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Sia che si operi in soluzione che in fase solida è sempre necessario

verificare che i prodotti che si intendevano ottenere siano realmente

presenti ed in quale proporzione. A questo scopo si utilizzano le usuali

tecniche di analisi chimica quali risonanza magnetica nucleare e

cromatografie di vario tipo, soprattutto la cromatografia liquida ad alta

pressione.

Il prodotto finale può essere lasciato attaccato al suo supporto per le

successive operazioni di determinazione della azione biologica ed

identificazione, o può essere solubilizzato staccandolo con vari metodi quali

idrolisi, attacco nucleofilo, ciclizzazione intramolecolare, ossidazione (Fig.

1.4). 32

Figura 1.4. Metodi di scissione di prodotti della sintesi combinatoriale da un

supporto solido. A: ciclizzazione molecolare. B: spiazzamento ossidativo,

fotolitico, idrolitico. C: spiazzamento nucleofilo.

Nella sintesi combinatoriale sono schematizzabili due procedure

principali:

A) La oligomerizzazione di monomeri. Vengono assemblati

successivamente monomeri bifunzionali diversi mediante un solo tipo di

reazione (Fig. 1.5).

Figura 1.5. Schema di assemblaggio di monomeri su di un supporto solido.

Si tratta naturalmente della stessa sequenza con la quale si

costruiscono singoli polipeptidi, oligonucleotidi, polisaccaridi che però viene

utilizzata secondo le metodologie combinatoriali.

33

In tal modo è possibile costruire un gran numero di librerie di

prodotti estremamente interessanti. Tuttavia, come è stato già accennato, i

peptidi non sono molto indicati come farmaci e una volta identificato un

peptide molto attivo è necessario, il più delle volte, derivare un

peptidomimetico conveniente. Analoghe considerazioni possono essere fatte

per oligonucleotidi e oligosaccaridi. Per questa ragione si sono assemblati

direttamente altri monomeri analoghi a quelli naturali ma in grado di

mostrare caratteristiche di stabilità metabolica e proprietà

farmacocinetiche migliori. Nello schema seguente sono indicate alcune delle

strutture utilizzate per sostituire gli aminoacidi.

Nel caso degli oligonucleotidi una variazione molto utile per

aumentare la stabilità metabolica dei nucleotidi naturali si è rivelata quella

di sostituire l'acido fosforico con l'acido fosfotioico.

34

Le possibilità offerte da questo approccio possono essere illustrate

dalla individuazione di due ligandi con affinità nanomolare per due

recettori diversi quale l'adrenergico e quello oppiaceo, in una piccola

libreria di tripeptoidi.

B) Sintesi di piccole molecole variamente sostituite (Combinatorial

organic chemistry). Questo approccio intende costruire con le regole della

sintesi combinatoriale piccole molecole organiche variamente sostituite per

35

formare librerie, in genere molto più piccole di quelle ottenibili con

l'oligomerizzazione (Fig. 1.6).

Figura 1.6. Schema di sintesi combinatoriale di piccole molecole organiche.

A questo scopo il chimico deve utilizzare una vasta serie di reazioni

organiche e reagenti molto diversi tra loro. A seconda del tipo di reazioni

coinvolte, al termine della sintesi i prodotti si staccano dal supporto per

passare in soluzione o rimangono attaccati al supporto dal quale, se

necessario, possono essere staccati con uno dei metodi accennati in

precedenza.

Un tipico esempio di questa metodologia che sta assumendo, per ovvie

ragioni sempre più importanza, è la sintesi di una libreria di quaranta

prodotti a nucleo benzodiazepinico effettuata da De Witt che ha chiamato

questo genere di librerie diversomeri. 36

1.8.3. Saggi biologici. Uno dei punti cruciali nella sintesi

combinatoriale è la possibilità di disporre di metodi sensibili, efficaci e

semplici in grado di determinare la attività biologica di miscele contenenti

un grande numero di prodotti in concentrazioni spesso molto ridotte. I

saggi possono essere effettuati sia in soluzione che sui prodotti legati alla

resina di supporto.

Nel primo caso sono utilizzabili i comuni saggi biologici e

farmacologici quali il binding con recettori o la determinazione dell'attività,

generalmente antagonista, su enzimi. Questi saggi sono in genere modificati

allo scopo di renderli adatti alle basse concentrazioni presenti: ad esempio i

recettori possono essere preventivamente immobilizzati. Una trattazione di

queste tecniche va al di la degli scopi di questo libro.

Malgrado ciò, quando la libreria da testare è composta da un grande

numero di prodotti, i risultati non sono sempre attendibili. Per questa

ragione la tendenza attuale è quella di ridurre a numeri più ragionevoli il

37

numero di composti presenti in una libreria da provare tutti insieme (da

centinaia di migliaia ad alcune centinaia). Si ritiene che più è ridotto il

numero di prodotti, più alta sia la attendibilità dei risultati biologici

ottenuti.

Nel secondo caso i metodi debbono tenere conto del fatto che la

presenza del supporto solido può determinare notevoli problemi da

superare per ottenere risultati attendibili. Il principale di questi è che la

presenza del supporto o del sistema di ancoraggio ad esso (linker) può

ostacolare la interazione dei prodotti con le macromolecole biologiche che

costituiscono il bersagli dei prodotti sintetizzati.

Di particolare importanza è la possibilità di individuare i prodotti

attivi nella sintesi in fase solida quando si usa la sintesi parcellizzata o la

toposintesi (vedi di seguito). In questo caso l'individuazione della perlina, lo

spillo o la porzione di chip che portano la molecola attiva è essenziale.

Una delle metodiche più utilizzate in questo caso è quella di ancorare

alla macromolecola biologica che costituisce il bersaglio del prodotto attivo

(anticorpo, recettore) una molecola fluorescente. In tal modo, ad esempio, la

perlina che contiene il prodotto legato, se di dimensioni opportune

µ),

(usualmente dal diametro di 50-100 potrà essere riconosciuta e separata

meccanicamente dalle altre per l'analisi della struttura del prodotto.

Alternativamente il recettore (o l'anticorpo) può essere legato ad

enzimi che determinano una risposta visibile (fluorescenza o colorazione) su

38

adatti substrati; un esempio è quello della fosfatasi alcalina ed è mostrato

nella figura 1.7.

Figura 1.7. Visualizzazione di una perlina contenente un prodotto con

affinità per un recettore accoppiato con la fosfatasi alcalina (RE). A: il

recettore modificato è mescolato con le perline della libreria. B: il recettore

si lega alla perlina che contiene il prodotto affine. C: si aggiunge il substrato

dell'enzima; la perlina, alla quale è legato il recettore modificato, si colora

(porpora) e può essere individuata ed isolata.

In ogni caso, nella valutazione dei risultati biologici in fase solida va

tenuto conto del fatto che la quantità di prodotto presente in ciascuna

perlina o sito di reazione può non essere omogenea, il che può far rischiare

di perdere informazioni preziose. Infatti la equimolarità dei ligandi è un

criterio fondamentale se si vuole avere una determinazione, per lo meno

semiquantitativa, della affinità.

1.8.4. Analisi. La identificazione dei prodotti attivi in una libreria è un

altro dei passaggi cruciali nella sintesi combinatoriale. Le metodologie

39

utilizzate sono diverse a seconda che la libreria ottenuta sia in soluzione o in

fase solida.

A) Librerie in soluzione. Per l'analisi di librerie in soluzione si

utilizzano i metodi di deconvoluzione e delle sottolibrerie.

I metodi di deconvoluzione, una volta che sia stata riscontrata attività

in una libreria, consistono nel procedere alla sintesi di sottolibrerie dalle

quali sia possibile assegnare ad ogni singolo blocco sintetico la corretta

posizione.

L'esempio riportato di seguito (Fig. 1.8) riguarda una libreria

minima, ma il modo di procedere è identico, anche se più laborioso, per

librerie ampie. Si può verificare che è più vantaggioso, in termini di

rapporto tra numero dei prodotti sintetizzati e numero delle sottolibrerie da

sintetizzare per la deconvoluzione, operare su grosse librerie.

40

Figura 1.8. Schema di deconvoluzione mediante la sintesi di

sottolibrerie. L'ombreggiatura indica le librerie nelle quali si riscontra

attività. X rappresenta la miscela BC o c. Nella fase A si fissa la prima

posizione e nelle fasi B e C la seconda e la terza posizione.

Nel metodo delle sottolibrerie, queste sono costituite già all'inizio

della sintesi in modo che il risultato delle prove biologiche sia in grado di

dare immediatamente la struttura del prodotto attivo. Applicando

all'esempio precedente questo metodo si opererà come mostrato in fig. 1.9.

Il numero delle sottolibrerie può essere anche molto alto: fino a molte

centinaia. 41

Figura 1.9. Metodo delle sottolibrerie per la identificazione dei

prodotti attivi.

Un'altra strategia, che va sotto il nome di metodo delle librerie

ortogonali (ortogonal libraries), è basata su un disegno sperimentale tale

che ogni possibile prodotto appaia solo in due librerie. In una applicazione

di questa strategia 40 cloruri acidi sono stati fatti reagire con un set di 40

nucleofili (alcoli ed ammine) secondo lo schema seguente (Tab. 1.2), per

dare 80 librerie con un totale di 1600 prodotti. In pratica ogni acido è stato

fatto reagire con la miscela di nucleofili e ogni nucleofilo con la miscela

degli acidi; ogni riga e ogni colonna rappresentano librerie diverse.

42

Tabella 1.2. Sintesi ortogonale di 80 librerie (1600 prodotti) ottenute

dalla reazione di 40 cloruri acidi e 40 nucleofili. In grassetto le librerie in

cui si riscontra attività.

L'analisi delle ottanta librerie ha mostrato, in un dato saggio, attività

nella libreria A e B rendendo possibile così l'individuazione del prodotto

x y

attivo A B . Naturalmente saggi biologici diversi avrebbero potuto indicare

x y

librerie e prodotti differenti. In questo modo sono stati individuati i

seguenti due prodotti lead con attività antagonista sul recettore delle

neurochinine NK3 e inibitoria della metalloproteinasi-1.

43

B) Librerie in fase solida. I metodi per l’analisi dei prodotti legati a

matrici solide sono funzione delle strategie sintetiche utilizzate.

Se si utilizza il metodo della sintesi parcellizzata (split synthesis), che

di regola conduce alla individuazione della perlina che contiene la molecola

attiva, e solo di quella, si può procedere direttamente alla sequenziazione

del prodotto qualora si tratti di oligopeptidi o oligonucleotidi (per esempio

usando il metodo di Edman per i peptidi) oppure alla decodificazione del

codice usato per caratterizzare ogni passaggio della sintesi quando si sia

usato il sistema della sintesi codificata (tag synthesis). Se non si usa la

codificazione è possibile utilizzare anche in questo caso il metodo della

deconvoluzione. A questo scopo vengono spesso conservate parte delle

perline non rimescolate di ogni passaggio della sintesi.

Se invece sono stati usati approcci toposintetici (

spatially adressable

libraries), quali il metodo del sacchetto (tea bag synthesis), il metodo degli

spilli (multipin synthesis) o quello fotolitografico, non sono necessarie

ulteriori informazioni in quanto la struttura di ogni prodotto è

perfettamente definita dalla sua collocazione nel sistema di sintesi. I metodi

toposintetici sono anche conosciuti come sintesi parallela (parallel synthesis)

e possono essere adattati anche alla sintesi in soluzione. Maggiori

particolari su questi metodi verranno dati più avanti nella descrizione delle

relative strategie di sintesi. 44

La ricerca in questo campo è molto attiva: recentemente sono stati

riportati metodi nei quali la sequenza sintetica di ogni perlina è codificata

elettronicamente in un microchip (rad iofrequency encoding) inserito nel

cuore della perlina stessa.

1.8.5. Metodo del sacchetto (tea bag synthesis). In questo metodo,

sviluppato per la sintesi di peptidi, la resina di supporto è sigillata in

sacchetti di polipropilene poroso. Gli aminoacidi sono accoppiati mettendo

ogni singolo sacchetto in contatto con la soluzione del singolo aminoacido

attivato. La reazione di accoppiamento per ogni singolo sacchetto è quindi

perfettamente stabilita così come il susseguirsi degli stadi della reazione.

Tutte le altre operazioni (lavaggio, deprotezione) sono invece effettuate

tutte insieme in un singolo recipiente. Al termine della sintesi ogni pacchetto

contiene un singolo oligopeptide di struttura definita che viene usualmente

solubilizzato prima di essere provato biologicamente.

Questa tecnica è sinteticamente molto flessibile, può essere

automatizzata, e permette la sintesi di quantità relativamente molto alte di

µmoli)

oligopeptide (circa 500 che ne permettono la purificazione e la

caratterizzazione.

1.8.6. Sintesi parcellizzata (split synthesis). E una delle strategie

sintetiche più utilizzate e si presta alla sintesi di librerie molto grandi. Si

45 µ,

utilizzano il più delle volte perline del diametro di circa 50-100 il che vuol

dire circa 107-108 perline per grammo di resina.

L'idea alla base del metodo, introdotto da Furka nel 1988, è di

suddividere le perline in diverse porzioni uguali (il cui numero dipende

dalla strategia sintetica che si vuol perseguire), sottoporle singolarmente

alla fase di accoppiamento e quindi rimescolare opportunamente il tutto.

Nelle fasi successive si ripeterà l'operazione di separazione e

rimescolamento ad ogni passaggio sintetico.

Questa metodologia, inizialmente concepita per superare le differenti

cinetiche di reazione (prevedibili nella reazione di miscele di reattivi), ha il

grande vantaggio di condurre alla fine a perline che hanno alla superficie

una sola specie molecolare (one bead-one compound).

A seconda della funzionalizzazione del supporto, la quantità di

prodotto su ogni perlina può arrivare a molte nanomoli, una quantità

sufficiente sia alla determinazione della attività biologica che alla

individuazione del prodotto.

Un tipico schema di sintesi di questo tipo è mostrato nella figura 1.10.

46

Figura 1.10. Schema di sintesi parcellizzata. Le frecce indicano il

susseguirsi di fasi di accoppiamento, mescolamento, separazione,

accoppiamento, mescolamento, separazione e così via, fino al

completamento della sintesi. 47

1.8.7. Sintesi codificata (tag synthesis). Lo schema di sintesi descritto

precedentemente può essere utilizzato come tale solo con quei prodotti che

si prestano ad essere individuati per sequenziazione (quali oligopeptidi e

oligonucleotidi) una volta identificata la perlina contenente il prodotto

attivo, essendo impossibile identificare direttamente la struttura del

prodotto stesso.

Per ovviare a ciò sono stati messi a punto dei metodi di codificazione

che permettono di risalire alla struttura del prodotto attivo. Questi metodi

sono essenzialmente di due tipi.

Nel primo metodo ad ogni passaggio della reazione, utilizzando un

linker bifunzionale, vengono eseguite due tipi di reazioni: una consiste nella

reazione di costruzione della libreria, l'altra consiste nell'attaccare alla

perlina anche un prodotto che permette di riconoscere il reattivo aggiunto

in quel passaggio. Questi prodotti sono in genere aminoacidi o nucleotidi

inseriti in sequenza.

Al termine della sequenza di reazioni ogni perlina conterrà quindi il

prodotto voluto e, ad esempio, un peptide che può essere sequenziato

secondo Edman per raccontare la storia della perlina e quindi definire la

struttura del prodotto attivo (Fig. 1.11).

48

Figura 1.11. Schematizzazione del metodo della sintesi codificata.

A-F: blocchi sintetici; a-f: unità codificanti.

Come unità codificanti possono essere usati anche nucleotidi;

l'oligonucleotide risultante può essere amplificato tramite PCR (polimerase

chain reaction) fino a raggiungere la concentrazione adatta ad una facile

sequenziazione.

Nel secondo metodo, messo a punto da Clark Still, i gruppi codificanti

non sono inseriti in sequenza ma si attaccano direttamente alla perlina (Fig.

1.12). E la loro presenza e la loro quantità che codifica con il codice binario

(tipo quello commerciale a barre) il prodotto sintetizzato presente sulla

perlina attiva.

Al termine della sequenza, la perlina trovata attiva viene liberata

dalle molecole codificanti le quali vengono identificate e la loro

composizione stabilisce la struttura del prodotto sulla perlina.

C. Still ha utilizzato una serie di prodotti che si scindono dal supporto

per irradiazione e la cui miscela può essere semplicemente risolta per gas

49

cromatografia; questi prodotti sono mostrati nella figura, ma è chiaro che il

metodo ha una alta flessibilità ed i prodotti possono essere agevolmente

cambiati. Tra l'altro non sono necessarie molte molecole e si può calcolare

che con solo venti molecole, usate secondo una base di due, si possono

codificare 1.048.576 (220) prodotti finali.

Nell’esempio riportato in figura 1.12 un cromatogramma che mostri

quantità uguali di T , T , T e T indica inequivocabilmente il dimero CF.

1 2 3 4 50

Figura 1.12. Schema di sintesi parcellizzata e codificata secondo Still.

Le frecce indicano il susseguirsi delle fasi di mescolamento, separazione e

accoppiamento, secondo la normale sintesi parcellizzata.

51

Un esempio di questa tecnica, sviluppato dalla Industria farmaceutica

Pharmacopeia, che utilizza la scissione successiva di ligando e di codice

tramite reazioni fotoossidative è mostrato qui di seguito.

1.8.8. Metodo degli spilli (Multipin method). In questa metodologia

introdotta da Geysen nel 1984, la sintesi (si tratta di una sintesi parallela) si

fa avvenire sulla punta (opportunamente modificata ad esempio con

l'inserzione di un copolimero di acido acrilico) di piccoli bastoncelli di

polietilene, sistemati in modo da poter essere immersi contemporaneamente

nei contenitori di una piastra di microtitolazione (Fig. 1.13). Si possono

52

µmoli

produrre fino a 2 per spillo. Si possono utilizzare formati diversi, ma

il più comune è costituito da 96 bastoncelli supportati su una piastra di

polietilene che si adattano ad una piastra con altrettante vaschette. Le

vaschette sono riempite con il reattivo opportuno, secondo la strategia

combinatoriale scelta, e l'operazione viene ripetuta quante volte è

necessario. Ogni prodotto finale è univocamente determinato dalla

posizione e dalla storia chimica della vaschetta corrispondente. Questo

metodo che è naturalmente adatto per costruire un numero limitato di

prodotti, si presta ad essere automatizzato. L'analisi biologica può essere

fatta sul prodotto legato o su prodotti solubilizzati quando si sia usato un

linker opportuno.

Figura 1.13. Attrezzatura per sintesi combinatoriale con il metodo

degli spilli.

Nella figura 1.14 è esemplificata una semplicissima strategia per

questo tipo di approccio. Il disegno mostra la disposizione dei reagenti nelle

53

vaschette e il tipo di molecole che si trovano sulla testa dello spillo dopo la

reazione.

Come già accennato, questo metodo può essere facilmente adattato

alla sintesi in fase liquida facendo avvenire le reazioni in batterie di

contenitori opportunamente disegnati.

Figura 1.14. Esempio di sintesi con il metodo degli spilli. Strategia a

strisce ortogonali .

1.8.9. Metodo fotolitografico. Questo metodo, nel quale vengono

combinate la tecnica fotolitografica e quella fotochimica, è particolarmente

adatto per la sintesi di polipeptidi, oligonucleotidi e prodotti analoghi.

Si possono utilizzare vetrini da microscopio di vetro borosilicato sui

quali vengono ancorati i monomeri protetti con un proteggente che si può

eliminare per fotolisi. L'uso di maschere protettive permette la attivazione e

quindi la successiva reazione di zone ben definite del supporto. Il numero

dei prodotti che si possono sintetizzare è limitato solo dalla risoluzione, che

deve permettere di identificare chiaramente due siti contigui. Al termine il

54

vetrino è esposto alla interazione con il recettore usualmente accoppiato ad

un prodotto fluorescente. Dopo accurato lavaggio, la scansione con un

microscopio a fluorescenza permette di identificare il prodotto attivo la cui

struttura è definita dalla sua posizione sulla lastrina. Il metodo è stato

miniaturizzato: in questo caso è essenziale raggiungere una buona

risoluzione tra siti di sintesi contigui; si possono avere 40.000 siti di sintesi

distinguibili in uno spazio di un centimetro quadro. Questa tecnica

sviluppata dalla Affimax è anche nota sotto il nome di VLSIPS (very large-

scale immobilized polimer synthesis).

Seguendo la schematizzazione della figura 1.15: 1) un adatto gruppo

reattivo (per esempio un aminoacido) è innestato su di un supporto solido;

2) il gruppo amminico, su cui si effettueranno le successive reazioni, viene

opportunamente protetto con un proteggente fotolabile (X); 3, 4) usando

una maschera opportunamente disegnata, una parte del supporto viene

esposta ed irradiata per eliminare il gruppo proteggente dai gruppi ivi

localizzati; 5) i gruppi deprotetti vengono fatti reagire con il reattivo

opportuno (A); 6) i gruppi introdotti vengono di nuovo protetti; 7) una

nuova maschera viene usata per selezionare i gruppi da deproteggere; 8, 9)

i gruppi deprotetti vengono fatti reagire con un nuovo reagente (B); 10) si

procede ad una nuova protezione e così via fino al completamento del

disegno sperimentale. 55

Figura 1.15. Procedimento per la sintesi fotolitografica. X = gruppo

proteggente fotosensibile. A, B = reagenti.

Utilizzando questa metodologia su un semplicissimo sistema quale

quello dell'esempio precedente si può operare secondo la figura 1.16.

56

Figura 1.16. Una semplice strategia di sintesi fotolitografica. a:

illumina; b: accoppia; c: proteggi.

1.8.10. Esempi di applicazioni. Utilizzando alcune delle strategie

descritte in precedenza sono state costruite in questi ultimi tempi un gran

numero di librerie. I due esempi che seguono vogliono semplicemente dare

una idea della utilizzazione di questa metodologia. Gordon e collaboratori

57

hanno costruito, secondo lo schema sintetico che segue, una libreria di 1000

×1O

membri [10(R )×10(R2) (R3) ].

1

Dalla libreria è stato estratto un prodotto con una affinità

nanomolare per il recettore della neurochinina-2.

Kurt e collaboratori hanno invece ottenuto, mediante sintesi in fase

solida ma con deconvoluzione dei prodotti solubilizzati, una libreria di

dimensioni ridotte (27 prodotti) contenente 1,3-dioli arilici secondo lo

schema seguente. 58


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DESCRIZIONE APPUNTO

Appunti di Chimica farmaceutica della professoressa Grasso sulla progettazione di farmaci a partire dal LEAD, parte prima con analisi dei seguenti argomenti: il punto di partenza (Lead), farmaci preesistenti, scoperta casuale, screening a tappeto e mirato, sostanze di origina naturale, amplificazione di effetti secondari, sintesi razionale, librerie combinatoriali.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in chimica e tecnologia farmaceutiche
SSD:
Università: Messina - Unime
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher valeria0186 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Chimica farmaceutica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Messina - Unime o del prof Grasso Silvana.

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