Biotecnologie microbiche, prof. Fortina

Fortina - biotecnologie microbiche (fermentazioni industriali)

La cellula procariotica come modello di studio e di applicazione

La cellula procariota è un modello semplice da studiare poiché ha un solo cromosoma (aploide), il che non implica che la cellula batterica sia meno complessa di quella eucariota. La semplicità è tuttavia solo strutturale in quanto il cromosoma va da 1 a 4-5 milioni di paia di basi in sequenza. Questo DNA cromosomale nativo ha una conformazione CCC circolare covalentemente chiusa ed è una molecola superavvolta in modo specifico. Infatti, avvolgimento e disavvolgimento sono guidati dalla cellula stessa per permetterle di svolgere le fasi fondamentali della propria vita, coinvolgendo numerosi enzimi e proteine deputati solo a fare quello (se la cellula si sbaglia in una di queste fasi, difficilmente potrà sopravvivere).

Il fatto che la cellula possieda un unico cromosoma ha consentito di studiare molto più facilmente il processo relativo al trasferimento dell’informazione genica dal DNA alla sintesi proteica. Inoltre, i batteri possono possedere dei plasmidi (DNA extracromosomale) tipici della cellula procariota. Si tratta di molecole (non dire "è un frammento di DNA!") anch’essi in forma CCC e, il più delle volte, anch’essi superavvolti. L’unica differenza è che è separata dal DNA cromosomale.

Plasmidi ed elementi genetici mobili

I plasmidi possono essere o no presenti nelle cellule batteriche e sono anche detti elementi genetici mobili, perché sono molecole che la cellula può acquisire dall’esterno attraverso varie modalità ma che può anche facilmente perdere. Magari in un ceppo microbico ci sono dei plasmidi, ma se noi andiamo ad analizzarli dopo un po’ di tempo, questi plasmidi non li troviamo più. Il perché la cellula li acquista o li perda dipende dalle condizioni in cui la cellula si trova, perché i plasmidi codificano delle informazioni che non sono fondamentali per la vita ma addizionali e la possono aiutare in particolari condizioni ambientali.

Poiché a causa di diversi fenomeni possono essere persi, è pensabile che nel corso dell’evoluzione la cellula abbia fatto in modo che non contenessero info fondamentali così che la cellula non perdesse anche la capacità di sopravvivere! Queste info addizionali che i plasmidi possiedono per noi possono essere molto utili. Alcuni plasmidi possiedono la capacità di produrre enzimi che possiamo usare in certi processi, ad esempio, detossificanti. Possono inoltre possedere delle resistenze agli antibiotici, che per quanto aiutino la cellula che li contiene a sopravvivere, possono creare dei problemi a noi perché possono essere trasferite attraverso il plasmide da una cellula all’altra all’interno di cellule che magari stanno colonizzando il nostro organismo e resistere quindi agli antibiotici. Questi plasmidi, in alcuni casi, possono anche essere integrati all’interno del DNA cromosomale e prendono il nome di episomi.

Se il plasmide è integrato al DNA cromosomale, si replicherà all’interno dello stesso. Se si trova solo nel citoplasma, potrà replicarsi in modo autonomo e a seconda della necessità della cellula in quel momento potrà formare più copie perché ha dimensioni piccole (il plasmide è una molecola autoreplicante ma è sempre la cellula che dirige il processo perché spesso l’inizio della replicazione dei plasmidi avviene grazie alla presenza di proteine che sono prodotte grazie a geni specifici presenti sul DNA cromosomale). Le cellule procariote si adattano meglio delle eucariote all’ambiente in cui possono venirsi a trovare grazie alla loro semplicità strutturale → semplicità = vantaggio!

I tre domini della vita

Diversi scienziati hanno studiato tutte le cellule, a partire dalle cellule primordiali ritrovate in alcuni fossili confrontate con quelle attuali, costruendo l’albero filogenetico. Si hanno i tre domini della vita:

• Batteri
• Archeobatteri: sono cellule eucariote, qui rientrano tutti quei batteri estremofili, scoperti solo recentemente in habitat nei quali non si pensava che potesse esserci vita (a pH=1, 120°C, vulcani, ghiacciai ecc.). Questi estremofili hanno una cellula procariota ma, per ovvie ragioni, anche un pool enzimatico diverso dalle normali cellule per resistere alle condizioni avverse. Parete e membrana hanno composti diversi che le rendono molto più resistenti. Questi archeobatteri nati da tempo in particolari ambienti si sono così adattati a questi ambienti che hanno acquisito stabilmente queste caratteristiche nel loro materiale genetico, al punto che se li cambiassi di habitat, morirebbero (ad es. in normali condizioni di laboratorio). Possono crescere solo in queste drastiche condizioni.
• Eucarioti (o eucaria): cellule vegetali e animali.

Il fatto che dei tre domini della vita, due siano dati da cellule procariote, conferma il fatto che la semplicità strutturale permetta un migliore adattamento, perché significa che possiamo ritrovare in molti più ambienti differenti una vita procariota piuttosto che eucariota.

La teoria evolutiva dell'endosimbiosi

Dalle tre diramazioni principali si hanno poi molte diramazioni secondarie che vanno a definire tutti i vari tipi diversi di batteri, archeobatteri e cellule eucariote che conosciamo, partendo dalle più semplici fino alle più complesse. Questa è all’incirca la teoria evolutiva dell’endosimbiosi, vale a dire, supponendo che 4 miliardi di anni fa le condizioni particolari che si erano sviluppate sul nostro pianeta, casualmente, si fossero organizzate delle sostanze organiche a dare una cellula primordiale che chiamiamo progenitrice. Questa ha racchiuso al suo interno altre cellule organiche che poi si sono organizzate in modo tale da permettere la riproduzione di queste cellule che inizialmente erano a solo RNA e poi, in un secondo periodo evolutivo, sono diventate cellule a DNA.

Queste cellule ancestrali che si sono assemblate casualmente tanti anni fa hanno colonizzato ambienti differenti trasportate dal vento, acqua ecc., grazie alla loro capacità di adattamento. Man mano che le condizioni ambientali cambiavano (ad es. presenza di ossigeno ecc.), è stato possibile differenziare cellule via via sempre più diverse. Quindi ci si è chiesti come abbiano fatto queste cellule a sopravvivere. In base alla teoria dell’endosimbiosi (una delle teorie più affermate), sembra che in un particolare ambiente, magari difficile da colonizzare, due cellule procariote si siano unite con un processo di simbiosi in cui una cellula procariota è entrata dentro l’altra e poi si siano divise i compiti. La cellula che è entrata dentro l’altra, presumibilmente più grande, ha messo l’utilizzo nel ricavare l’energia e da qui sono nati i mitocondri (cellule procariote che producono energia in cellule eucariote), che hanno il proprio DNA con caratteristiche simili a quelle del DNA batterico e hanno dei propri ribosomi con caratteristiche simili a quelli dei batteri.

Questa è la teoria secondo la quale a partire da cellule procariote si sono ottenute eucariote via via sempre più specializzate fino ad arrivare alla cellula vegetale e animale. Ma ha anche permesso di riuscire ad avere un marker comune con il quale studiare queste distanze evolutive (abbiamo detto che è stato estratto il DNA delle cellule primordiali estratto da dei fossili ed è stato paragonato con quello delle cellule vegetali e animali) → quale poteva essere questo marker comune che potesse permettere questa comparazione e la successiva costruzione di alberi filogenetici?

Una molecola che rappresentasse quello che viene chiamato orologio molecolare, cioè una molecola che dovesse essere necessariamente presente nelle cellule progenitrici e nelle cellule dei giorni dopo, che potesse svolgere la stessa funzione e che fosse anche una molecola che la cellula nel corso di questi miliardi di anni ha cercato il più possibile di proteggere dai cambiamenti di sequenza legati ai fenomeni esterni, cioè di proteggere questo orologio molecolare perché su di questo erano portate delle informazioni necessarie per la vita della cellula. Ce ne sono diversi, quello che useremo di più sarà il gene che codifica per l’RNA ribosomale 16S.

L'RNA ribosomale 16S

Abbiamo detto che la cellula primordiale era una cellula a RNA poi abbiamo detto che la cellula procariota ha dei ribosomi e che tutte le cellule eucariote possiedono dei mitocondri che hanno il proprio ribosoma 2 che è il 16S, questo può rappresentare allora un orologio molecolare perché riusciamo ad avere questo RNA ribosomale presente in tutte queste tipologie di cellule. Ricordiamo che l’RNA ribosomale è uno dei 3 RNA presenti nella cellula che si chiama così perché è presente all’interno dei ribosomi, strutture costituite da 2 subunità fondamentali per fare avvenire la sintesi proteica, chiamate con sigle differenti in funzione della loro densità, e allora nei batteri abbiamo la subunità 30S (Svedberg: ricercatore che ha messo a punto il gradiente di densità con l’ultracentrifugazione che ha permesso di calcolare la densità di questi corpuscoli e di poterli quindi differenziare in base a questa sigla) e 50S. Le 2 subunità sono attive se posseggono al loro interno l’RNA ribosomale e una serie di polipeptidi che permette loro di unirsi e di leggere il messaggio dell’RNA messaggero.

L’RNA ribosomale contenuto nella subunità 30S viene definito RNA 16S (perché ha questa densità), mentre nella subunità più grande del ribosoma batterico, quella che chiamiamo 50S, è presente l’RNA ribosomale 23S. Per esserci nella cellula, questo rRNA deve essere codificato a livello del DNA, per cui tutti i vari DNA possiederanno un gene deputato a sintetizzare l’rRNA 16S, un gene altamente conservato che può essere usato negli studi di filogenesi e quindi rappresenta l’orologio molecolare. La sequenza nucleotidica del gene che lo codifica, nel tempo, ha riportato variazioni di sequenza molto limitate anche tra cellule molto lontane tra di loro, che si sono evolute in condizioni completamente differenti, e per questo è possibile utilizzarlo per confrontare cellule che hanno una distanza evolutiva pazzesca. I ribosomi della cellula eucariota sono grandi perché contengono rRNA con densità maggiore e quindi è stata facile la comparazione. Il ribosoma batterico è il 70S mentre quello delle cellule eucariote è l’80S (40S+60S). Il 70S deriva dalla somma delle 2 subunità 30S + 50S (poiché calcoliamo la densità e non la massa, la somma non fa 80 ma 70, perché 70 è il coefficiente di sedimentazione che si riferisce alla densità e, come tale, le 2 subunità unite a formare il ribosoma attivo non avranno una densità che corrisponde alla somma delle 2 densità che l’hanno prodotto).

Evoluzione e adattamento cellulare

La cellula si è evoluta in funzione della pressione selettiva dell’ambiente in cui si è trovata a vivere. Lo scopo primario della cellula è cercare di colonizzare l’habitat in cui si trova e crescere, cioè aumentare il numero di cellule. Per far ciò, una volta che è riuscita a adattarsi all’ambiente in cui si trova, cercherà di scambiare con esso tutto ciò che le può servire con il fine ultimo di riprodursi. Nello stesso tempo può subire delle modificazioni che sono poi alla base dell’evoluzione e che in parte derivano dall’adattamento ambientale e in parte da eventi casuali (mutazioni che la cellula subisce in quel particolare ambiente) e in parte sono legati ad errori nel processo della riproduzione ma in parte sono dettati e voluti dalla cellula → processi di ricombinazione genetica, per cambiamenti ambientali particolari (indotti dall’ambiente mediante stimoli chimici).

Questi cambiamenti avvengono con una bassissima frequenza in natura, perché sono indotti solo in condizioni ambientali particolari in cui la cellula non ha scelta per sopravvivere. Questo perché si tratta di un rischio perché la cellula sa che può dirigere uno di questi processi ma non sa quale sarà l’esito finale! Cercherà di modificarsi acquisendo del DNA esterno ma non sa a priori se questi cambiamenti la aiuteranno o la uccideranno. Ecco perché per logica non affronta questo rischio quando non ne ha bisogno ma solo se alle strette in un ambiente sfavorevole alla riproduzione, almeno questo vale per due dei tre processi, quello della trasformazione e quello della ricombinazione. Il processo di ricombinazione potrebbe ricordare, ma differisce dalla riproduzione sessuale tipica degli eucarioti, perché qui non c’è una fusione tra due nuclei con la possibilità di rimescolare il materiale genetico dei due nuclei. Qui il processo di ricombinazione del DNA che proviene dai batteri è unidirezionale: c’è sempre una cellula che dona e una che acquisisce, che però non acquisisce tutto il genoma dell’altra cellula ma solo una piccola parte e sono, come abbiamo detto, occasionali!

Processi di ricombinazione genetica

Questi processi di ricombinazione sono stati copiati in laboratorio per poter effettuare degli scambi genetici tra batteri cercando di dirigerli al meglio. Le cellule compiono tre tipi di ricombinazione:

• Trasformazione: Implica l’acquisizione da parte di una cellula ricevente di parte del DNA che proviene da un’altra cellula ma che si ritrova in quel momento libero nello spazio circostante (vale a dire che non c’è in quel momento un contatto tra cellule).
• Coniugazione: Prevede un contatto tra due cellule, una donatrice e una ricevente.
• Trasduzione: Implica anche la presenza di un fago con trasferimento di DNA che viene mediato dalla frazione fagica.

Processo di trasformazione

Vi sono dei batteri che in particolari condizioni si vengono a trovare in uno stato di competenza, cioè hanno ricevuto dei segnali chimici per cui attivano una serie di geni che servono per attivare questo trasferimento genico dall’esterno verso l’interno. Questo stato di competenza dunque è indotto dalle condizioni ambientali ed è guidato da una serie di proteine sintetizzate per quelle specifiche necessità. Il processo prevede che la superficie cellulare venga a contatto con del DNA esterno che può derivare, per esempio, da un habitat naturale colonizzato da diverse tipologie di batteri, da cellule che sono già morte, si sono lisate, hanno rilasciato nel mezzo circostante frazioni del proprio DNA ed esso viene a contatto con la superficie cellulare di una cellula che si trova in uno stato di competenza e viene legato in modo specifico da proteine leganti che lo riconoscono.

Queste rappresentano anche delle proteine di trasporto e lo fanno passare attraverso la membrana. In molti casi, le cellule batteriche non amano portare dentro del DNA a doppio filamento e allora attivano un enzima particolare che è una nucleasi che scinde il doppio filamento in modo tale da portare dentro la cellula un singolo filamento di DNA perché poi sarà più facile l’eventuale incorporazione di questo frammento di DNA all’interno del cromosoma batterico. Poi ci sono delle specifiche proteine che vanno a legarsi ad esso in modo da stabilizzarlo e impedire che, se esso è un po’ lungo, possa ripiegarsi su se stesso e formare dei legami tra le varie basi nucleotidiche.

Dopo di che intervengono altre proteine enzimatiche specifiche per quel processo come la RecA che va a cercare se lungo il DNA cromosomale esiste un sito all’interno del quale quel filamento esterno di DNA possa integrarsi. Se lo trova, farà in modo che questo filamento di DNA si leghi al DNA cromosomale sostituendosi ad una frazione del DNA proprio della cellula. Questo implica che nei successivi stadi della replicazione su uno dei due filamenti di DNA è portata una frazione di DNA differente da quella che aveva originariamente la cellula madre e questo porterà a delle modificazioni che dipenderanno da quella che è l’informazione portata da quel frammento di DNA nuovo, informazioni che noi non sappiamo e non sa neanche la cellula se sono utili oppure dannose.

Se del DNA si inserisce in un punto non corretto, potrebbe bloccare l’azione di geni che stanno vicino e quindi potrebbe portare al blocco della riproduzione e alla crescita cellulare. Ecco perché la cellula rischia, perché se incorpora in un punto dove c’è un’omologia e quindi può sostituire una parte del proprio DNA ma non sa se questo arrecherà un beneficio (le cellule figlie avranno acquisito delle caratteristiche che prima non avevano e che le aiuteranno a crescere meglio in quella particolare condizione) e se la cellula riuscirà manterrò queste informazioni e le trasferirà a tutte le altre cellule figlie, o un danno (la cellula soccombe).

Se invece la RecA non trova nel DNA cromosomale nessun sito dove integrare questo DNA esterno, non spende energia per ributtarlo fuori ma andrà ad attivare delle proteasi specifiche che andranno a idrolizzarlo, rendendo disponibili le basi nucleotidiche che serviranno poi alla cellula in fase di replicazione, per esempio. Ci sono tante nucleasi; come abbiamo detto, il primo tipo deve rompere il frammento di DNA per farne entrare solo uno; in questo caso, attivano invece un enzima specifico che è in grado di rompere i legami tra le basi nucleotidiche in modo da renderle disponibili alla cellula in fase di nuova sintesi.

Processo di coniugazione

Quella che conosciamo meglio è la famosa presenza del pilo F che alcuni batteri Gram- hanno. Il plasmide F è contenuto all’interno delle cellule che posseggono questo pilo F perché su questo plasmide sono bloccate le informazioni per la sintesi di questo pilo. Questo plasmide è piccolo.