Colture cellulari

Tipi di contaminazioni

Qui vediamo delle immagini dei vari tipi di contaminazioni:

A) da lieviti, strutture tondeggianti traslucide che presentano siti di gemmazione dove si vede la scissione per dividersi (due palline, una più piccola).

B) da muffe vediamo la crescita di ifee.

C) da batteri, più piccole (pur essendo alla stesso ingrandimento) e granulari.

Tra le contaminazioni la più pericolosa è certamente quella di micoplasmi. Può essere rilevata usando delle piastre da batteriologia inoculandole col terreno di coltura in cui si sospetta inquinamento da micoplasma. Ai fini di mostrare la contaminazione da micoplasma, qui al microscopio elettronico a scansione si può visualizzare la superficie contaminata.

Possiamo anche usare, per rilevarli, gli stessi fluorocromi (sonde fluorescenti) come il bisbenzimide (nome commerciale hoechst). In questo caso si sovracolorano le cellule e, colorando i nuclei in modo evidente, visualizziamo tanti granuli più visibili.

ingrandimento maggiore, che sono proprio i micoplasmi. Questi sfuggirebbero a metodi di microscopia consueti ma sono visibili solo con fluorescenza.

Abbiamo detto che l'osservazione è anche importante per rilevare eventuali segni di sofferenza cellulare, come in questa immagine. Quindi Sofferenza (cell crisis): granularità perinucleare, vacuolazione, arrotondamento e distacco. Questo indica che può essere necessario un cambio di mezzo oppure questi segni possono essere dovuti a reagenti tossici o a senescenza o la coltura si sta avvicinando all'invecchiamento.

Quindi quando è necessario fare un cambio con terreno fresco? Quando si osserva, in base al color rosso fenolo, ad esempio una diminuizione del pH. Questo è importante perché si sa che la maggior parte delle cellule cessa la proliferazione tra 7 e 6.5 e poi tra 6.5 e 6 c'è perdita di viabilità. Se una coltura in un giorno ha una diminuzione di pH di 0.3-0.4 unità,

avrà bisogno di un cambio ogni 24-48h. Ci sono poi altre regole che vanno rispettate per quanto riguarda la frequenza dei cambi del mezzo di coltura: in generale, più è elevata la concentrazione cellulare più rapida la caduta di pH (CO2) e più frequenti dovrebbero essere i cambi di coltura. In più segni di deterioramento delle cellule.

Altre considerazioni riguardano il volume di mezzo da utilizzare: in generale si utilizza 0.2-0.5ml/cm2 di superficie disponibile. Perché è importante questo rapporto tra volume di mezzo e superficie disponibile (quantità di monostrato)? Più elevato è lo spessore del mezzo più ci sarà un ostacolo alla diffusione di gas dall'atmosfera all'incubatore attraverso il mezzo che poi possano raggiungere le cellule. Possiamo avere a che fare con cellule con elevata richiesta di O2, in tal caso tenderemo a usare bassi rapporti tra volume di mezzo e superficie di crescita.

quindi uno spessore 2mm; oppure con cellule con bassa richiesta di O2 in talcaso usiamo un volume di mezzo maggiore, ad esempio uno spessore di 5mm. Un’altra cosa molto importante è la densità cellulare con cui intendiamo se stiamocoltivando, ad esempio, in un determinato contenitore 10 alla 4 o 5 o 6 cellule. Infatti le colture a bassa densità crescono male, ecco perché può essere preferibilesostituire metà mezzo. Un modo alternativo per promuovere la proliferazione incolture a bassa densità è usare mezzi condizionati. Esistono anche dei modi permantenere le cellule vive, ma per evitare la proliferazione, i cosi detti mezzi dimantenimento (sono a bassa concentrazione di siero: serum-free o 0.5-2% siero). Quindi si evita la proliferazione e quindi l’esaurimento della vita di colture finite. Abbiamo tutta una serie di parametri che possiamo raccogliere dalle linee cellulariche possono essere utili per testare delle

Variazioni del microambiente su queste colture, ad esempio abbiamo un nuovo siero che entra in laboratorio. Questo siero ha una grande variabilità e può avere delle performance molto diverse dal lotto all'otto di produzione. Ecco perché è utile paragonare le performance dei 2 sieri. Oppure possiamo usare le colture cellulari per vedere l'eventuale tossicità di una molecola, e uno dei modi per vederlo è determinare una cosiddetta curva di crescita.

Come viene determinata una curva di crescita? La curva di crescita (growth curve) viene determinata tra una subcoltura ed una successiva su una linea cellulare in fase esponenziale di crescita. Da un punto di vista pratico dobbiamo prendere una linea cellulare, tripsinizzarla dai monostrati e inoculare le cellule in una serie di pozzetti. Ogni 24h si recuperano le cellule da questi pozzetti per tripsinizzazione e determinarne il numero di cellule e tali valori vengono esposti in un grafico rispetto al tempo.

Qui vediamo una curva di crescita in cui sono state prese delle cellule che crescevano in fase esponenziale, tripsinizzate e contate, dopodiché sono state inoculate in una serie di piastre multipozzetto, inoculate 2 per 10 alla 4 cellule. Poi ogni 24h ci andiamo a prendere dei pozzetti, tripsinizziamo e vediamo quante cellule ci stanno, poi prendiamo un grafico e mettiamo i risultati in esso. Tipicamente otterremo una curva di crescita che ha questo andamento. Questo grafico ha 3 porzioni che possiamo considerare: - Fase di latenza, le cellule recuperano i danni da tripsinizzazione, secernono i componenti di superficie e matrice extracellulare che aderiscono alla superficie di crescita. - Fase di crescita, iniziano a proliferare. - Fase di plateau, o fase stazionaria. La crescita è ridotta o azzerata e le cellule entrano in differenziamento. Attraverso queste curve di crescita possiamo utilizzarle per determinare la risposta delle cellule in coltura a presuntive sostanze tossiche.

Farmaci, mitogeniecc. Tra i parametri che possiamo calcolare abbiamo il PDT (Population Doubling Time, tempo di raddoppio della popolazione), la lunghezza del Ciclo cellulare (tempo di generazione) e growth fraction (frazione in crescita). La fase esponenziale e quella del plateau, cioè la saturazione, danno informazioni rispettivamente su PDT e densità cellulare a saturazione. Il PDT è una rappresentazione media della popolazione, infatti include cellule che si dividono, non si dividono, muoiono ecc, che non va confuso con il tempo di generazione, che va misurato da un punto del ciclo fino al raggiungimento dello stesso punto nel successivo e considera solo le cellule che si dividono. Il PDT può essere molto variabile a seconda di che tipo di cellule consideriamo, ad esempio, se prendiamo linee leucemiche di roditori possiamo avere dei tempi di raddoppio molto veloci, da 12-15h; mentre nel caso, ad esempio, delle cellule a linea finita sono a crescita lenta, cioè

a 60-72h. Esempio protocollo per determinare una Curva di crescita:

1. Tripsinizzazione linea cellulare in fase esponenziale di crescita
2. Inoculo di 1ml sospensione cellulare a 3 differenti concentrazioni (es. preparare 25ml di sospensione cellulare di mezzo di coltura a diverse concentrazioni cellulari, ad esempio, 1x10⁴, o 3x10⁴, o 1x10⁵/ml). Poi si prendono, in questo caso, 3 piastre multipozzetto con 24 pozzetti e si mette 1 ml per pozzetto di queste differenti concentrazioni cellulari (in generale usiamo 10⁴ cellule, se abbiamo linee a crescita veloce, oppure usiamo 10⁵ per linee finite a lenta crescita).
3. Contare le cellule a 24, 48, 72h (in triplicato). Cioè si fa una serie di pozzetti che vengono "sacrificati", ogni 24h, per determinare il numero di cellule (si fa tripsinizzazione).
4. Cambio mezzo a 72h (caduta pH)
5. Campionamento quotidiano (dipende da PDT)
6. Calcolare il N° di cellule per cm² e per ml e si mettono in grafico

controllo.controllo. Altri test che possono essere fatti, sempre per determinare l'influenza dei reagenti ecc. sulle cellule di coltura, sono il Test di efficienza di piastratura (1-3 Settimane) (Formazione di colonie a bassa densità inoculo, 2-50 cell/cm2), usiamo delle fiasche da coltura, abbiamo una sospensione cellulare, inoculiamo nella fiasca 1 poi 2, 3 dopodiché nella 2 e 3 mettiamo dei nuovi sieri da testare e nella 1 il siero vecchio. Dopo che sono passate 3 settimane possiamo misurare: possiamo colorare, ad esempio, con un colorante le cellule e vedere il numero di colonie che si sono formate, nelle 3 condizioni; oppure il diametro delle colonie. Il numero delle colonie ci darà un indice della sopravvivenza delle cellule in quelle condizioni in vitro, mentre il diametro delle colonie è correlato invece alla capacità proliferativa delle cellule. Alla fine possiamo calcolare una misura della sopravvivenza, che viene detta efficienza di piastratura, oppure separtiamo da sospensioni cellulari moltodiluite in cui si pensa che ogni colonia derivi da una sola cellula, allora parleremo di efficienza di clonaggio. Queste 2 efficienze vengono determinate: (N° colonie / N° cellule inoculate) X 100 = Efficienza di piastratura. Altri parametri che possiamo andare a quantizzare sono, ad esempio, l'Indice di marcatura (o labeling index). Come viene fatto questo indice di marcatura? Si deve esporre la coltura cellulare 30 min, se in fase esponenziale, con timidina triziata obromodeossiuridina, o fino a 24h se in fase stazionaria. Dopo questo tempo andiamo a contare le cellule marcate (indice di marcatura). Tipicamente verrà fuori un indice di marcatura di circa il 10-20% delle cellule, se abbiamo a che fare con una coltura in fase esponenziale, oppure l'1% delle cellule se abbiamo a che fare con una coltura in fase stazionaria. Può essere utile andare a calcolare la frazione di crescita di una popolazione (o growth fraction), edÈ molto simile all'indice dim