Biotecnologie microbiche, prof. Fortina

COSTRUZIONE DEI PRIMERS

Costruire i primers significa che devo conoscere già quella che è la sequenza almeno degli estremi della regione che voglio amplificare, perché se non conosco la sequenza non potrò costruire i primers che si legano in modo specifico a una regione interna. In alcuni casi, poiché lavoriamo in regioni altamente conservate in tutti i batteri, potremo utilizzare dei primers universali, cioè che servono per amplificare specifiche regioni altamente conservate in tutti i batteri, senza che io conosca a priori per il mio isolato, la sequenza dei primers che devo utilizzare. Amplifico se conosco gli estremi della regione che voglio amplificare, sennò non si riesce perché questi primers devono essere omologhi soprattutto nel loro 3' finale alla regione da amplificare, perché se non si lega bene l'ultimo nucleotide è un problema. A volte non si conosce del tutto la sequenza ma dei 10, 11 nucleotidi.

Amplicone utilizzeremo dei marker lineari il cui renge verrà scelto in funzione del PM atteso. A volte si possono ottenere più bande da un amplificazione e noi dobbiamo sapere quando aspettarci di vederle per avere informazioni sulla specificità della reazione. Perché in alcuni casi la specificità della reazione è tale da doverci fare vedere una sola banda e se ne vediamo di più dobbiamo essere certi che quel ciclo di amplificazioni era sbagliato, non era così specifico come pensavamo o abbiamo sbagliato qualche parametro. In altri casi invece la presenza di 2 o più bande è qualcosa di atteso a seconda di quale è la regione target che decido di studiare. Se ottengo più bande presumibilmente quella regione che amplifico è presente in più copie nel cromosoma ma ha una caratteristica differente lunghezza, sono tutte cose che vanno valutate in funzione della regione target e del MO che stiamo utilizzando.

studiando.Le sequenze dei vari geni sono riportate nelle banche dati solo per un filamento, il 5’3’ e non per quellocomplementare, quando devo costruire il primer faccio affidamento solo sulla sequenza presente in bancadati, quindi ricordiamo che i 2 primer vanno costruiti in modo da ricordarsi che uno dei 2 è quello checorrisponde alla fine del filamento, ma va posto come complementare e nella direzione opposta,utilizziamo i primers solo nella direzione 5’3’, perché il 3’ deve essere libero, cosi che vi si possaagganciare la DNA polimerasi.

19/11/12Quindi i limiti della PCR sono:

• Conoscere la sequenza della regione da amplificare (sennò non potremmo costruire dei primersidonei, perché non si appaierebbero!)
• È limitata dalla nostra capacità di disegnare dei giusti primers dobbiamo ricordarci che per laloro costruzione facciamo riferimento alla sequenza del filamento delle banche dati che è

indirezione 5’→3’, quindi dobbiamo ricordarci che essi vanno costruiti sempre in direzione 5’→3’, 43l’OH del 3’ deve essere libero perché vi si agganci la DNA polimerasi e mentre un primer chiamato follower non è altro che la copia delle prime 10-15 paia di basi presenti su un filamento dellaregione da amplificare, l’altro dovrà considerare la fine della sequenza, ed è il primer che viene chiamato reverse, che dovrà essere copiato come complementare e di cui sarà invertita la direzione, affinché venga poi letto nella direzione 5’→3’. Se non gli diamo la direzione giusta avviene un’amplificazione divergente, cioè che amplifica la zona esterna alla regione di interesse!

APPLICAZIONI DELLA PCR

Supponiamo di conoscere la sequenza che vogliamo amplificare, quindi siamo in grado di costruire una coppia di primers e andare a verificare che lungo un genoma, quei primers si legano

Il DNA totale della comunità batterica presente, perché se è vero che quei primers sono specifici solo per salmonella tifi si legheranno solo al suo e non a quello delle altre specie eventualmente presenti. Nell'arco di poche ore di PCR avremo un amplicone che posto in gel elettroforesi ci dirà se è quello di Salmonella tifi, perché avremo da valutare la presenza della banda e il PM che ci aspettavamo per quell'amplicone. Questa regione può essere un gene ma anche una regione nucleotidica non codificante ma che risulta essere presente in tutti i ceppi della specie con una sequenza che non deve per forza essere uguale al 100% per tutta la regione, l'importante è che siano sempre confermate le sequenze di base all'inizio e alla fine, cioè i famosi primers. L'amplificazione di una sonda specie-specifica si riferisce il più delle volte ad una regione che è presente in una copia singola in tutto.

Il cromosoma e quindi la sua amplificazione mi dà luogo ad una sola banda che ha PM= a quello indicato nel riferimento bibliografico. In altri casi è possibile che quella regione sia presente in più copie e che siano mantenuti solo gli estremi, delle variazioni di lunghezza possono dare luogo a più bande, ma questo deve essere specificato nell'articolo che utilizziamo per fare il nostro esperimento. Nella maggior parte dei casi ci dobbiamo aspettare una banda sola con un determinato PM. In questo caso l'amplificazione è un metodo qualitativo, mi dice se c'è o non c'è, ma non mi dice quanta ce n'è! Più avanti vedremo che è stata messa a punto una PCR anche quantitativa. Non è che quando una sonda si costruisce su un gene è perché quel gene è presente solo in quella specie, ma è presente solo in quella specie con quella particolare sequenza nucleotidica, in una regione.

interna del44gene che permette di avere la risposta positiva all'amplificazione solo per quella specie e di solito sonoregioni interne del gene, non necessariamente la sonda deve permettere l'amplificazione dell'intero gene, l'importante è che all'interno del gene ci sia una zona che è conservata solo nella specie in questione ediversa nelle altre specie. In alcuni casi come dicevamo, come per esempio per l'Enterococcus fecium è unaregione non codificante ma che all'interno di questa specie, risulta avere una sequenza conservata e su diessa è stata costruita una coppia di primers. Alcune sonde specie-specifiche sono costruite sul gene 16S quando non si ha la conoscenza dell'interogenoma di quella specie, poiché è vero che il gene 16S è una regione altamente conservata, ma puòpresentare delle minime variazioni di sequenza (abbiamo detto che 2 ceppi appartengono alla stessa speciese

Un certo polimorfismo in alcuni punti del gene che codifica per il 16S e questo polimorfismo se è sempre uguale all'interno dei ceppi appartenenti alla stessa specie può essere sfruttato per costruire dei primers che non sono omologhi al 100% ma che sono specifici nelle loro ultime.