Appunti di Colture cellulari

IL MODELLO DI NICCHIA DEL MIDOLLO OSSEO 3D RICAPITOLA LE INTERAZIONI IN VIVO TRA CELLULE

TUMORALI E OSSEE IN UN SISTEMA BIOLOGICAMENTE PIÙ RILEVANTE RISPETTO AL 2D

Immagine di cellule endoteliali della vena ombelicale umana che esprimono

proteine fluorescenti rosse (RFP+ HUVEC) in co-coltura con cellule di mieloma

MM1S che esprimono proteine fluorescenti verdi (GFP+) al giorno 9 di

coltura, in terreno di coltura endoteliale su impalcature di seta porosa

tridimensionali (viola). L'aderenza delle cellule GFP+ MM1S alle RFP+ HUVEC

e l'incorporazione nelle strutture delle cellule endoteliali simili a capillari

possono essere osservate e possono modellare le fasi iniziali dell'angiogenesi.

Le cellule GFP+ MM1S sono viste raggruppate e co-localizzate nelle

protrusioni endoteliali. L'immagine è la proiezione massima di immagini

confocali z-stacked a ingrandimento ×20 su un microscopio confocale a

scansione laser Leica SP5X.

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Per coltivare le cellule al di fuori dell’organismo originario sono necessari:

 terreni di coltura;

 strumenti di incubazione;

 ambiente sterile e controllato;

 altri strumenti:

o cappa a flusso laminare;

o incubatore;

o centrifuga;

o microscopio invertito;

 materiali per colture cellulari, costituito da plastica monouso, disponibile in commercio imballato,

sterile, trasparente, biologicamente inerte/non tossico:

o pipette;

o pipettatore;

o piastre multipozzetto (multiwell), da 6-384 pozzetti;

o fiasche con tappo ventilato;

o piastre Petri;

 equipaggiamento pe crioconservazione.

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CAPPA A FLUSSO LAMINARE PER COLTURE CELLULARI

---> permette la manipolazione delle cellule creando un ambiente sterile.

Le cappe a flusso laminare garantiscono principalmente la protezione del campione da contaminazioni, non

la protezione dell’operatore e dell’ambiente.

Vi è quindi un tavolo da lavoro utilizzato per la

manipolazione delle cellule, attrezzato con la cappa che

mantiene la sterilità.

L’operatore indossa camicie, guanti e mascherina. L’aria

contaminata entra nella cappa, e fluisce verso due filtri HEPA

(High Efficiency Particular Air): un filtro d’estrazione HEPA (vi

entra il 30% dell’aria contaminata), a cui segue in basso il

filtro da lavoro HEPA (vi entra il 70% dell’aria contaminata).

L’aria contaminata che passa attraverso i filtri esce sul piano

di lavoro come aria sterile, su cui è posto una lampada UV

accesa tra i periodi di attività. L’aspirazione dell’aia

dall’ambiente esterno è permessa da una ventola (FAN).

INCUBATORI

Gli incubatori sono strumenti che permettono di mantenere costanti:

 la temperatura (spesso 37°C), che varia in funzione del tipo cellulare e dell'organismo originario;

 la concentrazione di anidride carbonica.

Funzioni principali:

 mantenere la temperatura stabile in ogni area della camera interna dell’incubatore: le cellule

possono sopportare l’ipotermia (in opportune condizioni), ma NON possono sopportare

l’ipertermia, perché anche piccoli aumenti di temperatura per brevi periodi portano alla morte o

alla notevole alterazione della coltura cellulare;

 +

mantenere il corretto valore di pH, importante perché l’attività metabolica cellulare produce ioni H .

La presenza della CO permette al sistema tampone del terreno di coltura di mantenere nel limite

2

del possibile il pH a valori fisiologici (pH=7,0- 7,4). Questo è permesso dal fatto che, all’interno

dell’incubatore, il 95% dell’aria corrisponde alla pressione pCO (pressione parziale di anidride

2

carbonica) misurata nei tessuti dei mammiferi, ovvero corrisponde al 5%. Se questa pressione di

CO diminuisce all’interno dell’incubatore l’efficacia del sistema tampone si riduce del 75% in meno

2

di 5 minuti portando ad un pH alcalino (> 7.5);

 mantenere il grado di umidità: ha lo scopo di limitare l’evaporazione del terreno di coltura per non

provocare l’aumento della pressione osmotica del terreno di coltura. Il tasso di umidità è quindi

saturo;

 protezione dalle contaminazioni;

 recupero veloce dei parametri impostati dall’utilizzatore.

CENTRIFUGA

---> permette di recuperare le cellule. All’interno si inseriscono le provette in cui sono contenute le cellule.

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CONDIZIONI CULTURALI

Affinché sia possibile coltivare in vitro le cellule devono essere rispettati i fabbisogni, ed i parametri chimico-

fisici devono essere ottimali per riprodurre le condizioni naturali dell’organismo.

Porre quindi attenzione al ph, temperature, umidità relativa, ossigeno, anidride carbonica, tutti parametri

caratteristici dell’incubatore.

COMPOSIZIONE STANDARD DEL TERRENO DI

COLTURA

TERRENI BASE

Esistono different tipi di terreni base. I vari terreni base differiscono tra loro per il contenuto in amminoacidi

e sali, e per la concentrazione di glucosio. La composizione esatta dei singoli terreni ed il tipo di terreno

adatto per una data linea cellulare viene di solito specificato dalla ditta produttrice.

COSTITUENTI BASE PRESENTI NEI TERRENI

sali inorganici;

carboidrati;

amminoacidi;

vitamine;

acidi grassi e lipidi;

proteine e peptidi;

siero;

antibiotici.

1. SALI INORGANICI

 mantengono l’equilibrio osmotico;

 aiutano a mantenere il potenziale di membrana;

 sono richiesti dalla matrice extracellulare per l’adesione cellulare;

 sono cofattori enzimatici;

 sistema tampone carbonato/bicarbonato, che in presenza di un’atmosfera controllata di 5-10% di

CO è in grado di garantire un pH fisiologico (7.0 e 7.4 ) almeno fino a quando non si verificano

2

variazioni eccessive.

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SISTEMA TAMPONE CARBONATO/BICARBONATO

Il pH può essere stabilizzato su un intervallo di %CO utilizzando una concentrazione appropriata di

2

bicarbonato. Si basa sul Principio di Le Chatelier: quando in una reazione, che si trova in equilibrio, si

modificano i parametri (concentrazione reagenti, prodotti) a causa di un fenomeno esterno, la reazione si

sposta o verso destra (prodotti) o verso sinistra (reagenti) per raggiungere un nuovo equilibrio, ovvero per

minimizzare gli effetti causati dal fenomeno esterno.

L’anidride carbonica allo stato gassoso viene dissolta in stato liquido

3-

(acquoso) dove, reagendo con H O, diventa acido carbonico H CO (la

2 2

reazione è reversibile). L’acido carbonico si dissocia in ione bicarbonato e in

ione idrogeno. Il tamponamento del bicarbonato funziona

attraverso il principio di Le Chatelier: l'aumento

dell'acidità nel mezzo si manifesta con un

+

aumento degli ioni idrogeno (H ); gli ioni

3- +

H CO <---> HCO + H

CO + H O <---> 3-

2 3 bicarbonato liberi (HCO ) reagiscono poi con

2 2 +

gli ioni extra H per formare acido carbonico

(H CO ) e quindi anidride carbonica; in tal

2 3

modo si "sposta la reazione a sinistra", ovvero

aumenta la basicità, e quindi si stabilizza il pH.

L’ incubatore stabilizza il valore di pH nel terreno di coltura +

Analogamente, una diminuzione degli ioni H si

controllando la concentrazione di CO tradurrà in un "spostamento a destra".

2.

In un incubatore umidificato a 37°C, con l’aumento dei livelli di

anidride carbonica in diversi terreni di coltura, ci sono intervalli

di pH teorici differenti.

SISTEMA TAMPONE BICARBONATO/ANIDRIDE CARBONICA

Metaboliti nel terreno --> alterazione del pH --> rallentamento della crescita cellulare --> morte cellulare

E’ quindi essenziale che il pH sia controllato attraverso un sistema tampone ==> sistema tampone

bicarbonato/anidride carbonica.

Il sistema è costituito dal bicarbonato di sodio NaHCO (oppure di potassio), presente in qualità di nutriente

3

del mezzo/terreno (medium), e dall’anidride carbonica presente nell’atmosfera degli incubatori a CO .

2

3- +

CO + H O <---> H CO <---> HCO + H (ioni bicarbonato liberi)

2 2 2 3

+ 3-

NaHCO <---> Na + HCO

3

In pratica: il sistema carbonato/bicarbonato è la base teorica. Il sistema bicarbonato/anidride carbonica è il

sistema effettivo utilizzato nelle colture cellulari, e funziona solo se c’è anidride carbonica esterna (per

questo si utilizza l’incubatore a CO ).

2

Il pH acido del medium viene corretto con la formazione di bicarbonato di sodio (che deriva dall’eccesso di

carbonato).

Il pH alcalino del medium viene corretto con la formazione di ioni carbonato (che si formano a seguito della

ionizzazione dell’acido carbonico derivato a sua volta dalla dissoluzione in acqua della CO ).

2 13

L’equilibrio tra ione bicarbonato e bicarbonato di sodio è mantenuto nel medium di coltura grazie alla

presenza della CO .

2

Il pH è mantenuto tra 7 e 7.4 nel medium di coltura.

COME CAPIRE IL PH DEL TERRENO

Molti medium contengono il rosso fenolo come indicatore di pH. Il colore del mezzo cambia a causa delle

variazioni di pH durante la crescita:

 pH alcalino (>7.6) ---> indicatore con colore rosso-viola;

 pH=7.4 ---> colore rosso-arancio;

 pH=7.0 ---> colore arancio;

 pH=6.5 ---> giallo.

Più in generale:

1. quando il pH è intorno a 7.3 (valore fisiologico)

il colore del terreno è rosso-arancio;

2. a pH acido (6.8-7.0) il colore vira al giallo: con il

proliferare delle cellule il pH del terreno si

acidifica per la produzione di CO da parte del

2

metabolismo il cellulare; il terreno va cambiato;

3. a pH basico (>7.5-7.6) il colore vira al rosso-

viola: tale colorazione indica che le cellule non

sono metabolicamente attive.

Per mantenere le cellule in coltura, e per controllare lo “stato di salute” della coltura, occorre utilizzare il pH

(medium con indicatore).

2. CARBOIDRATI (fonti di carbonio)

 glucosio e galattosio;

 maltosio e fruttosio.

Concentrazione: 1g/l-4.5g/l.

3. AMMINOACIDI

 gli aa essenziali devono essere aggiunti al terreno di crescita;

 le quantità da aggiungere variano dal tipo cellulare con cui si sta lavorando;

 la glutammina è l’aa essenziale più usato nelle colture cellulari. Questo aa è labile pertanto se il

terreno viene conservato a 4°C per tempi più lunghi di 15 giorni è necessario riaggiungere

glutammina al terreno al momento dell’uso.

4. VITAMINE

 le vitamine comunemente contenute nei terreni sono la riboflavina, la t