Biologia cellulare (Colture cellulari - parte della prof.ssa Bernacchioni)

PBSfosfato e potassio fosfato. La soluzione è isotonica e la presenza del tampone fosfato garantisce che il pH sia mantenuto stabile

(Hanks' Balanced Salt Solution): Soluzione salina basato su un tampone carbonato. Possono essere aggiunti alla soluzione glucosio e antibiotici, di norma le soluzioni non sono mezzi nutritivi. I devono essere sterili, nel tempo si è cercato di sostituire i mezzi biologici, che terreni nutritivi costituivano i primi terreni, con componenti a concentrazione nota che permettono la standardizzazione delle condizioni di coltura. A seconda del tipo cellulare sceglieremo un terreno adeguato, in generale i terreni devono avere al loro interno i nutrienti, devono fornire oligoelementi, fattori di crescita, avere un sistema tampone ed essere isotonici. Sono soluzioni tamponate dove sono presenti basi azotate, zuccheri, vitamine, AA, Terreni definiti: molecole organiche ed in più è aggiunto il siero.

L'energia è necessaria per le biosintesi. La concentrazione varia tra 1 g/L (low glucose) e 4.5 g/L (high glucose). Alcuni terreni possono contenere anche galattosio, fruttosio e maltosio.

L'organismo non è in grado di sintetizzare gli amminoacidi essenziali che devono quindi essere aggiunti in coltura. La glutammina (Gln) è richiesta dalla maggior parte delle cellule in quanto costituisce la fonte di azoto per eccellenza nelle colture cellulari. Può inoltre essere utilizzata come fonte energetica per i tipi cellulari con alto ritmo proliferativo. Molte cellule trasformate utilizzano glutammina come fonte energetica e di carbonio, molti terreni hanno una concentrazione tra i 2 e 4 mM. La glutammina viene aggiunta quando viene aperta la bottiglia con il terreno in quanto è instabile nel mezzo di coltura ed ha una emivita di 3-5 giorni a 37 gradi. Nel tempo la glutammina si degrada per questo normalmente viene raggiunta nel terreno dopo circa

3 settimane. - Specialmente del gruppo B, sono necessarie per la crescita e la proliferazione. Nei terreni

Vitamine: sono comunemente presenti tiamina (vitamina B1), riboflavina (vitamina B2), e biotina (vitamina B7), altre vitamine derivano dal siero.

Peptidi, proteine, nucleosidi, intermedi del TCA, acidi grassi, piruvato.

Molecole organiche: Normalmente forniti dal siero vengono aggiunti solo se la concentrazione di siero nel terreno è mantenuta bassa o se vengono usati terreni senza siero.

Ferro, rame, zinco, selenio e manganese sono necessarie come costituenti di

Minerali in traccia: enzimi. Sono in genere già presenti nel siero o come contaminanti nei terreni.

Preferibile non utilizzarli. Gli antibiotici hanno infatti un significativo numero di

Antibiotici: svantaggi:

• Favoriscono lo sviluppo di organismi resistenti all'antibiotico
• Nascondono la presenza di contaminazioni latenti
• Possano nascondere la contaminazione da micoplasmi
• Possano avere effetti

Moderatamente tossici sulle cellule di mammifero. È quindi fortemente raccomandato di non utilizzare antibiotici nelle subcolture di routine, il loro utilizzo dovrebbe essere ristretto alle colture primarie o ad esperimenti che richiedono costi elevati e molto lavoro. Quando utilizzati normalmente si utilizzano penicillina e streptomicina.

Viene solitamente usato ad una percentuale compresa tra il 5% e il 20%. È uno dei componenti più importanti del mezzo di coltura. Spesso è aggiunto ai terreni. Aumenta la capacità tampone delle colture, protegge le membrane e ne garantisce la corretta viscosità. Favorisce la crescita delle cellule.

Proteine importanti per la crescita cellulare: transferrina, essenziale per il metabolismo del ferro; albumina, capace di veicolare vitamine e lipidi poco solubili nel mezzo acquoso; fibronectina o vibronectina, per l'adesione. Colesterolo, acidi grassi, glucocorticoidi ed elementi minerali in tracce.

Fattori di crescita quali PDGF (Platelet Derived Growth Factor), EGF (Epidermal Growth Factor), IGF (Insulin-like Growth Factor)- Favorisce l'adesione- Contiene inibitori della tripsina (α1-antitripsina)- Modulazione della viscosità, importante quando si devono distaccare le cellule in quanto la viscosità del mezzo riduce i danni della manipolazione- Il complemento, indispensabile per lo svolgimento di reazioni antigene-anticorpo. Spesso è necessario inattivare il complemento perché potrebbe interferire nelle indagini cellulari (sieroscomplementato si ottiene incubando il siero a 56°C per 30 min) i sieri di uso più comune nelle colture cellulari sono:

• (Fetal Bovine Serum) è il più utilizzato poiché contiene meno anticorpi e una concentrazione più elevata di fattori di crescita
• (Horse Serum) presenta spesso meno variabilità tra lotti differenti. Presenta molti meno fattori di crescita

da donatori, usato soprattutto nelle colture di linfociti. Necessita di uno screening Siero umano accurato per virus quali HIV ed epatite B. Quando comprati viene garantita sempre la qualità del siero.

Controllo di qualità del siero:

• Analisi chimico-fisica
  • Osmolarità
  • pH
  • Profilo elettroforetico
  • Livello di emoglobina
  • Proteine totali
• Test Microbiologici
  • Assenza di contaminazione da batteri e funghi
  • Assenza di contaminazione da micoplasma
  • Assenza di contaminazione virale

Gli svantaggi nell'uso del siero:

• Contaminazioni
• Anticorpi
• (difficile standardizzazione dei risultati). Possono inoltre essere presenti fattori
• Variabilità tra lotti di crescita che favoriscono lo sviluppo di alcune cellule rispetto ad altri tipi cellulari

Questo rende difficile talvolta standardizzare gli esperimenti, quello che si fa è quindi comprare uno stesso lotto per un esperimento.

Tuttavia, la sostituzione del siero implica l'aggiunta di

ridotta a pH maggiori di 7.7 e pH minori di 6.5; valori di pH sopra 7.8 e sotto 6.0 causano rapidamente la morte cellulare. Il sistema tampone, quindi, è necessario per manipolare le cellule al fine di rendere il sistema tampone efficiente, tramite cambi del terreno ad esempio.

Nei terreni di coltura viene spesso aggiunto un indicatore di pH, il cui colore è:

• Viola a pH = 7.8
• Rosa-rosso a pH = 7.6
• Rosso a pH = 7.4
• Arancio a pH = 7.0
• Giallo a pH = 6.5
• Giallo limone a pH < 6.5

Il viraggio al giallo indica un acidificazione dovuta a prodotti del metabolismo cellulare; il viraggio al violetto indica alcalinizzazione dovuta a perdita di CO2.

La richiesta di un sistema tampone nel mezzo di coltura è dovuta a due condizioni:

1. Le cellule in crescita producono CO2 e acido lattico provocando una diminuzione del pH.
2. La CO2 dissolta passa nella fase gassosa dai contenitori ventilati (piastre Petri e multipozzetto) e provoca un

innalzamento del pH. Il più comune sistema tampone è rappresentato dal sistema tampone bicarbonato-acido carbonico, 24mM). Si forma così un sistema tampone con la CO2 disciolta: (di solito viene aggiunto NaHCO3 in soluzione acquosa il bicarbonato di sodio si dissocia, lo ione bicarbonato tende poi a riassociarsi con il suo acido debole producendo ioni ossidrile e formando acido carbonico. L'acido carbonico si dissocia poi in acqua e CO2, quindi alla fine otteniamo ioni sodio, ione ossidrile, acqua e CO2. La CO2 sarebbe persa in atmosfera, per cui la reazione sarebbe sbilanciata verso i prodotti e si formerebbero molti ioni ossidrile facendo divenire il pH sempre più basico. Proprio per questo motivo è fondamentale l'incubatore con una concentrazione di CO2 molto maggiore rispetto a quella atmosferica, permette quindi di bilanciare la reazione riportandola verso sinistra impedendo la formazione di ioni ossidrile dal mezzo di coltura porterebbe