Chimica farmaceutica - progettazione lead 3

Strategie per la modificazione molecolare

Introduzione

Come si è visto nel capitolo precedente, i chimici farmaceutici hanno a disposizione una robusta serie di metodi per modulare un lead, sia per ottimizzarne l'attività che per estrarre informazioni utili dalle sue relazioni struttura attività. Il problema è quello di agire secondo una strategia che inquadri le modifiche da fare in un unico disegno e che permetta di giungere allo scopo nel più breve tempo possibile e con il minimo dispendio di energia.

A questo fine l'evoluzione ormai quasi secolare della chimica farmaceutica ha suggerito delle strategie che possono permettere di razionalizzare le modifiche fatte su di un lead. Queste strategie possono essere utilizzate sia per disegnare nuovi farmaci sia per raccogliere informazioni sull'interazione di un farmaco con il proprio recettore. Alcune di queste strategie hanno una applicazione molto estesa e frequente nella chimica farmaceutica e quindi verranno trattate più a fondo, altre sono di applicazione più limitata e verranno solo accennate.

Analoghi rigidi

La determinazione della forma (conformazione) di un farmaco al momento della sua interazione con il suo bersaglio biologico è un momento essenziale per conoscere le caratteristiche molecolari della interazione e di conseguenza per lo studio del meccanismo di azione ed il disegno e lo sviluppo di nuovi farmaci. Informazioni su questo cruciale aspetto dell'azione di un farmaco sono ottenibili dalla conoscenza della topografia del sito di interazione che, come abbiamo più volte detto, è abbastanza diffusa in alcuni casi (per esempio enzimi) ed allo stato attuale molto carente per altri (per esempio recettori), oppure dalla conoscenza della conformazione con la quale il farmaco interagisce con il sito attivo (conformazione attiva).

L'importanza di informazioni sulla conformazione attiva è fondamentale per i farmaci che interagiscono con i recettori ed in particolare per le piccole e flessibili molecole di neurotrasmettitori quali acetilcolina, adrenalina, dopamina, GABA e molti altri, che sono in grado di attivare diversi sottotipi recettoriali. Infatti è molto probabile che un neurotrasmettitore con queste caratteristiche interagisca con il sito attivo di ogni sottotipo con conformazioni differenti ed è intuitiva l'importanza che informazioni a questo riguardo possono avere per sviluppare farmaci selettivi e potenti.

Purtroppo la conformazione con la quale un farmaco interagisce con il proprio recettore spesso non coincide con la conformazione più stabile del farmaco (conformazione preferita, che può essere derivata dall'analisi conformazionale) e non sono disponibili criteri di validità generale per fare previsioni in proposito. Un modo per ridurre il numero di possibili conformeri in una molecola flessibile è quello di disegnare analoghi che rappresentino uno o più di questi conformeri parzialmente o completamente irrigiditi. La determinazione della loro azione biologica, in confronto con quella del prodotto originale, dovrebbe dare informazioni sulla conformazione attiva. Nelle pagine che seguono verranno discussi i vantaggi ed i problemi relativi all'applicazione di questa strategia e le informazioni che si possono ottenere dall'uso corretto di essa.

Isomeria conformazionale

Isomeri conformazionali (conformeri) sono quelli derivanti da orientazioni non sovrapponibili di una molecola che prendono origine dalla presenza di uno o più singoli legami, non inclusi in cicli, attorno ai quali la molecola può ruotare più o meno liberamente. Tanto più numerosi saranno questi legami tanto più flessibile risulterà la molecola e tanto più elevato sarà il numero delle conformazioni prevedibili. In genere ad ogni singola conformazione corrisponde una diversa relazione spaziale tra i gruppi di atomi e quindi una diversa capacità di interagire con un bersaglio biologico.

In realtà questo è vero solo per quei legami che non coinvolgono gruppi simmetrici. La rotazione del metile dell'acetilcolina nell'esempio che segue non ha conseguenze in quanto il gruppo metilico contiene tre atomi di idrogeno del tutto equivalenti. Lo stesso vale per il legame tra il carbonio 5 ed il gruppo ammonico quaternario. Al contrario, la rotazione attorno ai legami 4-5 (ponte etilenico) e quelli 2-3 e 3-4 ha notevoli conseguenze sulla disposizione spaziale della molecola. Tra le migliaia di conformeri possibili derivanti dalla rotazione attorno a questi legami (la maggior parte dei quali ha una energia quasi identica) se ne possono individuare alcuni la cui energia differisce in modo sostanziale e che rappresentano situazioni particolarmente favorite (conformazioni preferite) o sfavorite (conformazioni proibite).

Infatti la rotazione attorno a singoli legami non è affatto "libera" ma è soggetta a barriere energetiche che dipendono da interazioni, sia steriche che elettroniche, tra i gruppi sostituenti gli atomi coinvolti nel legame. La entità di tali barriere energetiche determina il comportamento conformazionale di una molecola e la probabilità di esistenza di ogni singola conformazione. Le conformazioni nelle quali le interazioni di tipo repulsivo sono minimizzate e quelle di tipo attrattivo sono massime rappresentano conformazioni energeticamente favorite e sono dette appunto conformazioni preferite.

Da un punto di vista esclusivamente sterico, l'intuizione e la teoria indicano che i gruppi ingombranti debbono stare alla maggior distanza possibile, il che significa che le conformazioni cosiddette trans sono energeticamente favorite rispetto a quelle sghembe ed a quelle parzialmente eclissate ed eclissate, che a loro volta sono quelle meno favorite. Tuttavia vanno prese in considerazione anche le interazioni elettroniche che possono intervenire a cambiare la situazione. Questo è il caso proprio dell'acetilcolina nella quale è stato trovato, sia allo stato solido ed in soluzione che con calcoli teorici, che la conformazione più stabile non è quella dettata dall'ingombro sterico (trans) ma quella imposta dalla interazione ione-dipolo tra il gruppo ammonico quaternario ed il carbonile (sghemba).

L’isomeria conformazionale può essere determinata anche da quei cicli, a più di quattro termini (sia alicicli che eterocicli) che possono esistere in più conformazioni. L'esempio classico di questo comportamento è naturalmente il cicloesano di cui è ben nota la possibilità di presentare due conformazioni limite: quella a sedia e quella a barca. Le forze che determinano la preferenza per l'una o l'altra conformazione sono le stesse già considerate in precedenza, in particolare le posizioni eclissate degli atomi di idrogeno sui carboni che sono sullo stesso piano e la vicinanza dei carboni 1 e 4. Di conseguenza, in circostanze normali, il cicloesano assume una conformazione a sedia e i composti che contengono più anelli condensati assumono invece quella che permette il numero maggiore di conformazioni a sedia. Questa tuttavia non è unica in quanto, come è ben noto, il cicloesano può subire una inversione sedia-sedia che è evidenziata dalle differenti caratteristiche di risonanza magnetica degli idrogeni assiali ed equatoriali a temperature nelle quali la barriera energetica tra le due forme diventa rilevante ai fini dell'equilibrio tra di esse. Questa circostanza assume una grande rilevanza quando l'anello cicloesanico è sostituito. In tal caso le conformazioni possibili sono fortemente condizionate dalla grandezza e dalla natura dei gruppi sostituenti.

Nel caso di anelli monosostituiti il gruppo sostituente occupa preferenzialmente la posizione equatoriale rispetto a quella assiale nella quale sono presenti le interazioni di non legame 1,3. Naturalmente il rapporto tra i due conformeri dipende da R; quando questo è sufficientemente voluminoso (per esempio R = gruppo t-butilico) la conformazione presente è di fatto solo quella con il gruppo equatoriale.

Per i cicli disostituiti la situazione cambia in funzione della posizione di sostituzione e della isomeria geometrica (cis/trans). Il caso dei cicli 1,1 disostituiti è del tutto analogo a quello dei monosostituiti: in questo caso è la grandezza relativa dei sostituenti che condiziona la conformazione preferita ed il rapporto tra i due conformeri. Per i cicli 1,2 disostituiti nella configurazione cis (corrispondente ai sostituenti in posizione ea, ae) la conformazione è dettata dalla grandezza relativa di R ed R . Al contrario nella configurazione trans (ee, aa) la conformazione preferita è sempre quella di equatoriale che ha il numero minimo di interazioni 1,3.

Quando i cicli sono sostituiti in 1,3 la situazione si inverte e nell'isomero cis (che in questo caso corrisponde alle posizioni ee, aa) la conformazione preferita è sempre quella ee mentre nell’isomero trans (ea, ae) la conformazione dipende dalla grandezza di R ed R. Infine nei cicli 1,4 disostituiti la situazione è del tutto corrispondente a quella della sostituzione 1,2. È evidente che tutte le volte che un gruppo sia sufficientemente grande da imporre la sua collocazione equatoriale, la conformazione corrispondente sarà praticamente la sola presente. Inoltre, esattamente come si è già visto per i composti lineari, le caratteristiche elettroniche dei gruppi sostituenti possono alterare la situazione determinata dagli effetti sterici, come nel caso del cis cicloesandiolo che per effetto del legame idrogeno tra i due gruppi ossidrilici preferisce la conformazione di assiale a quella di equatoriale.

Analisi conformazionale

Informazioni sulla situazione conformazionale di una molecola possono essere ottenute con varie metodologie chimico-fisiche. Così la cristallografia ai raggi X permette di conoscere la conformazione di una sostanza allo stato solido con grande esattezza. Alcuni metodi spettroscopici, in particolare la risonanza magnetica nucleare (NMR), permettono di studiare la situazione conformazionale di un prodotto in soluzione. Questo è un vantaggio rispetto alla difrattometria ai raggi X, soprattutto se il solvente utilizzato ha caratteristiche che si avvicinano alla situazione fisiologica. Anche questo metodo, come quello precedente, però non è in grado di indicare altre conformazioni equienergetiche che possono essere coinvolte nella interazione con il recettore.

Infine le conformazioni più stabili di una molecola possono essere calcolate mediante metodi teorici che sono in grado di indicare lo spazio conformazionale accessibile alla molecola stessa. Questi metodi coinvolgono calcoli nei quali sono presi in considerazione vari parametri molecolari come angoli di legame, lunghezze di legame, distribuzione elettronica. In questo modo è possibile ottenere l’energia di un ampio ventaglio di conformazioni ed identificare quella(e) a più bassa energia. Normalmente tutti i conformeri che cadono entro un intervallo, scelto arbitrariamente, sopra il minimo globale, sono considerati potenziali candidati per l'interazione con il recettore. Valori che vanno dalle 5 alle 20 kcal/mole sono usualmente utilizzati a questo scopo.

In ogni caso va considerato che tutti i metodi di analisi conformazionale, anche quando le loro indicazioni sono coincidenti, ci forniscono informazioni sulle conformazioni preferite di una sostanza in assenza del bersaglio biologico con cui questa si lega, bersaglio che, come vedremo, può in una certa misura imporre la conformazione di legame. La conseguenza è che, non esistendo una ragione a priori che permetta di stabilire la conformazione al momento dell'interazione, l'analisi conformazionale non esaurisce la ricerca della configurazione attiva, ma piuttosto rappresenta il punto di partenza di tale ricerca.

Conformazione preferita e conformazione attiva

Non esiste quindi alcuna relazione necessaria tra conformazione preferita e conformazione attiva ed è generalmente accettato che ognuna delle conformazioni più stabili può essere quella che interagisce con il recettore. In generale è ragionevole ritenere che tutte le conformazioni al di sopra di una certa energia debbano pagare un prezzo energetico troppo alto per adattare la loro conformazione al recettore e quindi possano essere escluse da questa possibilità. Tuttavia ci vuole molta attenzione anche a questo proposito; ci sono infatti dei casi in cui è stato dimostrato che l'interazione può permettere di superare barriere conformazionali piuttosto alte, come nel caso dei due isomeri conformazionali del TED (N,N,N,N'-tetrametil-N'-acetiletilendiamina ioduro). L'isomero più stabile è il trans-TED, ma quello che si lega al recettore nicotinico è il cis-TED, anche se la barriera energetica tra i due è molto alta (circa 19 kcal/mol).

È chiaro che il modo radicale di risolvere il problema della conformazione attiva sarebbe quello di studiare la conformazione all'atto della interazione. Al momento attuale questo è possibile solo per quei bersagli biologici per i quali è nota la struttura del sito attivo e nei quali è possibile studiare direttamente il complesso con il ligando: in pratica enzimi e acidi nucleici.

Uso di analoghi a flessibilità molecolare ridotta

I chimici farmaceutici hanno da molti decenni adottato un metodo per risolvere il problema delle relazioni tra conformazione e attività biologica: esso consiste nel ridurre la libertà conformazionale di un ligando disegnando analoghi totalmente o parzialmente rigidi che rappresentino un congelamento dei possibili conformeri della molecola originale. Oltre che a presentare i gruppi essenziali per la interazione in una definita posizione sterica, che dovrebbe corrispondere ad uno dei possibili conformeri a bassa energia, un analogo rigido ha l'addizionale vantaggio che, se identifica una conformazione utile ma ad energia più alta, non ha bisogno di questa ulteriore energia conformazionale per l'interazione.

Lo studio della attività biologica di questi analoghi in confronto con il prodotto di partenza dà informazioni sulla conformazione attiva e permette di ricavare un set di relazioni conformazione-attività che, come si vedrà in seguito, possono avere tutta una serie di utili applicazioni nel disegno di farmaci e nello studio del loro meccanismo di azione.

Due aspetti di questo approccio vanno subito esaminati. Per ridurre la libertà conformazionale della molecola è necessario modificare la sua struttura chimica. Molto spesso ciò si ottiene introducendo elementi strutturali che da una parte la irrigidiscono ma dall'altra possono modificare in modo difficilmente prevedibile le sue caratteristiche chimiche, chimico-fisiche e farmacocinetiche. Infatti possono essere alterati la lipofilia e la distribuzione elettronica; possono essere introdotti ostacoli sterici al legame con il recettore; possono essere modificati il metabolismo, il trasporto e la distribuzione.

Questo ultimo punto è particolarmente importante per una attendibile valutazione dei risultati e per questa ragione il metodo è soprattutto attendibile quando si utilizzino studi in vitro, nei quali l'influenza della farmacocinetica è trascurabile e le variazioni di attività possono direttamente essere correlate a variazioni nella affinità verso il recettore. Per queste ragioni la regola vuole che la riduzione di flessibilità venga effettuata con le minime variazioni strutturali possibili.

Un esempio che illustra l'importanza di questo aspetto è quello dei numerosi derivati della acetilcolina disegnati per ottenere informazioni sulla sua conformazione attiva. Di essi, solo quello con la minima modifica strutturale, l'isomero trans del 2-acetossi-ciclopropiltrimetilammonio ioduro (trans-ACTM) è equipotente con la acetilcolina, gli altri essendo praticamente inattivi malgrado la comune relazione transoide tra i due gruppi essenziali per l'attività che rappresenta la conformazione attiva di questo neurotrasmettitore. Apparentemente l'introduzione di gruppi più grandi di quello metilenico disturba stericamente la interazione con il recettore.

Un secondo importante aspetto da tenere presente quando si disegnano analoghi rigidi è che gruppi funzionali coinvolti nel legame non debbono essere modificati nella molecola irrigidita, pena la perdita delle capacità di legame. La libertà conformazionale di una molecola flessibile può essere ridotta o annullata quando il prodotto disegnato è...