Citologia, Istologia, Embriologia - Appunti

Citologia

La citologia è la scienza che studia la cellula, cioè l'unità biologica elementare. La cellula è delimitata da una membrana plasmatica in cui c'è il protoplasma (sistema di molecole organiche e inorganiche di diversa complessità) e manifesta le attività vitali di base, cioè:

• Assimilazione di materiale ed energia
• Metabolismo
• Adattamento all'ambiente
• Differenziazione
• Riproduzione

Il nome “cellula” fu attribuito da Robert Hooke mentre studiava le cellette che compongono il sughero al microscopio.

Tipi di cellule

Le cellule possono essere:

• Eucariotiche: hanno il DNA racchiuso da un involucro nucleare, una vita di relazione che prevede scambi reciproci e si organizzano in strutture pluricellulari.
• Procariotiche: hanno una membrana che delimita il protoplasma con il DNA non isolato.

Secondo la teoria cellulare, tutte le cellule si originano da una cellula preesistente.

Tessuti e struttura dell'organismo

Un tessuto è un insieme di cellule che hanno generalmente la stessa origine embriologica e che lavorano in modo coordinato e integrato, collaborando per una funzione finale.

Cellule → Tessuti → Organi → Apparati → Organismo

Inizialmente i tessuti erano considerati 20, ma poi si sono riconosciute caratteristiche comuni a molti di essi ed ora se ne considerano 4:

• Tessuto epiteliale: ha cellule molto vicine tra loro.
• Tessuto connettivo: è formato da poche cellule e tanta sostanza intercellulare.
• Tessuto muscolare: ha cellule plurinucleate molto lunghe per permettere la contrazione muscolare.
• Tessuto nervoso: presenta fitti prolungamenti attorno al nucleo necessari per la comunicazione.

Composizione e caratteristiche delle cellule

Le cellule sono fatte prevalentemente di acqua (80-85% circa), lipidi, zuccheri, proteine e acidi nucleici, ma non esistono due cellule identiche tra loro, quindi si considera una “cellula Micron (µm) 1/1000 di mm tipo” in interfase.

Metodi di studio delle cellule e dei tessuti

Nello studio delle cellule vengono usati i Nanometro (nm) 1/1000 di µm come unità di misura: Angstrom (Å) 1/10 di nm.

I metodi di studio delle cellule e dei tessuti sono due e devono essere integrati per un'indagine più accurata:

• Biochimico: bisogna prelevare un tessuto e romperlo in frammenti (omogeneizzazione). Rileva le componenti chimiche e dà informazioni sui rapporti quantitativi e qualitativi delle molecole, non fornisce informazioni sulla localizzazione.
• Morfologico:
  • Osservazione diretta di cellule e tessuti viventi: si fa con telecamere in b/n e non dà chiarezza sui dettagli. Si può anche osservare una coltura (di cellule o di tessuti) per vederne l'evoluzione ed il comportamento.
  • Osservazione di preparati stabili (fissazione): avviene secondo alcune fasi:
    • Prelievo
    • Fissazione (fisica o chimica)
    • Disidratazione
    • Inclusione
    • Taglio
    • Sparaffinamento
    • Reidratazione
    • Colorazione
    • Esame a microscopio

Fissazione fisica e chimica

La fissazione fisica può avvenire in due modi:

• Essiccamento: ad esempio lo striscio di sangue, ottenuto prelevando una goccia e facendola strisciare fra due vetrini per allontanare fra loro le cellule.
• Congelamento: viene usato in sala operatoria perché è molto rapido. Adopera un criostato con un crioprotettore per evitare la formazione di cristalli. Non è adatta per la microscopia elettronica e può modificare lievemente il tessuto (artefatti).

La fissazione chimica rende le strutture insolubili, ma non esiste un unico fissativo perfetto per tutte le esigenze. Si può iniettare direttamente (perfusione), ma l'animale muore e quindi è preferibile immettere un campione nel fissativo. I fissativi chimici sono di due tipi:

• Coagulanti: più rapidi e penetranti, addensano la cromatina (ad esempio alcol etilico, acido acetico, acido picrico).
• Non coagulanti: formano reticolati e mantengono la posizione (ad esempio formalina ed acido osmico).

Dopo la fissazione è necessario sezionare il campione, poiché esso va guardato per trasparenza. È quindi necessario fare le inclusioni con la paraffina, che però è insolubile in acqua. Dunque si effettua prima una disidratazione, che non deforma la cellula se avviene gradualmente, cioè immergendo il campione in una serie di alcoli a gradazione crescente. La paraffina viene poi immessa liquida (alta temperatura) e lasciata solidificare in un blocco. In seguito il blocco viene sezionato con un microtomo (sezioni di 3-10 µm) ed è necessario effettuare uno sparaffinamento con il silene per poter usare il colorante in soluzione acquosa. Si fa poi il procedimento inverso alla disidratazione, immergendo in alcoli dalla gradazione decrescente fino all'acqua.

Coloranti e tecniche di colorazione

I coloranti sono di diversi tipi a seconda delle esigenze:

• Naturali: ad esempio ematossilina e cocciniglia.
• Artificiali (la maggior parte).

Inoltre nella cellula rimangono esposte cariche positive e negative quindi è necessario che i coloranti siano acidi o basici:

• Basici: si legano agli acidi nucleici (detti basofili per la loro affinità col colorante).
• Acidi: si legano alla maggior parte del citoplasma, in particolare alle strutture acidofile (ad esempio il collagene).

La miscela di colorante acido+basico più frequente è l'ematossilina-eosina (E-E), con sfumature rosa/violetto. Una tricromica, più dettagliata, è per esempio ematossilina-blu di anilina-eosina.

Casi particolari di colorazione

Metacromasia: alcuni coloranti basici interagiscono con particolari strutture nei tessuti, ad esempio gruppi solfato o GAG, cambiando colore dal blu caratteristico a rosso.

Reazione PAS (con acido periodico e poi reattivo di Schiff): serve per localizzare le macromolecole ricche di carboidrati. Prima si usa l'acido periodico che evidenzia i gruppi aldeidici e poi il reattivo di Schiff che passa da incolore a rosso verificando la presenza di cellule positive alla reazione (glicogeno o glicoproteine). Una parte della cellula è otticamente vuota quando non presenta strutture in grado di fissarsi con il colorante. Si può verificare che in realtà essa contiene glicogeno usando la reazione PAS.

Istochimica ed immunocitocimica: sono procedure che forniscono informazioni sulla funzione delle cellule e sulle componenti extracellulari di un tessuto. Un antigene è una molecola che determina la formazione di un anticorpo altamente specifico. Per capire se in una cellula c'è un componente (ad esempio l'actina), prelevo quest'ultima e la immetto in un animale, che produce il relativo anticorpo. Rendo gli anticorpi fluorescenti e li pongo nella cellula in indagine: se essa si colora contiene actina.

Microscopi

Microscopio ottico (o luce): convoglia un fascio di luce tramite un sistema di lenti, detto condensatore, e la ottimizza in modo che vada sul preparato. Vi sono obiettivi diversi con diversa capacità di ingrandimento, che possono ruotare grazie a un revolver. L'immagine viene poi ingrandita ulteriormente di 10x dall'oculare. L'immagine vista dalla lente appare capovolta. Vi sono due manopole per la messa a fuoco, ma si può fochettare anche per osservare strutture a diversa profondità nella sezione. Il potere di risoluzione è la capacità di mostrare come distinti due punti estremamente vicini. Ris= λ / 2n sinα con: λ=lunghezza d'onda della luce (0,53 µm), n=indice di rifrazione del mezzo (1), α=angolo del cono di luce raccolto (sinα ≈ 1). La dipendenza da n fa sì che con l'olio a immersione aumenti la risoluzione, anche se si perde profondità.

Microscopio a contrasto di fase: si usa con cellule vive e non colorate che presentano al loro interno una densità variabile. Questo microscopio fa corrispondere alla differenza tra le fasi una diversa ampiezza della luce, dando zone più o meno luminose.

Microscopio a luce polarizzata: serve per analizzare la birifrangenza dei composti anisotropi.

Microscopio elettronico a trasmissione (TEM): è alto circa 2,5 m ed usa un fascio di elettroni accelerato emesso da un catodo. È poco penetrante (λ=0,004 nm). Delle bobine creano campi magnetici che indirizzano il fascio come dei condensatori, mentre delle altre bobine lo proiettano su di uno schermo fluorescente protetto da un vetro a tenuta di alto vuoto. Lo schermo si illumina e l'immagine assume tonalità bianca/grigio/nera a seconda della capacità o meno di far passare gli elettroni (ad esempio le membrane appaiono nere perché opache agli elettroni). Per ottenere un preparato adatto al TEM bisogna seguire una particolare procedura: riduzione del prelievo a 1-2 mm, fissazione (ad esempio con glutaraldeide o tetrossidato di osmio), disidratazione, inclusione con una “sostanza ponte” in resina possidica immiscibile all'acqua, taglio con un supporto porta-preparato ed un ultramicrotomo con binoculare e lama di diamante, pescaggio delle sezioni con una reticella di rame (ø=3mm), contrasto con sali di piombo.

Microscopio elettronico a scansione (SEM): usa un fascio di elettroni che incidono sul preparato e non lo attraversano, quindi dà un'idea tridimensionale della superficie. Le cellule non sono sezionate, vengono disidratate e rese conduttrici in superficie con l'evaporizzazione di platino. Si crea quindi un fascio di elettroni secondari (respinti) che vengono catturati da un rilevatore e convertiti in immagini.

Forma e dimensioni delle cellule

C'è una grande variabilità delle forme cellulari in relazione al compito specifico, che si rende evidente nel differenziamento cellulare. Rapporto nucleoplasmatico N/C: in un tessuto tendono a mantenersi la forma ed il rapporto fra il volume del nucleo e quello del citoplasma (tranne durante la riproduzione). N/C= costante.

• N/C basso: cellule differenziate (ad esempio neuroni o fibre muscolari).
• N/C elevato: cellule con elevata capacità di sintesi o moltiplicazione (ad esempio le cellule del tessuto epiteliale).

Il rapporto viene rispettato anche nelle cellule polinucleate, in cui ogni nucleo controlla una porzione di citoplasma. Queste cellule possono essere di due tipi:

• Sincizi: cellule molto voluminose date dalla fusione di singoli elementi cellulari (ad esempio la fibra muscolare striata scheletrica).
• Plasmodi: una cellula comincia a dividersi, il citoplasma aumenta ma non c'è citodieresi (ad esempio il megacariocita).

Legge di Driesh o delle grandezze cellulari: cellule omologhe di individui della stessa specie o di specie affini hanno grandezze pressoché costanti.

Legge di Levi: i neuroni fanno eccezione alla legge di Driesh perché il loro volume è proporzionale al territorio di innervazione.

Membrana plasmatica

La membrana plasmatica è una struttura che delimita la cellula non osservabile al microscopio ottico. Fu quindi solo intuita dai ricercatori in base ad alcuni esperimenti. Rende la cellula un'individualità biologica ed ha una struttura comune a quella che delimita gli organelli, per cui permette l'esecuzione di reazioni chimiche in modo isolato dall'ambiente esterno.

Caratteristiche:

• Semipermeabilità
• Controllo degli scambi interno-esterno
• Funzione regolativa (enzimatica)
• Risposta agli ormoni
• Controllo delle moltiplicazioni delle cellule
• Proprietà antigeniche
• Controllo delle interazioni cellulari (riconoscimento)

Gli studi furono possibili grazie soprattutto alla semipermeabilità, poiché si notò che:

• In ambiente isotonico la cellula mantiene costante gli scambi
• In ambiente ipertonico l'acqua esce dalla cellula ed essa raggrinzisce
• In ambiente ipotonico l'acqua entra fino all'esplosione della cellula

Studi biochimici hanno permesso di conoscere la composizione della membrana:

• Lipidi ≈40%
• Proteine ≈57-63%
• Carboidrati ≈2-10%

Composizione e struttura della membrana

I lipidi sono bipolari o anfipatici, perché hanno un'estremità idrofila (testa) ed una idrofoba (coda). Se immessi in acqua si dispongono in micelle, se invece si trovano come film a separare due ambienti acquosi si dispongono con le teste idrofile verso l'acqua e le code idrofobe verso l'interno, formando quindi un doppio strato.

Le proteine sono di tipo globulare e disposte non in uno strato continuo sui lipidi (proteine dislocate). I carboidrati sono legati o alle proteine (glicoproteine) o alle teste dei lipidi (glicolipidi). Si trovano esclusivamente sulla faccia di membrana esterna.

Per separare le due facce della doppia membrana si usa la criofrattura: le cellule vengono congelate e fratturate con una lama fredda nel punto che oppone meno resistenza, cioè l'incontro delle code idrofobe. Si ottengono così:

• Faccia E: rivolta verso l'esterno
• Faccia P: rivolta verso l'interno

Si fa poi una replica, cioè le due facce vengono spolverizzate con il platino in modo inclinato per ottenere un'impronta ombreggiata, da cui viene tolta la componente cellulare. Al microscopio elettronico si vedono delle protrusioni bianche, che sono le proteine; la prova si fa usando la proteasi (un enzima che attacca le proteine) e vedendo che il campione diventa nero.

Tipi di lipidi

I fosfolipidi possono essere glicerofosfolipidi (glicerolo) o sfingolipidi (sfingosina) a seconda del gruppo chimico che compone la testa. Sono formati da una testa polare (con un gruppo fosforico) e da due code apolari. Le code possono essere sature o insature: la presenza dei doppi legami determina la fluidità della membrana a 37°C (ha la consistenza di un olio abbastanza leggero).

• I fosfolipidi possono spostarsi:
  • Lateralmente: diffusione laterale, la più frequente
  • Esterno-interno: flip-flop, molto raro
• Il colesterolo contiene una piccolissima parte polare, ha una struttura che determina una maggiore viscosità nella membrana. La presenza di colesterolo è diversa nelle cellule a seconda della necessità di movimento.
• I glicolipidi si trovano solo nel versante extracellulare e presentano due code idrofobe con una piccola catena oligosaccaridica idrofila.

Tipi di proteine e carboidrati

Proteine: Sono maggiori in peso ma numericamente inferiori ai lipidi. Hanno un diverso grado di interazione con il doppio film:

• Estrinseche (periferiche): sono solo appoggiate, legate alle teste polari con legami elettrostatici deboli. La cellula le usa per modificare la sua composizione proteica.
• Intrinseche (integrali o costitutive): attraversano il doppio film ed hanno legami molto forti con i lipidi. Presentano due estremità idrofiliche con cariche ed una parte idrofoba centrale.

Le proteine possono muoversi nel film lipidico e possono essere legate a strutture citoscheletriche che contribuiscono allo spostamento. Sono sempre proteine globulari.

Carboidrati:

• Sono responsabili dell'asimmetria della membrana
• Sono antigeni
• Sono recettori ormonali o per farmaci
• Riconoscono specificamente dei ligandi (attivando gli enzimi)
• Riconoscono le cellule
• Regolano la crescita e la divisione cellulare

La membrana plasmatica ha uno spessore di 7,5 – 10 nm.

• Testa 2 nm
• Code 3,5 nm
• Testa 2 nm

Funzioni della membrana plasmatica

Le funzioni della membrana plasmatica sono:

• Funzione recettoriale e coinvolgimento nella risposta agli ormoni: trasduzione del segnale in seguito al legame con un ligando (grazie alle glicoproteine)
• Controllo della moltiplicazione cellulare grazie all'inibizione da contatto
• Riconoscimento e adesione cellulare
• Proprietà antigeniche, ad esempio la determinazione dei gruppi sanguigni
• Controllo degli scambi esterno-interno, con i metodi di trasporto

Tipi di trasporti

I trasporti possono essere di due tipi:

• Semplici (passivi): sono legati al trasporto senza consumo di energia per gradiente di concentrazione, poiché la cellula si comporta da osmometro.
  • Diffusione semplice: il trasporto di acqua è agevolato dalla presenza di proteine intrinseche della membrana che hanno un polo polare (le acquaporine), altrimenti non potrebbe interagire con le code apolari.
  • Diffusione facilitata: sfrutta delle proteine transmembrana dette permeasi o carriers con un sito specifico per la sostanza da trasportare (ad esempio glucosio o un amminoacido).
• Attivi: richiedono un dispendio energetico sotto forma di ATP. C'è dunque una proteina detta ATPasi nel versante intracellulare che idrolizza l'ATP in ADP + P. Sono coinvolti dei carriers, nei quali si crea un legame specifico che cambia la configurazione sterica facendo perdere l'affinità con la sostanza da trasportare, che viene quindi liberata nell'altro versante. Le sostanze vengono trasportate contro gradiente di concentrazione o elettrochimico.
  • Pompa sodio/potassio: trasporta il Na⁺ ed il K⁺ contro gradiente di concentrazione. All'esterno c'è molto Na⁺ e poco K⁺, mentre all'interno si trova la condizione opposta. La pompa ionica legata all'ATPasi carica K⁺ dall'esterno e lo porta all'interno; contemporaneamente carica 3 Na⁺ dall'interno e li porta all'esterno.
  • Simporto: vengono trasportate contemporaneamente due sostanze.
  • Antiporto: non è un trasporto vettoriale ma bidirezionale associato.