Citologia, embriologia e istologia

LO STUDIO DELL’ISTOLOGIA

L’istologia è vita. Perché? L’istologia infatti si occupa dello studio dei tessuti che

sono composti da cellule. Per questo possiamo affermare che citologia e istologia

sono strettamente correlate. L’istologia si occupa dello:

-Studio delle cellule: la più piccola porzione di materia vivente dotata di vita

autonoma. Nel nostro organismo le cellule si trovano in tessuti e in fluidi biologici,

come il sangue.

-Studio dei tessuti: porzioni di materia vivente formati da cellule e alcuni anche da

matrice extra cellulare. Più tessuti danno origine a organi, più organi ad apparati, più

apparati a un organismo.

LIVELLI DI ORGANIZZAZIONE DELLA MATERIA VIVENTE

tre proprietà:

La materia vivente si caratterizza per fondamentali

- L’organizzazione secondo un piano strutturale: la materia vivente si presenta

sotto forma di organismi (unicellulari o non) dotati di caratteristiche specifiche. Gli

organismi viventi e le singole cellule sono delle strutture assai complesse, dove ogni

parte dell’organismo e della cellula stessa è legata secondo uno schema ben preciso.

La capacità della materia vivente di mantenere determinate caratteristiche costanti è

omeostasi.

chiamata

-la capacità di adattamento all’ambiente: l’adattabilità è la capacità di interagire

con l’ambiente, modificando sia questo che la materia vivente, in modo da garantire lo

svolgimento dei processi vitali.

- la capacità di riprodursi: indica la possibilità di dare origine a nuova materia

vivente con caratteristiche simili a quella che l’ha prodotta.

STRUMENTI DI STUDIO

Le cellule sono troppo piccole per essere viste a occhio nudo (cellula più grande:

ovocita). Occorre quindi impiegare microscopi che aumentano il potere di

risoluzione , ovvero viene aumentata la minima distanza tra due punti affinché

quest’ultimi possano essere percepiti come separati tra di loro. Per esempio l’occhio

umano riesce a percepire una distanza minima tra due oggetti pari a 100 micron.

Invece il microscopio ottico riesce a percepire una distanza minima di 0,2 micron che

rappresenterebbero la millesima parte del mm. Infine abbiamo anche il microscopio

elettronico che ha una risoluzione di 1 nm.

MICROSCOPIO OTTICO

Il microscopio ottico è formato da vari pezzi quali:

-l’ illuminatore: ovvero da (una sorgente di luce). Ormai è incorporato in tutti i

microscopi moderni, anche nei più semplici, e la lampada a bassa tensione è

regolabile tramite un reostato.

- il diaframma dell’illuminatore: modula l’intensità della luce, regolando l’ampiezza

del fascio di luce che arriva al condensatore, in modo tale da controllare la qualità

dell’immagine

- Il condensatore: ha la funzione di condensare la luce proveniente dall’illuminatore

sul piano del campione. Il condensatore è provvisto di un diaframma ad iride per poter

regolare la ampiezza di luce che entra nell’obiettivo

- porta preparati o stativo

- l’ obbiettivo: è un sistema di lenti che danno la prima immagine ingrandita del

campione. Sono avvitati su una torretta che ne può contenere fino a 6. Un obiettivo è

un sistema di lenti che proietta l’immagine ingrandita ed invertita del

campione nel piano focale inferiore dell’oculare, in modo tale che questo

possa ingrandirla ulteriormente.

La distanza di lavoro di un obiettivo, cioè la distanza della lente frontale dal campione

è piuttosto ridotta (da 30 micron a 0,1 mm). Inoltre potere di ingrandimento e distanza

di lavoro sono inversamente proporzionali, quindi maggiore è l’ingrandimento minore

sarà la distanza di lavoro dell’obbiettivo.

Le scritte riportate sulla montatura degli obbiettivi ne indicano le caratteristiche. Per

esempio possiamo trovare l’APERTURA OTTICA: cioè indica il potere di risoluzione e

quindi anche la sua qualità ottica.

(Il fascio luminoso che parte dal campione diretto all’obbiettivo è un cono di luce che

ha un’ampiezza pari a 2 alfa. Tale ampiezza dipende dall’indice di rifrazione tra

campione e obiettivo.)

ESPRESSIONE DEL CONCETTO DI RISOLUZIONE:

∝

A × N=n× sen

Questa espressione indica la massima ampiezza del cono di luce che entra

nell’obbiettivo. Si può notare come l’A x N sia direttamente proporzionale all’indice di

rifrazione n del mezzo posto tra campione e lente dell’obiettivo.

FORMULA DI ABBE

In conclusione, l’AN è un valore che descrive la qualità della lente. Oltre a questo, l’AN

ci indica anche qual è l’ingrandimento massimo al quale l’obiettivo può essere usato.

Infine possiamo affermare che l’AN determina il potere di risoluzione secondo la

formula di ABBE:

R= 0,5 (lunghezza d’onda: AN)

Dove R è la risoluzione ovvero la distanza minima che il sistema ottico riesce a

percepire tra due oggetti. E AN indica l’apertura numerica dell’obbiettivo.

GLI OCULARI: L’oculare non solo ingrandisce l’immagine formata dall’obbiettivo, ma

è in grado di correggere anche alcuni errori (aberrazioni). L’oculare porta inciso un

numero sulla montatura che va ad indicare il suo potere di ingrandimento. Questo vale

moltiplicato al valore dell’ingrandimento dell’obbiettivo dà l’ingrandimento totale.

Come si formano le immagini dell’oggetto attraverso le lenti del microscopio

ottico?

L’oggetto è posto oltre il fuoco della lente dell’obiettivo. Questa forma un’immagine

reale ingrandita e capovolta che è situata tra la lente dell’oculare ed il suo fuoco.

Dall’immagine capovolta si forma un’altra immagine ingrandita e diritta. Come

risultato finale avremmo un’immagine capovolta, virtuale e ingrandita.

risoluzione definizione

Quando aumento l’ingrandimento, aumento anche la e anche la

dei particolari.

DIFFERENZA TRA INGRANDIMENTO E POTERE DI RISOLUZIONE

risoluzione

La determina il livello di dettaglio contenuto nell’immagine. L’

ingrandimento non determina un aumento di risoluzione delle immagini.

ALTRI TIPI DI MICROSCOPI:

Microscopio invertito:

Chiamato così perché sono stati invertiti i vari pezzi: in alto troviamo la sorgente di

luce ed il condensatore. Invece al di sotto del tavolino portaoggetti troviamo gli

obbiettivi e la torretta. Viene utilizzato principalmente per osservare cellule viventi o

organismi al fondo di un grande contenitore. È il microscopio più utilizzato nelle

tecniche di micromanipolazione.

IL CONTRASTO DI FASE

Alcuni microscopi tra cui quello invertito sono dotati del contrasto di fase. Il contrasto

di fase è un diaframma scuro posto nel condensatore che lascia passare la luce solo

attraverso una corona circolare in modo tale che arriverà un fascio di luce conico

vuoto la centro. Quindi il percorso del fascio di luce viene deviato e per questo motivo

l’immagine sarà bianco e nera.

Microscopio polarizzatore:

Sono presenti 2 prismi: uno detto polarizzatore (posto sotto il condensatore) e

l’altro analizzatore (posto tra l’obbiettivo e l’oculare). Se i reticoli cristallini dei 2 prismi

vengono incrociati, si otterrà un’immagine buia. A questo punto viene fuori il concetto

di isotropia e misotropia. L’isotropia rappresenta una zona scura. Invece la

misotropia rappresenta una zona chiara. Sono isotrope le sostanze composte da

molecole disordinate. Mente anisotrope quelle sostanze che presentano una struttura

ordinata.

Microscopio a fluorescenza

Il campione da analizzare contiene una sostanza che si chiama fluoroforo, la quale può

essere già presente nel campione oppure può essere immessa dall’esterno. Tale

sostanza viene colpita da un fascio di luce ultravioletta o laser, e di conseguenza

emette luce per fluorescenza. La luce ultravioletta viene fermata prima di arrivare

all’oculare, da un apposito filtro di sbarramento, così che all’occhio arrivano solo i

raggi luminosi emessi per fluorescenza.

Microscopio confocale

Si differenzia da quello a fluorescenza

-per la presenza di una sorgente luminosa laser che aiuta a migliorare la qualità delle

immagini.

-per la presenza di un sistema ottico ed elettronico che permette di scandire l’intera

superficie, aumentando così la risoluzione. Per fare questo si utilizzano due pinhole

ovvero due piccoli fori focalizzati sullo stesso piano cioè confocali tra loro.

Metodi alternativi alla microscopia focale:

- Tecnica di convoluzione: trattamento dell’immagine di fluorescenza attraverso

metodi matematici di convoluzione

- tecnica del multiphoton: simile a quello a fluorescenza solo che il laser eccita il

fluorocromo solo nel punto di fuoco.

Microscopio a 2 fotoni

Utilizza un laser per eccitare molecole fluorescenti in un campione e opportuni

rilevatori per misurare la luce emessa. I laser utilizzati in questo tipo di microscopio

sfruttano l’assorbimento simultaneo di due fotoni nell’infrarosso.

Microscopio elettronico a trasmissione: Intorno agli anni 50 la scienza avvertì la

necessità di migliorare la risoluzione. Perché ciò permetteva lo studio di malattie

diverse, ancora non identificate. Aumentando la risoluzione si è arrivati a vedere il

particolare di una singola cellula. Ciò comporta una nuova comprensione di un

meccanismo antico. Ha un’organizzazione diversa: i protagonisti della sorgente

luminosa sono gli elettroni. Gli elettroni a questo punto vengono inviati a una grande

velocità in un tubo sottovuoto alle cui estremità ci sono un anodo e un catodo.

Elettronico a scansione

Ricorda quello confocale perché scandisce l’intera superficie della cellula invece di

entrare nella struttura interna.

Differenze tra microscopi:

Risoluzione:

Microscopio ottico: 0,1 micron

o Microscopio elettronico a scansione: 1 nm

o Microscopio elettronico a trasmissione :0,2 nanometri

o

Microscopia a forza atomica

Riproducono la topografia superficiale del campione sotto esame con una risoluzione

sub-nanometrica.

Microscopia ad alta risoluzione

Con questo tipo di microscopia è possibile vedere microrganismi con dimensioni

microscopiche. Infatti questo microscopio ha una risoluzione di 100 nm.

STUDIO DELLA MATERIA VIVENTE

Le tappe principali dell’allestimento di un preparato microscopico sono la fissazione, la

sezione e la colorazione.

La fissazione consiste in un trattamento che va a stabilizzare la sostanza vivente in

condizioni più simili possibile a quello dello stato vivente, in modo da bloccare le

alterazioni post-mortali. Il fissativo più utilizzato è la Formalina, ovvero formaldeide in

soluzione acquosa del 40%.

La sezione permette di rendere il preparato attraversabile dalla luce.

La colorazione consiste nella preparazione del preparato con sostanze colorate o

opache per il micro elettronico.

I coloranti: acidi e basici.

Si dividono in Gli acidi sono quei coloranti in cui la parte

che si attacca al tessuto conferendogli colore è un anione (carica elettrica negativa).

Invece basici sono quei coloranti in cui la parte responsabile della colorazione è un

catione (carica positiva).

Si parla di basofilia per indicare l’affinità di un tessuto per i coloranti basici. Si parla di

acidofilia per indicare l’affinità di un tessuto verso un colorante acido. Per definizione

si definisce il nucleo di una cellula basofilo, invece il citoplasma viene definito

acidofilo.

L’azione dei coloranti dipende:

-dall’affinità chimica tra i vari costituenti del tessuto e dei coloranti

- dalla concentrazione di tali costituenti

- dalla loro permeabilità

I coloranti più usati sono:

Ematossilina:

- è una sostanza estratta dal legno di per sé incolore. Colora quando si è

ossidata ad emateina con l’aggiunta di un morzante. Viene anche chiamata lacca

metallica o ferrica a seconda del mordenzante usato.

-Eosina: è un colorante basico.

Altre tecniche di colorazione utilizzate:

Impregnazione argentica

- : il preparato viene trattato con dei sali metallici, che

precipitano in alcune aree e non in altre. Le tecniche che si basano su questo principio

precipitazioni.

si chiamano Se il substrato organico è affine ai sali di argento questi si

legano con il substrato. Se inseguito a tale legame, il preparato viene trattato con una

sostanza riducente, dal sale si libera argento metallico. Camillo Golgi ideò un metodo

che consente l’identificazione del neurone.

Cajal

- : Frammenti di un tessuto dopo fissazione vengono trattati con una soluzione di

nitrato di argento e poi trattati con un agente riducente. Questo metodo rende visibile

anche parti molto piccole.

Reazione per lipidi

I lipidi possono essere sezionati attraverso tecniche come il criostato o con il

microtomo. In tali sezioni i lipidi vengono evidenziati mediante coloranti liposolubili

come il rosso Congo o il Sudan III.

Reazione per i polisaccaridi

Gli zuccheri possono essere identificati attraverso la reazione di PAS: i gruppi ossidrili

sono ossidati dall’acido periodico con la formazione di gruppi aldeidici. Il reattivo di

Schiff che è incolore reagisce con questi ultimi cambiando il suo colore in rosso-

magenta.

ISTOCHIMICA: METACROMASIA

È il fenomeno per cui alcuni tessuti assumono una colorazione diversa da quella dei

coloranti. Per esempio il blu di toluidina da blu passa ad essere violetto. Ciò è in

relazione alla disposizione e al numero di radicali anionici che sporgono sul contorno

delle molecole degli stessi (in virtù del fatto che la carica anionica presente nel tessuto

è estremamente elevata).

DNA

Franklin aveva partecipato attivamente agli studi di Watson e Crick. Anche se il suo

contributo non venne mai riconosciuto. Nel 1953 si ha il modello ad elica del DNA.

Reazione FOILLEN: Il DNA è in grado di legare il reattivo Schiff formando un composto

colorato dopo una leggera idrolisi ottenuta con HCL. Questa idrolisi separa le basi

azotate dallo zucchero il cui gruppo aldeidico può reagire con il reattivo di Schiff.

ISTOCHIMICA DEGLI ACIDI NUCLEICI

Alcune sostanze fluorescenti colorano il DNA legandosi alle coppie di basi A, T; G, C.

Tra i fluorocromi A, T specifici più utilizzati sono la quinacrina e il DAPI. Invece la

Cromomicina per la G e C.

CITOCHIMICA: È l’insieme di tecniche che sfruttano il legame specifico tra ligando e

un sito di legame per dimostrare quest’ultimo.

LIGANDO= molecola estranea ad un compartimento della materia vivente, è capace

di lagarsi ad una molecola di tale comportamento.

SITO DI LEGAME=molecola di un compartimento della materia vivente capace di

legarsi specificamente a un ligando

Sito di legame e ligando sono legati da una serie di legami deboli, efficaci poiché sono

numerosi e avvengono tra due superfici congruenti.

CITOCHIMICA DI AFFINIT À

Tale metodica fa utilizzo di specifiche lectine coniugate con un opportuno marcatore

consentendo così la localizzazione delle glicoproteine.

IMMUNOISTOCHIMICA: È quella branca dell’istochimica che si avvale delle reazioni

tra antigene e un anticorpo. L’anticorpo è una sostanza secreta da vari tipi cellulari

in grado di legarsi con una sostanza estranea chiamata antigene. Questo legame può

essere visibile attraverso le tecniche della citochimica. Ogni antigene possiede più siti

specifici chiamati epitopi.

Un anticorpo invece è dotato di un sito modificabile ovvero una porzione capace di

legarsi all’antigene. E da una porzione costante. La reazione di un antigene e di un

anticorpo avviene grazie a legami deboli ma efficaci perché sono numerosi.

IMMUNOFLUORESCENZA: Mediante l’uso di anticorpi marcati con sostanze fluo è

possibile mettere in evidenza gli antigeni. Esistono 2 metodi:

- metodo diretto che usa soltanto l’anticorpo primario marcato con una sostanza

fluorescente

- metodo indiretto lega all’anticorpo primario una o più molecole di anticorpo

secondario marcato da una sostanza fluo.

ANALISI DI IMMAGINE: Consente di calcolare partendo da un’immagine simile a

quella del nostro sistema visivo, parametri come forma, taglia, numero e densità

ottica. Consiste nella manipolazione ed analisi di info scientifiche rappresentate come

immagini.

L’IBRIDAZIONE IN SITU: Consente la localizzazione di sequenze di DNA o RNA nei

tessuti o nelle cellule. L’ibridazione in situ si basa sul principio di complementarietà

tra le basi azotate che sono in grado di appaiarsi tra loro in condizioni particolari. La

marcatura di una delle due sequenze permette la localizzazione della sequenza

bersaglio a cui essa si appaia. LA CELLULA

La sostanza vivente costitutiva delle cellule prende il nome di protoplasma.

La cellula è circoscritta in superficie dalla MEMBRANA PLASMATICA la quale regola

gli scambi con l’ambiente esterno separa la cellula dall’ambiente esterno. Inoltre, la

cellula risulta essere formata anche da un citoplasma e da un nucleo.

Il CITOPLASMA si presenta costituito da una fase otticamente omogenea, lo

ialoplasma e da alcune strutture visibili al microscopio chiamate differenziazioni

citoplasmatiche a loro volta suddivise in organuli e inclusi. Il citoplasma contiene

anche il citoscheletro, ovvero un sistema di strutture filamentose che regola la forma e

permette la mobilità della cellula.

Gli ORGANULI (apparato del Golgi, lisosomi, mitocondri, reticolo endoplasmatico,

ribosomi) sono componenti presenti in ogni cellula e svolgono specifiche funzioni

essenziali per tutte le cellule. Gli inclusi invece sono accumuli di prodotti cellulari

metabolicamente inerti e caratteristici solo