appunti di chimica farmaceutica 3

SAGGI SU LARGA SCALA

I saggi tradizionali sono stati gli unici impiegati per lo sviluppo di farmaci fino agli anni '90. Negli anni '90, grazie allo sviluppo delle tecnologie e dell'automazione, è stato possibile sviluppare saggi su larga scala per studiare un elevato numero di molecole su un singolo bersaglio biologico. Con questo studio è possibile trovare i composti in grado di legare il bersaglio biologico che non necessariamente dovranno avere un'elevata potenza; queste molecole vengono definite HIT. In una seconda fase, con l'applicazione delle conoscenze della chimica farmaceutica, è possibile effettuare trasformazioni chimiche sugli HIT migliorandone le proprietà farmacodinamiche e farmacocinetiche (compresa la potenza) prima di testarli su modelli animali. Con il termine LEAD si indica una molecola che, oltre ad avere affinità per il bersaglio biologico, ha una buona potenza e solubilità, per cui la si può testare nell'animale.

Il passaggio dal composto HIT al composto LEAD prende il nome di hit to lead optimization. Non sempre il LEAD ha proprietà ottimali: potrebbe infatti trattarsi di una molecola non selettiva che interagendo con altri bersagli biologici causa degli effetti collaterali. In questo caso il LEAD necessita di un secondo ciclo di ottimizzazione che prende il nome di lead optimization. In seguito al LEAD optimization si ottiene un candidato farmaco: una molecola che ha mostrato nei test in vivo sugli animali di avere efficacia e assenza di tossicità e di particolari effetti collaterali per cui si può procedere chiedendo l'autorizzazione per gli studi clinici. Lo strumento che ha permesso lo sviluppo di saggi su larga scala è la piastra multipozzetto, già utilizzata negli anni '60 per lo studio dell'interazione antigene-anticorpo. Questo tipo di piastra, costituita inizialmente da 96 pozzetti, è stata ampliata fino a contenere 1536 pozzetti.Grazie a sistemi automatizzati è possibile effettuare delle aggiunte in ciascun pozzetto per effettuare dei saggi biologici su 1500 differenti molecole in tempi ridotti. La differenza tra i saggi tradizionali e i saggi su larga scala si hanno a livello dei materiali impiegati, delle quantità di reattivi utilizzati e della tipologia di lettura del saggio per capire se la molecola è in grado o meno di modulare il bersaglio biologico. Ad esempio per un saggio tradizionale il protocollo utilizzato per il disegno sperimentali può essere molto complesso, prevedere diversi passaggi, aspirazioni e lavaggi; per un saggio su larga scala invece è possibile utilizzare solo operazioni semplici preferibilmente addizioni. Per quanto riguarda i volumi impiegati, per un saggio al banco si utilizzano quantitativi che vanno dai µL ai ml mentre nel saggio a larga scala si utilizzano pochi µL. Inoltre mentre in un saggio al banco è possibile utilizzaresu larga scala richiede l'utilizzo di strumenti statistici avanzati per estrarre informazioni significative dai risultati. Inoltre, i saggi su larga scala sono spesso automatizzati, con l'utilizzo di robot e sistemi di gestione dei campioni per aumentare l'efficienza e ridurre gli errori umani. In conclusione, i saggi su larga scala sono una potente e rapida metodologia per lo screening di grandi librerie di composti, consentendo di identificare molecole con attività biologica desiderata in modo efficiente. Tuttavia, è importante considerare le limitazioni e le differenze rispetto ai saggi tradizionali, al fine di interpretare correttamente i risultati ottenuti.tradizionali viene effettuata su base statistica da parte di un operatore; per i saggi a larga scala i dati vengono elaborati dal computer. Poiché i saggi su larga scala sono dei saggi artificiosi e non sempre corrispondono a ciò che realmente accade all'interno della cellula, i dati ricavati necessitano di una conferma da parte dei saggi tradizionali. Generalmente si procede iniziando a fare un singolo saggio su larga scala su una libreria di composti. In questo primo saggio i composti verranno testati ad un'unica concentrazione di 50 µM per capire quali molecole sono in grado di legare il bersaglio. Misurando la variazione di luminescenza o di fluorescenza il software indica i composti attivi. Si selezionano quindi le molecole in grado di modulare il bersaglio; per verificare l'attività di tali molecole si prepara un secondo saggio in triplicato in cui si usano concentrazioni crescenti di ciascun composto. Si ricava l'EC o l'IC cheindica una potenza di tipo biofisico perché è rilevata con fluorescenza o luminescenza e non con i metodi farmacologici tradizionali. Una volta confermata l'attività di queste molecole, si effettuano i saggi tradizionali costruendo una curva dose-risposta a 10 punti per capire l'effettiva potenza e il profilo farmacologico (agonista, antagonista, agonista parziale, inibitore competitivo, non competitivo ecc). Nel momento in cui si progetta un saggio a larga scala ci si deve assicurare che questo abbia una elevata sensibilità in modo tale che riconosca anche molecole con una bassa potenza. Inoltre il saggio deve essere riproducibile e stabile rispondendo alla stessa maniera quando si testa uno stesso composto alla stessa concentrazione. Altro aspetto importante è che vengano utilizzati controlli positivi e negativi. Se ad esempio si è sviluppato un saggio su larga scala per un recettore accoppiato a una proteina G, prima di testare su.di esso molecole incognite bisogna testare molecole riportate in letteratura ottenendo i risultati aspettati ( gli agonisti devono attivare il recettore, le molecole inattive non devono dare alcuna risposta). Nel caso in cui in letteratura non sia riportato alcun dato in quanto il bersaglio biologico scelto è molto innovativo potrebbero insorgere dei problemi nella sperimentazione in quanto non si avranno a disposizione il controllo negativo e positivo. I saggi su larga scala non sono importanti soltanto nel campo della farmacodinamica ma anche della farmacocinetica per valutare la presenza di interazioni off-target o l'interazione tra farmaci. Poiché il segnale di risposta del saggio si basa sulla luminescenza o sulla fluorescenza è necessario ingegnerizzare una proteina affinché produca luminescenza o fluorescenza. Tra i metodi per rendere fluorescente il bersaglio biologico ci sono: 1. utilizzo di sonde fluorescenti (come i lantanidi trivalenti) che

Vengono legate sul substrato di un enzima. Quando la sonda è legata al substrato non emette fluorescenza in quanto il substrato fa da ingombro sterico. Nel momento in cui il substrato legato alla sonda viene messo a contatto con l'enzima, questo scinde il legame e la sonda emette fluorescenza.

In un saggio su larga scala nei vari pozzetti viene messo il substrato dell'enzima legato alla sonda, successivamente si aggiunge ad ogni pozzetto una diversa molecola chimica che si vuole testare su un dato enzima e infine viene aggiunto l'enzima. Nei pozzetti in cui si nota fluorescenza il substrato è stato processato e trasformato in prodotto nonostante la presenza di un'altra molecola chimica; nei pozzetti in cui non si ha fluorescenza l'enzima non ha trasformato il substrato in prodotto a causa della presenza di una terza molecola che si comporta da inibitore.

Nel secondo esperimento queste molecole vengono testate a diverse concentrazioni e si valuta lo...

spegnimento della fluorescenza. Sicostruisce una curva sigmoidale dalla quale si può ricavare una sorta di IC . Attraverso saggi tradizionali si ricavano infine informazioni sulla tipologia di inibitori. Questo tipo di sonde possono essere utilizzate in saggio su larga scala in cui si testano molecole chimiche sui recettori accoppiati alle proteine G. La proteina G è costituita da 3 subunità α, β e γ; nello stato di riposo la proteina si trova sotto forma di trimero e alla subunità α è legato il GDP. Quando un agonista si lega al recettore, la proteina G subisce un cambiamento conformazionale: il recettore si lega al trimero: ciò induce il rilascio del GDP che viene scambiato con GTP e in seguito la scissione del trimero con rilascio di α-GTP e il dimero β-γ. Il ciclo termina con l'idrolisi del GTP a GDP da parte della subunità α che torna ad associarsi con il dimero β-γ. La

La sonda fluorescente Europio viene attaccata all'ultimo fosfato dell'ATP, quello che si viene a liberare in seguito all'idrolisi del GTP in GDP. Nel momento in cui si testa un agonista del recettore, si dà il via a tutte le modifiche conformazionali descritte prima e nel citosol si forma un gruppo fosfato legato ad una sonda che emette fluorescenza.

FRET: uso di sonde fluorescenti che trasferiscono energia ad altri cromofori o fluorofori che, eccitandosi, emettono ad una lunghezza d'onda diversa che viene registrata per valutare se c'è stata interazione tra il bersaglio biologico e il composto chimico. Anche in questo saggio si utilizza un recettore accoppiato a proteina G che ha come secondo messaggero l'aumento di cAMP. Si prepara un reattivo costituito da una sonda di Eu legato alla streptavidina e una molecola di cAMP legato alla biotina; è poi presente un anticorpo che riconosce in maniera specifica il cAMP e che è legato ad un cromoforo.

In condizioni basali il recettore non è attivo e l'unico cAMP presente è quello aggiunto con il reattivo e legato alla biotina. Poiché la biotina ha un'elevata affinità per la streptavidina si troverà associata ad essa: si forma un complesso anticorpo-cAMP-biotina-streptavidina-europio. Quando si irradia alla lunghezza d'onda di eccitazione dell'europio, 340 nm, questo si eccita ed emette fluorescenza che viene assorbita dal cromoforo legato all'anticorpo. Il cromoforo viene eccitato ed emette ad una lunghezza d'onda di 665 nm che viene monitorata dal computer. Quando si registra un'emissione a tale lunghezza d'onda significa che il recettore è in conformazione di riposo. Nel caso in cui il recettore sia attivato da un agonista, si ha un aumento di cAMP citosolico e avviene una sorta di competizione tra il cAMP endogeno e quello legato alla biotina per l'anticorpo. Ciò induce une sonda fluorescente è che nel FRET si sfrutta l'interazione tra due molecole, una donatrice e una accettatrice di energia, mentre nell'esperimento con la sonda fluorescente si utilizza solo una molecola. Inoltre, nel FRET è possibile misurare la distanza tra le due molecole, mentre nell'esperimento con la sonda fluorescente si può solo rilevare la presenza o l'assenza di fluorescenza.