Istologia e citologia

Istologia

Lo studio delle cellule e dei tessuti mediante l’uso dei microscopi.

Molecole biologiche

L’acqua è una molecola fortemente polare, quindi forma legami idrogeno con altre molecole polari. I legami idrogeno sono legami intermolecolari deboli (ma non tanto). L’acqua è molto importante all’interno dell’organismo, in quanto svolge diverse funzioni:

• Partecipa al bilancio idrico dell’organismo insieme ai sali minerali.
• Partecipa all’eliminazione delle sostanze tossiche attraverso le urine e le ghiandole sudoripare.
• Funge da mezzo di regolazione della temperatura, in quanto l’uomo è un organismo omeotermo (deve mantenere costante la sua temperatura).

Anche i sali minerali svolgono una funzione molto importante all’interno dell’organismo. Ad esempio sodio (Na⁺), potassio (K⁺) e cloro (Cl^-) hanno a che fare con la regolazione della permeabilità della membrana plasmatica. Invece il calcio (Ca²⁺), oltre ad essere contenuto nelle ossa e nei denti, permette la contrazione muscolare, l’eccitabilità dei neuroni, la trasmissione dell’impulso nervoso e la coagulazione del sangue. Quindi il calcio deve essere uno ione molto controllato, in modo da poter essere reclutato in qualsiasi momento dal tessuto osseo (in cui è conservato).

Inoltre ci sono anche altri ioni importanti:

• Ione fosfato (PO₄^3-): si lega al calcio per formare il fosfato di calcio contenuto nelle ossa. Inoltre permette la formazione di legami ad alta energia (è un componente dell’ATP), forma i fosfolipidi di membrana.
• Ione bicarbonato (HCO₃^-): partecipa alle soluzioni tampone.
• Ione solfato (SO₃^2-): regola i rapporti tra molecole.

Oltre alle classiche classi di sostanze biologiche presenti nell’organismo (carboidrati, proteine, lipidi e acidi nucleici), sono presenti anche delle forme molecolari che sono un intermedio tra le proteine e i glucidi, oppure un intermedio tra i glucidi e i lipidi:

• Glicoproteine: composte da proteine e lipidi. Hanno piccole dimensioni.
• Proteoglicani: composti da proteine e lipidi. Hanno dimensioni molto grandi.
• Glicolipidi: presenti all’interno delle membrane cellulari. Hanno dei gruppi glucidici.

Le proteine rappresentano molecole con funzioni molto importanti, ad esempio l’emoglobina la quale ha la funzione di trasportare l’ossigeno molecolare dai polmoni a tutti i distretti dell’organismo. L’emoglobina si chiama cromoproteina tetramerica (“cromo” perché conferisce la colorazione rossa al sangue, “tetramerica” perché è formata da quattro subunità). Oltre all’emoglobina, facente parte della classe delle proteine trasportatrici, esistono anche altri tipi di proteine come gli enzimi o le proteine contrattili, ossia macromolecole con una determinata struttura adatta a far contrarre la muscolatura. Anche gli anticorpi sono formati da proteine. Esistono anche gli ormoni proteici (ad esempio l’insulina) e proteine strutturali, sia intracellulari che extracellulari. Le proteine strutturali sono ad esempio il collagene, ossia la proteina più abbondante nel nostro organismo, che conferisce resistenza, oppure le cheratine, anch’esse molto abbondanti, che costituiscono peli, capelli e le unghie. Un’altra proteina importante è il fibrinogeno, ossia una proteina che partecipa alla coagulazione del sangue e si trova nel plasma.

Carboidrati

I carboidrati, o glucidi, o zuccheri, sono presenti sia nella loro forma classica sia modificati; quindi possono essere monosaccaridi, disaccaridi, oligosaccaridi e polisaccaridi. Un esempio di polisaccaride è il glicogeno, ossia quel polimero del glucosio che viene immagazzinato, soprattutto in certi organi (fegato e muscolatura), in modo da essere conservato come riserva di glucosio. I glicosamminoglicani (GAG), invece, sono glucidi modificati in quanto presentano dei gruppi amminici o carbossilici che li contraddistinguono e li conferiscono una grande variabilità.

Lipidi

I lipidi hanno varie funzioni; ad esempio, il colesterolo presente nella membrana plasmatica ha la funzione di regolare la fluidità della membrana stessa. Quindi la scarsa presenza di colesterolo determinerà un’elevata fluidità della membrana, mentre un’abbondante presenza di colesterolo aumenterà la rigidità della membrana (ad esempio nelle membrane dei globuli rossi o le zone della membrana in cui sono presenti zattere lipidiche). Solitamente i lipidi sono molecole apolari, invece il colesterolo, presentando un gruppo OH, è una molecola polare, seppur una piccola parte della sua molecola.

Acidi nucleici

Il DNA è presente nel nucleo e nei mitocondri, mentre l’RNA si trova sia nel nucleo, che nei mitocondri, che nel citosol. Infatti l’RNA nel citosol deve svolgere tutte le funzioni che riguardano la sintesi proteica.

Membrane cellulari

Le membrane cellulari sono semipermeabili, hanno tra le varie funzioni quella di modulare gli scambi. Quando abbiamo un contenitore diviso in due compartimenti separati da una membrana semipermeabile, che lascia passare le molecole d'acqua, e a sinistra mettiamo una soluzione salina più concentrata rispetto a quella di destra, quello che succede è che per controbilanciare questa differenza di concentrazione salina, l'acqua penetra nel compartimento di sinistra per equilibrare la propria concentrazione tra i due spazi. Passando dalla soluzione ipotonica a quella ipertonica, essa provoca un aumento della pressione idrostatica, definita pressione osmotica. Ci occupiamo di ciò perché i globuli rossi, se vengono sottoposti a variazione di pressione osmotica, essendo molto sensibili, modificano anche drammaticamente la loro forma, cosa che non va bene. Per questo nel sangue abbiamo dei sistemi tampone tali che certe variazioni di concentrazioni e di pH possano essere controbilanciate. Il globulo rosso normale in soluzione ipotonica, ad esempio acqua distillata (con cui assolutamente non si può fare una flebo ad un paziente; di solito si usa invece una soluzione salina di 0,9%) assume acqua fino a rigonfiarsi e scoppiare. La stessa cosa succede se metto del sangue in un bicchiere d'acqua, essa si colora di rosa perché penetra nei globuli rossi fino a farli scoppiare. Invece quando mettiamo un globulo rosso in una soluzione ipertonica, succede che è esso stesso a buttare fuori l'acqua, diventando così un echinocita: è così si chiamano i globuli rossi che perdono la loro forma e invece sviluppano delle punte, raggrinzendosi. Dunque in tutti i casi le nostre cellule devono mantenere un equilibrio con l'ambiente circostante.

Tecniche di microscopia

L’istologia si occupa di analizzare i tessuti a livello microscopico, quindi bisogna poter osservare quello che l’occhio nudo non può vedere. Infatti tutto ciò che riguarda i tessuti osservabili dall’uomo rientra nel campo dell’anatomia macro (infatti esiste anche un’anatomia micro). Il microscopio ottico riesce a dare un’ottima immagine dei tessuti, tuttavia arriva solo ad un certo punto dell’ingrandimento. Ogni tipo di microscopio prevede una preparazione dei campioni specifica.

Per l’anatomia macro si ha a che fare con mm, cm, ecc., infatti il potere risolutivo dell’occhio nudo è circa 200 μm. Invece nella dimensione microscopica del microscopio ottico si ha a che fare soprattutto con i μm ma anche con i mm e i cm. Quando si va invece ad osservare l’ultrastruttura, ossia quando si va ad osservare le cellule al microscopio elettronico a trasmissione (TEM), si ha a che fare con il nm.

L’istologia in particolare si occupa di analizzare i livelli di organizzazione: si parte dagli atomi per arrivare a molecole di piccole dimensioni che si possono organizzare tra di loro a formare delle macromolecole che possono stare dentro o fuori le cellule. Queste ultime poi si organizzano a formare i tessuti, i tessuti formano gli organi e gli organi formano gli apparati. I tessuti si formano durante lo sviluppo embrionale, in particolare un embrione alla terza settimana di sviluppo è fatto da tre foglietti: l’ectoderma, il mesoderma e l’endoderma. Da questi tre foglietti si origineranno i tessuti più diversi.

La cellula che farà da riferimento come dimensione, il globulo rosso, ha circa 8 μm³. Tuttavia le dimensioni dei vari tipi cellulari cambiano molto, ad esempio una cellula adiposa ha circa 150 μm³.

I tre microscopi più utilizzati in istologia

• Microscopio ottico: con potere di risoluzione fino a 200 nm.
• Microscopio elettronico a trasmissione (TEM): “trasmissione” significa che un fascio di elettroni deve attraversare il campione per poi proiettare un’immagine su uno schermo fluorescente.
• Microscopio elettronico a scansione (SEM).

Nel microscopio ottico c’è una base al livello della quale c’è una fonte di energia, una lampadina a luce bianca a basso voltaggio, che emette un raggio di luce che poi viene riflesso con uno specchio in una zona dove viene posto il vetrino. Inoltre c’è un sistema di lenti, le lenti del condensatore, che condensano questo fascio di luce sul campione in una piccola zona; poi il campione viene attraversato ed il raggio di luce viene immesso nel sistema di lenti dell’obiettivo (ci possono essere più obiettivi). Sempre grazie a degli specchi, il fascio di luce viene deviato dentro il tubo dell’obiettivo che ha alla sua estremità, in contatto con il nostro occhio, un altro sistema di lenti, l’oculare. Moltiplicando l’ingrandimento della lente dell’obiettivo con quello dell’oculare, si ottiene l’ingrandimento definitivo del campione. Di solito l’oculare è un 10X.

Il potere di risoluzione è un concetto che ha a che fare con la definizione dell’immagine ed è una distanza data da: 1/d = 2λ/NA, dove NA è l’apertura numerica della lente del microscopio. Il potere di risoluzione è la distanza alla quale si riescono ad osservare due punti vicini come distinti tra loro; più piccola è questa distanza e più grande è il potere di risoluzione.

Per quanto riguarda i microscopi, il potere di risoluzione ha a che fare con la lunghezza d’onda della fonte di energia utilizzate. Per il microscopio ottico e il TEM, si ha a che fare con fonti d’energia completamente diverse: nel primo caso la luce bianca (luce visibile) mentre nel secondo caso gli elettroni. La lunghezza d’onda della luce visibile è molto più grande della lunghezza d’onda associata all’elettrone, quindi con il TEM si può avere un altissimo potere di risoluzione.

Si può anche variare l’apertura numerica del microscopio; questa grandezza ha a che fare con l’obiettivo. Se la lente dell’obiettivo si avvicina molto al campione, l’angolo ossia il semicono della luce che attraversa la lente, diventa sempre più grande. Quindi gli obiettivi ad alto ingrandimento sono quelli che si avvicinano molto al vetrino (NA diventa quasi di 90° e quindi NA=1).

Il potere di risoluzione si può lavorare anche sull’indice di rifrazione della sostanza (N) interposta tra la lente frontale dell’obiettivo e il vetrino. Esistono infatti anche degli obiettivi ad immersione. In questo caso si utilizza una goccia d’olio per aumentare appunto il valore di N:

• N = 1 quando la sostanza interposta è l’aria.
• N = 1,3 quando la sostanza è l’acqua.
• N = 1,5 quando la sostanza è l’olio.

L’istologia si occupa di studiare le cellule e i tessuti; questo studio è anche pertinenza della biochimica. Tuttavia in uno studio istologico, a differenza di uno biochimico, i tessuti devono essere conservati per poterli osservare al microscopio. Quindi, subito dopo aver prelevato un tessuto, bisogna fissarlo e solitamente, per poter fare ciò, si trattano i campioni con delle molecole come le aldeidi (formaldeidi, paraformaldeide e la glutaraldeide) che creano dei ponti tra le molecole, in maniera da costruire un reticolo insolubile che mantenga le strutture cellulari così com’erano in vivo. La glutaraldeide e la paraformaldeide sono forme più purificate rispetto alla formaldeide.

Il campione può quindi essere studiato direttamente, senza coloranti oppure usando dei coloranti non o poco tossici, tuttavia in questo caso i campioni non durano nel tempo. Invece si possono creare dei campioni permanenti. Il microscopio ottico ha un limite di risoluzione piuttosto piccolo; per questo i campioni utilizzati con questo microscopio hanno bisogno di essere colorati artificialmente. Si possono utilizzare diverse colorazioni; la colorazione più diffusa si chiama ematossilina – eosina.

Si definiscono microtomi, degli strumenti dove vengono posizionati dei blocchetti di paraffina con l’organo incluso e questi vengono tagliati con qualche μm di spessore. La paraffina, essendo una miscela di idrocarburi, non è miscibile con l’acqua; quindi bisogna estrarre completamente l’acqua dal tessuto che è stato precedentemente fissato e che si vuole porre nel blocchetto di paraffina. Inoltre bisogna ricordare che il campione è fissato in una soluzione acquosa, quindi anche il fissativo è nell’acqua e il campione è ricco d’acqua. Per fare questo si utilizza l’alcol etilico a concentrazione crescente.

Successivamente, per preparare il campione ad essere imbevuto nella paraffina, bisogna passarlo in un solvente organico adatto, ad esempio lo xilolo. In questo modo tutto l’alcol presente nel campione viene sostituito con lo xilolo. A questo punto il campione viene inserito in un contenitore con della paraffina fusa, in una stufa sottovuoto, e dopodiché il campione viene esposto all’aria e viene fatto solidificare. A questo punto i blocchi finiti vengono tagliati con i microtomi. Esistono vari tipi di microtomi: a rotazione, a slitta, a congelazione (criostato). Quest’ultimo permette di congelare il campione senza utilizzare la paraffina in quanto, essendosi raffreddato, può essere tagliato. Questo sistema permette di dare risposte più veloci seppur meno chiare.

I campioni devono essere colorati: c’è bisogno di un colorante acido e di uno basico in modo da distinguere le diverse strutture presenti nel campione. L’esempio più importante di colorante basico è l’ematossilina, ma altri coloranti basici sono il blu di metilene e il blu di toluidina. Questi sono coloranti di un colore viola scuro o blu scuro che colorano le sostanze acide, soprattutto DNA (quindi il nucleo) ma anche l’RNA (i ribosomi). Quindi nel caso di cellule ricche di ribosomi il citoplasma si colorerà di viola scuro (citoplasma basofilo). I coloranti acidi, come l’eosina o l’orange, reagiscono per lo più con sostanze basiche e di solito colorano il citoplasma di colore rosa.

Nei neuroni la colorazione è inversa, infatti il citoplasma è basofilo e un nucleo molto chiaro. Questo è dovuto al fatto che i neuroni sono delle cellule perenni, quindi non si possono dividere; per questo motivo devono mantenersi efficienti per tutta la vita. Di conseguenza producono continuamente proteine, per questo motivo il nucleo presenta una cromatina despiralizzata ed il citoplasma pieno di ribosomi.

Talvolta bisogna osservare delle cellule senza colorarle, di conseguenza non si riesce ad osservare quasi nulla. Quindi esistono dei dispositivi, i microscopi a contrasto di fase e i microscopi a interferenza, che aumentano il contrasto delle strutture. Questa situazione si crea nel momento in cui bisogna osservare cellule vive.

I microscopi a fluorescenza utilizzano radiazioni ultraviolette, in particolare dell’ultravioletto lungo (3.000 – 4.000 Å di lunghezza d’onda). Queste radiazioni sono emesse da fonti laser e vanno a colpire il campione. Se il campione è dotato di autofluorescenza, emetterà una luce nel campo del visibile; se il campione non ha questa caratteristica, deve essere marcato con delle molecole fluorescenti. I microscopi confocali sono particolari tipi di microscopi a fluorescenza molto evoluti che preleva punto per punto le immagini del campione quindi le immagini sono molto più definite.

Il TEM è costituito da un tubo all’interno del quale corre un fascio di elettroni che viene generato da un filamento di tungsteno. Quindi il sistema è rovesciato rispetto al microscopio ottico. Tuttavia ci sono delle analogie con quest’ultimo: anche nel TEM ci sono un insieme lenti che però non sono ottiche, ma elettromagnetiche. Il filamento di tungsteno viene riscaldato facendo passare una corrente elettrica ed emette degli elettroni che vengono condensati in un fascio che attraversa prima di tutto delle lenti del condensatore. Dopodiché ci sono un’altra di serie di lenti che sono dei solenoidi e poi ci sono le lenti di proiezione che allargano l’immagine che si crea sullo schermo fluorescente. Sotto è presente una macchina fotografica.

Le immagini che si possono vedere sono in bianco e nero. Questo è dovuto al fatto che si crea un contrasto dell’immagine in quanto il raggio che attraversa il campione non è in grado di fornire dei colori. Questi possono essere aggiunti artificialmente solo in seguito attraverso il computer. L’immagine del campione si crea grazie ad una preparazione precedente del campione in grado di far depositare degli atomi pesanti attraverso un trattamento con sali di piombo e uranio che si depositeranno selettivamente sulle strutture. Dove le strutture sono più dense saranno più scure e dove le strutture sono più lasse saranno più chiare. Prima ancora viene utilizzata una sostanza fortemente ossidante, il tetrossido d’osmio, ossia una sostanza pesante che si deposita sulle strutture cellulari.