuori del corpo, per settimane (nel caso di Harrison quattro settimane). Mentre le cellule si aggregano, non subiscono però una normale trasformazione nella forma (morfogenesi), e secondo Harrison questo era dovuto in parte alle condizioni anomale di tensioni meccaniche alla quale sono soggette. Inoltre nota che gli elementi individuali del tessuto (cellule) non si differenziano in modo caratteristico.

Alla fine, questi tentativi, i mezzi scelti (linfa), dei supporti per la crescita (vetrini cavi e copri oggetti) e metodi chirurgici (asetticità) effettuati da Harrison, fornirono le basi per coltivare cellule e tessuti. Successivamente, altri due scienziati, Carrell e Borrows nel 1910 estesero queste tecniche di coltura a cellule di animali a sangue caldo. Tuttavia, fu subito evidente che bisognava confrontarsi con problemi tecnici che non c’erano per le cellule di embrione di anfibio coltivate da Harrison.

I due scienziati capirono che usando come mezzo di coltura la linfa di anfibio adulto coagulata non andava bene, quindi fecero altre prove con diversi fluidi biologici. Alla fine utilizzarono plasma di pollo, quindi le analisi erano su cellule di gallina, riuscirono ad ottenere dei coaguli che riuscirono a promuovere la crescita di cellule nervose e mesenchimali a partire da embrioni di pulcino. Carrell e Borrows iniziarono a coltivare una serie di cellule di mammifero, sempre utilizzando coaguli di plasma e in più si accorsero di determinati problemi delle colture a lungo termine, cioè si rallentava la crescita cellulare e pensarono che questo fosse dovuto all’effetto inibitorio di prodotti di rifiuto metabolici che si accumulavano nel coagulo di plasma. Superarono questo problema trapiantando questi frammenti dal coagulo originale di plasma, li dissezionarono, e li misero in un nuovo coagulo (cambiavano il mezzo di coltura).

Nel 1912 Carrell pubblicò un lavoro in cui affermava di essere riuscito ad ottenere cellule miocardiche di pulcino immortali, cresciute fino al 1946. Questo era un artefatto dovuto a contaminazione cellulare per cattiva filtrazione del plasma. Poi nel 1961 Hayflick e Moorhead mostrarono che le cellule prese da un organo normale hanno una capacità limitata di divisione e crescita; nel caso delle cellule del miocardio di pulcino esse potevano dividersi per un massimo di 60/80 divisioni dopodiché muoiono. Oggi sappiamo che le cellule, invece che morire possono anche intraprendere una trasformazione (sia in vivo che in vitro), per esempio possono diventare cancerogene, acquistando una “vita continua”.

La prima vera linea cellulare immortale deriva da una linea di cellule cancerogene di topo nel 1948 generate da Wilton Earle. Successivamente, lo scopo fu quello di creare una linea cellulare umana immortale/continua, e George Gey fu il primo, cioè le famose cellule Hela (Henrietta Lack’s cell). Questo fu possibile perché riceveva regolarmente campioni di tessuti di Afroamericani che ricevevano un trattamento gratuito per il cancro, e solo nel 1951 grazie ad Henrietta Lack ottenne finalmente dei risultati. Il tessuto prelevato proveniva da un tumore alla cervice uterina ed era stato prelevato, come tutti gli altri campioni senza il consenso del paziente e portando molti soldi a diverse persone, ecco perché oggi sono stati stipulati dei contratti e leggi hanno permesso di comprendere molte cose.

Le cellule Hela sono stati ridotti i test in vivo (su animali vivi), e nel 1952 hanno permesso di arrivare al vaccino per il polio. Inoltre sono molto robuste e utili per studiare la biologia delle cellule cancerose. Cellule tumorali: esse non hanno più il controllo sul ciclo cellulare. I regolatori negativi sono messi fuori gioco e l’enzima telomerasi è attiva il 90% delle volte. Le cellule normali, a causa dell’accorciamento dei telomeri, possono fare un tot di cicli e poi vanno in apoptosi. Le cellule embrionali hanno l’enzima telomerasi che permettono a queste cellule di non andare in apoptosi e rigenerare sempre il telomero.

Nel 1978, dopo un grande sviluppo delle colture cellulari, la coltivazione di diversi tipi di cellule e tante linee cellulari continue, e il tutto veniva conservato in delle banche dati. Nel 78’ due scienziati, Nelson-Rees e Flandermeyer, osservarono che gran parte di queste linee cellulari provenienti da tessuti diversi, in realtà erano o totalmente cellule Hela o erano contaminate in gran parte da esse. Ciò era accaduto perché gran parte dei laboratori dove venivano effettuate queste colture cellulari, possedevano cross contaminazione anche cellule Hela; quindi era avvenuta una (le cellule saltano da un campione ad un altro), e si può avere quando queste cellule si dissociano e sono singole e vengono poi pipettate, ad esempio, si vengono a creare delle piccole nebulizzazioni di liquido contenente cellule Hela che possono andare ad infettare altri contenitori contenenti altre cellule, presenti nelle vicinanze. Si è scoperto usando dei marcatori genetici.

Tutto questo ci fa capire che ci sono linee cellulari che in determinati tipi di colture possono crescere meglio di altre cellule. Si può avere quindi una selezione a favore di certe cellule e a sfavore di altri. Quindi, le cellule Hela, ad elevata proliferazione, si sono trovate in condizioni favorevoli per il loro sviluppo rispetto a quelle cellule attaccate, che sono state soppiantate totalmente. Nel 1978 sono stati prodotti una serie di mezzi di coltura liberi da siero, selettivi per determinate cellule. Quindi con l’andare avanti con le conoscenze sulle colture cellulari e sui mezzi di coltura si è riusciti a creare dei terreni di coltura la cui formulazione permettesse la crescita selettiva di particolari cellule a cui si era interessati. Inoltre, l’altro vantaggio è stata l’eliminazione del siero da questi mezzi; infatti se prendiamo dei mezzi di coltura semplici e ci mettiamo delle cellule all’interno, queste riuscivano a sopravvivere ma non a proliferare, e affinché ciò potesse essere possibile si doveva addizionare il mezzo di coltura al siero.

Tuttavia, una volta aggiunto il siero, un mezzo che prima era definito da un punto di vista chimico non lo era più, quindi risultava svantaggioso. Il siero, inoltre può portare di per sé una serie di patogeni. Tecnica di ibridazione di cellule somatiche per clonarla. Bisognava avere cellule eterogenee comunque. Pluripotenza delle cellule staminali embrionali. Stabili dei metodi per clonare cellule di criceto cinese in assenza di siero (CHO: cellule di ovaio di criceto cinese). La generazione tramite quei metodi per la fusione di cellule somatiche, la generazione di ibridomi per produrre anticorpi monoclonali. Hanno generato un certo numero di una linea di cellule staminali embrionali umane.

Lezione 2: Prima della microscopia

Prima dell’avvento della microscopia c’erano una serie di problemi nel guardare oggetti molto piccoli. L’occhio e il cervello, in realtà rappresentano un sistema di elaborazione immagini, e grazie alla presenza del cristallino e di muscoli che riescono a mettere a fuoco gli oggetti, a diverse distanze, possiamo mettere a fuoco con l’occhio umano oggetti a circa 20 cm all’infinito. Abbiamo praticamente dei sensori, le cellule fotorecettrici della retina, cioè circa 130x10⁶ bastoncelli e 7x10⁶ coni vedono i livelli di grigio e i colori. Tuttavia, l’occhio non riesce a vedere oggetti molto piccoli e difetta in potere di risoluzione.

In realtà ad occhio nudo possiamo distinguere particelle con un diametro fino a 0,1mm, da una distanza di circa 25 cm e le vede separate se distano non meno di 5 µm. Potere di risoluzione: è la distanza minima alla quale due oggetti molto vicini ci appaiono due oggetti separati e non un singolo oggetto.

Microscopia ottica

Con la microscopia ottica, se vogliamo guardare qualcosa di piccolo, ci possiamo aiutare con una lente, però con una singola lente di ingrandimento non riusciamo ad ingrandire un oggetto microscopico più di 10 volte (max 8-10x), ed è per questo che il microscopio viene chiamato microscopio composto perché ingrandisce in due volte l’oggetto e non in una singola volta. In realtà, un primo sistema di ingrandimento è l’obiettivo che proietta nel tubo del microscopio un'immagine ingrandita dell’oggetto (immagine intermedia); poi abbiamo l’oculare del microscopio, sempre una lente di ingrandimento che mette a fuoco questa immagine intermedia che è stata ingrandita dall’obiettivo e la ingrandisce ulteriormente. Quindi il microscopio composto ingrandisce in due volte: l'obiettivo produce un'immagine ingrandita dell'oggetto nel cosiddetto piano dell'immagine intermedia e l'oculare ingrandisce l'immagine intermedia allo stesso modo di una lente d'ingrandimento.

Per secoli, il microscopio ottico e le sue ottiche dipendevano solo dall'abilità del molatore di lenti. I microscopi erano spesso solo oggetti da mostrare e la microscopia divenne il passatempo favorito dei ricchi del 18º secolo. Solo nel 19º secolo le scienze naturali e la scienza dell'illuminazione e dell'immagine ottica acquisirono una solida posizione. Tra gli eventi importanti nello sviluppo della microscopia abbiamo von Fraunhofer (astronomo 1787-1826) con la costruzione di lenti a correzione cromatica (conoscenza della diffrazione della luce); e Carl Zeiss tra il 1846 ed il 1866 costruì microscopi di grande qualità (all'inizio strumenti molto semplici, microscopi da dissezione). In realtà, solo nel 1857 abbiamo il primo "vero" microscopio dotato di oculari ed obiettivo, anche se il sistema di illuminazione non era ancora perfezionato: lo "Stativo 1".

Dopo 20 anni, Zeiss conobbe il Dr. Ernest Abbe, che espresse il potere di risoluzione con una formula matematica: d è la distanza minima alla quale due punti molto vicini vengono visualizzati separati e non come un unico punto (potere di risoluzione); lambda è la lunghezza d’onda della sorgente luminosa utilizzata per illuminare il preparato; 2n sen-alfa detta apertura numerica; n indice di rifrazione. Se diminuiamo il numeratore avremo un numero più piccolo e una distanza minore alla quale i due oggetti si vedono separati quindi un maggiore potere di risoluzione, questo anche se aumentiamo il denominatore.

Abbe assieme a Otto Schott, chimico del vetro, iniziò una serie di studi per scoprire nuovi tipi di vetro per eliminare le aberrazioni ottiche. Possiamo avere anche un'aberrazione cromatica cioè quando osserviamo un campione microscopico poi attorno ad un determinato oggetto abbiamo degli aloni di vari colori; oppure un'aberrazione sferica cioè quando mettiamo a fuoco una sezione su un vetrino al centro del campo vediamo a fuoco e i margini sfocati. Il Professor Köhler (1866 -1948) che già aveva pubblicato delle regole per l'illuminazione corretta dei preparati, sviluppò un sistema d'illuminazione che permetteva di sfruttare l'intero potere risolutivo degli obiettivi di Abbe. Illuminazione omogenea delle immagini e incremento del potere risolutivo grazie all'uso di un condensatore. Le regole di Köhler sono caratteristiche essenziali per la messa a punto del microscopio.

Componenti di un microscopio

• Sorgente luminosa
• Stativo
• Filtri, che ci possono far cambiare la lunghezza d’onda della luce, ad esempio rosso, blu ecc.
• Specchi, che permettono di riflettere questa luce verso l’alto cioè verso il tavolino porta preparato.
• Diaframma di campo, con cui possiamo restringere o allargare il fascio di luce che è stato deflesso dallo specchio verso il preparato.
• Condensatore, immaginiamo che arrivi un fascio di luce al condensatore e che la condensi, in un diametro molto più piccolo, in un'area che è uguale al preparato che l’obiettivo riesce a vedere (maggiore intensità di luce).
• Diaframma di apertura, riprodotto sulla "pupilla" dell'obiettivo, regola l'illuminazione di questa pupilla. Il diaframma di apertura regola anche gli angoli di apertura dei coni di luce.
• Campione, in microscopia ottica
• Obiettivi, che oggi giorno sono montati su dei revolver (quindi ne abbiamo di diversi tipi insieme)
• Tubo del microscopio, in cui abbiamo l’immagine intermedia che può essere ingrandita ulteriormente dagli oculari o andare a una camera digitale.

Differenza di visione tra occhio umano e un microscopio ottico

Nel percorso ottico del microscopio, l'oggetto viene rilevato dall'obiettivo e proiettato dapprima all'infinito. I raggi di luce generati da un punto dell'oggetto viaggiano parallelamente dietro l'obiettivo. La lente del tubo funziona in modo simile a una fotocamera e produce un'immagine intermedia ingrandita, che viene raccolta dall'oculare ed inviata all'occhio. L'angolo visivo risultante δ1 è ora molto più grande di δ2 nel caso dell’occhio umano, dove l'oggetto è visto direttamente da una distanza di circa 25 cm.

Sorgenti luminose e lunghezza d'onda

Attualmente si usano lampade alogene, di 12 V 100 W, che emettono uno spettro di lunghezze d’onda continuo che va da circa 300 nm a 1400 nm, con una maggiore concentrazione della lunghezza d’onda tra 600 e 1200 nm. Sono alimentate in corrente continua. Le onde elettromagnetiche hanno una direzione di propagazione e attorno a quest’asse, che è la direzione di propagazione, i fotoni oscillano regolarmente formando dei massimi e dei minimi e la distanza tra i due picchi è la lunghezza d’onda. Se consideriamo l’intero spettro elettromagnetico, possiamo osservare diverse lunghezze d’onda che corrispondono a diversi colori e forme di luce visibile e invisibile.