Biotecnologie microbiche - Appunti

Biotecnologie microbiche unità didattica 1: biotecnologie genetico molecolari

Prof.ssa Fortina

Cellula procariota

La cellula batterica è sempre stata presa come modello nelle biotecnologie genetiche in quanto è un modello semplice da studiare. Ha un solo cromosoma, detta, quindi, aploide (opposta alle cellule diploidi). Questo non implica che la cellula batterica abbia meno possibilità di avere 32 cromosomi. Si tratta solo di una semplicità strutturale poiché il cromosoma batterico, anche se uno solo, è lunghissimo che varia da 1 a 4-5 milioni di paia di basi che, di conseguenza, contiene tutte le informazioni genetiche che gli eucarioti hanno organizzato nei cromosomi. Questo DNA cromosomale nativo nelle cellule batteriche ha una conformazione detta C-C-C (circolare covalentemente chiusa).

Se fosse un cerchio perfetto avrebbe un diametro molto maggiore rispetto alle dimensioni medie della cellula procariote che lo contiene. Per questo quest’unica molecola di cromosoma è superavvolta in un gomitolo che, a prima vista, potrebbe sembrare casuale. In realtà, la molecola di DNA cromosomale è avvolta in un modo molto preciso e il superavvolgimento e il disavvolgimento sono processi altamente guidati dalla cellula per permettere di svolgere quelle che sono le funzioni fondamentali della cellula (duplicazione, trascrizione, traduzione del messaggio genetico). Sono coinvolti anche numerosi enzimi e proteine specializzati deputati solo a questo ruolo. Se la cellula si sbaglia anche in una di queste fasi, difficilmente riuscirà a sopravvivere.

Il fatto che la cellula contenga un solo cromosoma ha permesso di studiare molto più facilmente tutti i processi di trasferimento dell’informazione genetica e, dal DNA, alla sintesi proteica. In più i batteri possono trasferire del materiale extra-cromosomale che è tipico della cellula procariote che sono i plasmidi. Il plasmide è una molecola di DNA a doppio filamento in forma C-C-C superavvolta extra-cromosomale.

La differenza è, quindi, che è separata dal DNA cromosomale. Può essere presente in alcune cellule batteriche così come possono essere assenti. Ed è per questo che è definito anche come materiale genetico mobile cioè è una molecola che la cellula può acquisire ma anche facilmente perdere. Ci sono ceppi che lo possiedono che, se analizzati dopo del tempo, possono non essere perse. Questo dipende dalle condizioni in cui la cellula si trova. Per tutti questi motivi il plasmide porta informazioni non vitali, bensì addizionali che possono aiutare la cellula in determinate condizioni.

Se contenesse informazioni vitali, porterebbe la cellula ad un elevatissimo rischio di non sopravvivere. Queste informazioni addizionali, a livello applicativo, possono essere utili a noi perché per esempio esistono plasmidi che codificano per enzimi di nostro interesse, esempio enzimi detossificanti, o enzimi per idrolizzare sostanze per noi nocive, come idrocarburi, benzene, toluene, ecc. Studiamo i plasmidi anche perché possono codificare per la resistenza agli antibiotici che, se dal loro punto di vista rappresenta un vantaggio, per noi è un problema nel caso in cui vogliamo utilizzare quel ceppo il quale potrebbe trasferire la resistenza dalla cellula batterica a cellule o da un ceppo all’altro che colonizzano l’organismo umano, il che ovviamente non fa bene.

Il problema è che ad oggi si utilizzano troppi antibiotici per il loro uso indiscriminato a livello degli allevamenti come terapia preventiva. Di conseguenza tutti i microorganismi con cui l’animale viene a contatto potrebbero diventare antibiotico-resistenti. In ambito alimentare non dobbiamo utilizzare ceppi, quindi, che presentano questa caratteristica. Ci sono casi in cui si ha l’integrazione del plasmide nel DNA cromosomale. I m.o. che presentano questa caratteristica vengono detti episomi.

Nel caso in cui il plasmide sia integrato nel DNA cromosomale esso si replicherà insieme al cromosoma. Nel caso in cui il plasmide viva libero nel citoplasma potrà replicarsi in modo autonomo e, in base alle necessità della cellula, potrà essere presente in più copie, grazie alle piccole dimensioni. Quindi, anche se il plasmide è auto-replicante, questo processo è comunque regolato dalla cellula, poiché saranno sempre necessarie delle proteine specifiche prodotte da dei geni specifici presenti sul DNA cromosomale.

Per quanto la cellula procariota sia semplice, dobbiamo vedere questa semplicità come un grande vantaggio che queste cellule hanno avuto di sapersi adattare molto più rapidamente di quanto sappiano fare le eucarioti ai diversi ambienti in cui questi organismi si trovano a vivere. Su questo si basa lo studio filogenetico grazie al quale è stato costruito l’albero filogenetico.

Teoria evolutiva dell'endosimbiosi

Diversi scienziati hanno, tanto tempo fa, classificato tutte le cellule viventi a partire da quella che potrebbe essere una prima cellula primordiale che si potrebbe essere creata casualmente considerata come progenitrice di tutti gli organismi compresi noi, ma che hanno distanze evolutive differenti dalla stessa cellula primordiale. Dallo studio di particolari caratteristiche di questa cellula (a partire da fossili contenenti DNA) e di quelle attuali, sottolineandone le differenze per comparazione, è stato costruito l’albero filogenetico, le cui distanze dei vari 'rami' rappresentano anche le distanze evolutive.

Attraverso la definizione di questo albero sono stati definiti i 3 domini della vita: batteri, archea (o archeobatteri. Cellule procariote ma che comprendono i batteri ritrovati più recentemente in habitat particolarmente estremi: pH = ., nei ghiacciai, negli ambienti sulfurei, elevate concentrazioni di NaCl, ecc. Questi hanno una cellula procariote ma anche delle strutture e un pool di enzimi particolari per renderle resistenti a queste situazioni. Questi batteri si sono così adattati a queste condizioni da aver acquisito stabilmente queste caratteristiche. Tant’è che se prendiamo uno di questi m.o. e lo portiamo in laboratorio alle condizioni standard, muore.) , eucaria (o eucarioti che contengono la cellula vegetale e animale e i funghi).

Il fatto che due dei tre domini siano procarioti dà ragione all’affermazione che la semplicità è sinonimo di adattamento. Questo perché possiamo trovare molto più facilmente, negli ambienti, una vita procariote che una vita eucariote. A partire dalla cellula ancestrale si sono formate le tre diramazione principali, da cui, a sua volta, si formano una serie di diramazioni secondarie che definiscono i vari tipi di batteri ed eucarioti che sono conosciute fino ad arrivare agli organismi più complessi che siamo noi e le piante.

Queste teoria prende il nome di teoria dell’endosimbiosi che suppone che 4 miliardi di anni fa si fossero organizzate delle sostanze organiche a dare una specie di cellula che definiamo progenitrice, una cellula semplice che, riproducendosi, ha integrato altri componenti organici che poi si sono specializzate per permettere la riproduzione delle stesse cellule. Inizialmente le cellule erano ad RNA e solo in un secondo momento evolutivo abbiamo le cellule con DNA.

Queste cellule ancestrali si sono assemblate casualmente sono andate poi, trasportate da acqua, vento, ecc., a colonizzare diversi ambienti grazie alla capacità di adattamento della cellula. Le cellule eucariote, secondo questa teoria dell’endosimbiosi, sono nate dopo che, in un ambiente particolarmente difficile da colonizzare, due cellule abbiano ‘deciso’ di vivere insieme in un rapporto di simbiosi in cui una cellula procariote sia entrata in un’altra procariote per ‘dividersi’ i compiti. La prima, più piccola, si è poi specializzata nel produrre energia differenziando i mitocondri.

Ci sono delle evidenze scientifiche a sostegno di ciò, come il fatto che i mitocondri abbiano un proprio DNA. Da questa prima cellula eucariota poi, sotto la pressione selettiva esercitata da ambienti diversi, si sono specializzate cellule eucariote diverse fino a quelle animale e vegetale, più complesse. Questo ha anche permesso di riuscire ad avere un marker comune con il quale andare a studiare queste distanza evolutive.

Il marker che ha permesso la comparazione e successiva creazione dell’albero filogenetico è una molecola che può rappresentare il cosiddetto orologio molecolare, cioè una molecola che doveva essere presente necessariamente dalla cellula progenitrice fino alle cellule attuali, nelle quali svolgesse la stessa funzione e che la cellula, nel corso di questi miliardi di anni, ha cercato di proteggere il più possibile dai cambiamenti di sequenza legati alle condizioni esterne, dovuto al fatto che contiene informazioni essenziali alla vita della cellula.

Possono essere diversi gli orologi molecolari ma la molecola più comunemente usata si è rivelata essere è il gene che codifica per RNA ribosomale 16s. Questa ipotesi trova conferma nel fatto che la cellula ancestrale possiedono RNA (e non DNA) e che i ribosomi delle cellule procariote hanno un loro cromosoma, appunto, 16s.

L’RNA ribosomale è uno degli RNA contenuti nella cellula, così chiamata perché, appunto, contenuto nei ribosomi che sono delle strutture costituite da due sub-unità, chiamate con sigle differenti in funzione della densità di questi corpuscoli, nelle quali avviene la sintesi proteiche. Nei batteri abbiamo la sub-unità 30S e 50S (Svedberg: il ricercatore che ha messo appunto l’ultracentrifugazione utilizzata per calcolare le densità detto coefficiente di sedimentazione).

Queste due sub-unità sono attive se contengono al loro interno l’RNA ribosomale (rRNA) e una serie di polipeptidi la cui attività permette alle due sub-unità di unirsi e di leggere il messaggio dell’RNA messaggero (mRNA). L’rRNA contenuto nella sub-unità 30S viene definito RNA ribosomale 16s. Mentre quello nella sub-unità da 50S viene chiamato 23s.

L’rRNA viene codificato a livello del DNA che conterrà un gene che codifica, appunto, per l’rRNA. Questo è un gene altamente conservato che può essere utilizzato negli studi di filogenesi. La sequenza nucleotidica che codifica per questo rRNA ha, nel tempo, riportato pochissime variazioni di sequenze anche tra cellule molto lontane tra loro, sviluppate in condizioni totalmente diverse. Di conseguenza è possibile comparare cellule che hanno grandi distanze evolutive anche ampie.

La cellula eucariota possiede ribosomi diversi, più grandi con sub-unità di densità maggiore. Il ribosoma batterico si identifica con la sigla 70S che deriva dalla ‘somma’ delle due sub-unità. Non è, però, una somma aritmetica: 30 + 50 non fa 70 matematicamente, ma fa 70 ‘biologicamente’ per via del coefficiente di sedimentazione, per cui il ribosoma non è dato dalla somma delle densità delle sub-unità. È inoltre il gene che viene utilizzato in tante metodiche di laboratorio.

Processi di ricombinazione genetica

L’obiettivo dei batteri è quello di colonizzare l’ambiente in cui vive attraverso la crescita, cioè si intende l’aumento del numero di cellule. L’aumento del numero di cellule porta ad una comunicazione tra cellule aumentando il turnover interno per portare avanti la specie attraverso le cellule figlie. La cellula, quindi, scambia con l’esterno tutto ciò che è necessario a tal fine. La cellula può, inoltre, subire delle modificazioni che sono poi alla base dell’evoluzione.

Queste modificazioni in parte derivano dall’adattamento ambientale, in parte da eventi casuali come mutazioni che la cellula subisce nell’ambiente, in parte ad errori in fase di riproduzione ma in parte sono dettati e voluti dalla cellula come i processi di ricombinazione genetica per crescere meglio nelle condizioni in cui si trova. Nonostante ciò le ricombinazioni avvengono con una frequenza bassissima in natura perché vengono indotti solo in condizioni particolari in cui non può scegliere: o cerca di cambiare o soccombe. La cellula sa di poter dirigere uno di questi processi, ma non sa l’esito della sua ‘scelta’: può scegliere di acquisire del nuovo DNA ma non sa se sarà mortale o no.

Per questo non affronta questo rischio se non strettamente necessario. Questo vale almeno per due dei tre processi: trasformazione e coniugazione. Mentre nel terzo processo, si tratta di una situazione a metà, in seguito ad un’infezione fagica da cui la cellula è si malata, ma fa affidamento su un errore del fago per riuscire a sopravvivere acquisendo altre caratteristiche. Questi processi potrebbero somigliare a quella che nella cellula eucariota avviene nella vera riproduzione sessuata delle cellule, differisce però dalla riproduzione vera è propria perché nei procarioti non avviene la fusione di due nuclei, ma uno scambio unidirezionale: ci sarà sempre una cellula che dona e una che riceve.

Non acquisisce, però, tutto il genoma di un’altra cellula, anche se potrebbe; non lo fa perché per una cellula semplice come quella procariote l’intero genoma porterebbe più danno che bene.

Trasformazione

Per definizione implica l’acquisizione da parte di una cellula ricevente di parte del DNA che proviene da un’altra cellula ma che, in quel momento, si trova libero nell’ambiente circostante. Vi sono dei batteri che in particolari condizioni si vengono a trovare nel cosiddetto stato di competenza: hanno ricevuto dei segnali chimici per cui attivano una serie di geni predisposti a sintetizzare delle molecole che servono per questo processo di trasferimento genico dall’esterno verso l’interno.

Questo stato di competenza è quindi indotto dalle condizioni ambientali e guidato da una serie di proteine che vengono sintetizzate per questa specifica necessità. Il processo prevede che la superficie cellulare venga a contatto con DNA esterno che provenga, per esempio, da un habitat naturale colonizzato da diverse tipologie di batteri o da cellule di batteri morti che si sono lisate rilasciando frazioni di DNA libero che raggiunge la superficie delle cellule in stato di competenza, sulla quale viene legato da proteine specifiche che riconoscono le molecole di DNA, per un passaggio selettivo.

In molti casi le cellule non fanno entrare DNA a doppio filamento, per cui posseggono delle nucleasi che scinde il doppio filamento in modo da portare all’interno della cellula un solo filamento che sarà più facilmente integrabile nel cromosoma batterico. Ci sono poi delle specifiche proteine che vanno a legarsi a questo singolo filamento di DNA in modo tale da stabilizzarlo per impedirne l’avvolgimento (qualora dovesse essere abbastanza lungo) che creerebbe la formazione di legami intramolecolari tra le basi nucleotidiche.

Dopo di che intervengono altre proteine enzimatiche specifiche per questo processo, come la recA, che cerca se lungo il DNA cromosomale esiste un sito all’interno del quale quel filamento esterno di DNA può integrarsi. In caso affermativo, il frammento di DNA esterno si legherà al cromosoma sostituendo una frazione di DNA esistente.

Questo implica che, nei successivi stadi della replicazione, sul DNA cromosomale è portato un filamento del DNA nuovo che apporterà delle modificazioni rispetto all’informazione originaria della cellula madre che dipenderanno dalle informazioni portate da quel singolo filamento di cui la cellula non conosce l’utilità o la dannosità o addirittura la morte. Se del DNA si inserisce in un punto non corretto potrebbe bloccare l’azione di geni vicini che potrebbero portare all’inattivazione della crescita e riproduzione cellulare. Da qui il rischio della trasformazione.

Se apporterà un danno la cellula soccombe. Se apporterà un vantaggio, le cellule figlie avranno acquisito delle informazioni e caratteristiche addizionali che prima non esistevano che, se fortunata, le permetteranno di vivere meglio nell’ambiente in cui si trova e, se riuscirà, conserverà tale informazione e la trasferirà alle cellule figlie.

Se, invece, questo filamento singolo non trova alcun sito lungo il DNA cromosomale, la cellula non sprecherà energia per portarla di nuovo all’esterno. Bensì attiverà delle altre nucleasi specifiche che andranno a idrolizzare quel filamento di DNA esterno rendendo disponibili le basi nucleotidiche che utilizzerà in fase di replicazione in una successiva sintesi.

Coniugazione

Prevedono un contatto tra le cellule donatrice e ricevente. Quello più conosciuto è la coniugazione che avviene attraverso un pilo a carico del plasmide F che alcuni Gram negativi posseggono. Il plasmide F è un plasmide contenuto all’interno delle cellule che posseggono il pilo contenente le informazioni per la sintesi del pilo stesso. Questo plasmide è abbastanza piccolo che porta le informazioni per la propria replicazione e per la sintesi del pilo e, solitamente, si trova come molecola extra-cromosomale, cioè staccato dal DNA cromosomale.

Quando avviene il contatto, che riduce la distanza tra i due m.o., di una cellula F+ (donatrice) con una cellula detta F- (ricevente perché priva del plasmide F), il plasmide migra dalla cellula F+ alla cellula F- attraverso un processo di srotolamento, detto ‘rolling circle’, dalla sua forma rilassata circolare del plasmide con la rottura di un singolo filamento il quale passa attraverso il pilo F il quale forma il ponte coniugativo, inserendosi nella cellula ricevente. Questo avviene perché la cellula F+ non vuole perdere l’intero...