Biotecnologie microbiche - Appunti

Biotecnologie microbiche unità didattica 1:

biotecnologie genetico molecolari

Prof. ssa Fortina

CELLULA PROCARIOTA

La cellula batterica è sempre stata presa come modella nelle biotecnologie genetiche in

quanto è un modello semplice da studiare. Ha un solo cromosoma detta, quindi, aploide

(opposta alle cellule diploidi). Questo non implica che la cellula batterica abbia meno

possibilità di avere 32 cromosomi. Si tratta solo di una semplicità strutturale poiché il

cromosoma batterico, anche se uno solo, è lunghissimo che varia da 1 a 4-5 milioni di paia

di basi che, di conseguenza, contiene tutte le informazioni genetiche che gli eucarioti

hanno organizzato nei cromosomi.

Questo DNA cromosomale nativo nelle cellule batteriche ha una conformazione detta

C-C-C (circolare covalentemente chiusa).

Se fosse un cerchio perfetto avrebbe un diametro molto maggiore rispetto alle dimensioni

medie della cellula procariote che lo contiene. Per questo quest’unica molecola di

cromosoma è superavvolta in un gomitolo che, a prima vista, potrebbe sembrare casuale.

In realtà, la molecola di DNA cromosomale è avvolta in un modo molto preciso e il

superavvolgimento e il disavvolgimento sono processi altamente guidati dalla cellula per

permettere di svolgere quelle che sono le funzioni fondamentali della cellula (duplicazione,

trascrizione, traduzione del messaggio genetico). Sono coinvolti anche numerosi enzimi e

proteine specializzati deputati solo a questo ruolo. Se la cellula si sbaglia anche in una di

queste fasi, difficilmente riuscirà a sopravvivere.

Il fatto che la cellula contenga un solo cromosoma ha permesso di studiare molto più

facilmente tutti i processi di trasferimento dell’informazione genetica e, dal DNA, alla

sintesi proteica.

In più i batteri possono trasferire del materiale extra-cromosomale che è tipico della cellula

procariote che sono i plasmidi. Il plasmide è una molecola di DNA a doppio filamento in

forma C-C-C superavvolta extra-cromosomale. La differenza è, quindi, che è separata dal

DNA cromosomale. Può essere presente in alcune cellule batteriche così come possono

essere assenti. Ed è per questo che è definito anche come materiale genetico mobile cioè

è una molecola che la cellula può acquisire ma anche facilmente perdere. Ci sono ceppi

che lo possiedono che, se analizzati dopo del tempo, possono non essere perse. Questo

dipende dalle condizioni in cui la cellula si trova. Per tutti questi motivi il plasmide porta

informazione non vitali, bensì addizionali che possono aiutare la cellulare in determinate

condizioni. Se contenesse informazioni vitali, porterebbe la cellula ad un elevatissimo

rischio di non sopravvivere. Queste informazioni addizionali, a livello applicativo, possono

essere utili a noi perché per esempio esistono plasmidi che codificano per enzimi di nostro

interesse, esempio enzimi detossificanti, o enzimi per idrolizzare sostanze per noi nocive,

come idrocarburi, benzene, toluene, ecc … Studiamo i plasmidi anche perché possono

codificare per la resistenza agli antibiotici che, se dal loro punto di vista rappresenta un

vantaggio, per noi è un problema nel caso in cui vogliamo utilizzare quel ceppo il quale

potrebbe trasferire la resistenza dalla cellula batterica a cellule o da un ceppo all’altro che

colonizzano l’organismo umano, il che ovviamente non fa bene. Il problema è che ad oggi

si utilizzano troppi antibiotici per il loro uso indiscriminato a livello degli allevamenti come

terapia preventiva. Di conseguenza tutti i m.o. con cui l’animale viene a contatto

potrebbero diventare antibiotico-resistenti (suolo). In ambito alimentare non dobbiamo

utilizzare ceppi, quindi, che presentano questa caratteristica.

Ci sono casi in cui si ha l’integrazione del plasmide nel DNA cromosomale. I m.o. che

presentano questa caratteristica vengono detti EPISOMI. Nel caso in cui il plasmide sia

integrato nel DNA cromosomale esso si replicherà insieme al cromosoma. Nel caso in cui

il plasmide viva libero nel citoplasma potrà replicarsi in modo autonomo e, in base alle

necessità della cellula, potrà essere presente in più copie, grazie alle piccole dimensioni.

Quindi, anche se il plasmide è auto- replicante, questo processo è comunque regolato

dalla cellula, poiché saranno sempre necessarie delle proteine specifiche prodotte da dei

geni specifici presenti sul DNA cromosomale.

Per quanto la cellula procariota sia semplice, dobbiamo vedere questa semplicità come un

grande vantaggio che queste cellule hanno avuto di sapersi adattare molto più

rapidamente di quanto sappiano fare le eucarioti ai diversi ambienti in cui questi organismi

si trovano a vivere. Su questo si basa lo studio FILOGENETICO grazie al quale è stato

costruito l’albero filogenetico.

Diversi scienziati hanno, tanto tempo fa, classificato tutte le cellule viventi a partire da

quella che potrebbe essere una prima cellula primordiale che si potrebbe essere creata

casualmente considerata come progenitrice di tutti gli organismi compresi noi, ma che

hanno distanze evolutive differenti dalla stessa cellula primordiale. Dallo studio di

particolari caratteristiche di questa cellula (a partire da fossili contenenti DNA) e di quelle

costruito l’albero

attuali, sottolineandone le differenze per comparazione, è stato

filogenetico, le cui distanze dei vari ‘rami’ rappresentano anche le distanze evolutive.

Attraverso la definizione di questo albero sono state definiti i 3 domini della vita: batteri,

archea (o archeobatteri.

Cellule procariote ma che comprendono i batteri ritrovati più recentemente in habitat

particolarmente estremi: pH = ., nei ghiacciai, negli ambienti sulfurei, elevate

concentrazioni di NaCl, ecc … Questi hanno una cellula procariote ma anche delle

strutture e un pool di enzimi particolari per renderle resistenti a queste situazioni. Questi

batteri si sono così adattati a queste condizioni da aver acquisito stabilmente queste

caratteristiche. Tant’è che se prendiamo uno di questi m.o. e lo portiamo in laboratorio alle

condizioni standard, muore.) , eucaria (o eucarioti che contengono la cellula vegetale e

animale e i funghi). da ragione all’affermazione che la semplicità

Il fatto che due dei tre domini siano procarioti

è sinonimo di adattamento. Questo perché possiamo trovare molto più facilmente, negli

ambienti, una vita procariote che una vita eucariote.

A partire dalla cellula ancestrale si sono formate le tre diramazione principali, da cui, a sua

volta, si formano una serie di diramazioni secondarie che definiscono i vari tipi di batteri e

di eucarioti che sono conosciute fino ad arrivare agli organismi più complessi che siamo

noi e le piante. TEORIA EVOLUTIVA DELL’ ENDOSIMBIOSI

Queste teoria prende il nome di che

suppone che 4 miliardi di anni fa si fossero organizzate delle sostanze organiche a dare

una specie di cellula che definiamo progenitrice, una cellula semplice che, riproducendosi,

ha integrato altri componenti organici che poi si sono specializzate per permettere la

riproduzione delle stesse cellule. Inizialmente le cellule erano ad RNA e solo in un

secondo momento evolutivo abbiamo le cellule con DNA. Queste cellule ancestrali si sono

assemblate casualmente sono andate poi, trasportate da acqua, vento, ecc …, a

colonizzare diversi ambienti grazie alla capacità di adattamento della cellula.

Le cellule eucariote, secondo questa teoria dell’endosimbiosi, sono nate dopo che, in un

ambiente particolarmente difficile da colonizzare, due cellule abbiano ‘deciso’ di vivere

insieme in un rapporto di simbiosi in cui una cellula procariote sia entrata in un’altra

procariote per ‘dividersi’ i compiti. La prima, più piccola, si è poi specializzata nel produrre

energia differenziando i mitocondri. Ci sono delle evidenze scientifiche a sostegno di ciò,

come il fatto che i mitocondri abbiano un proprio DNA. Da questa prima cellula eucariota

poi, sotto la pressione selettiva esercitata da ambienti diversi, si sono specializzate cellule

eucariote diverse fino a quelle animale e vegetale, più complesse.

Questo ha anche permesso di riuscire ad avere un marker comune con il quale andare a

studiare queste distanza evolutive. Il marker che ha permesso la comparazione e

successiva creazione dell’albero filogenetico è una molecola che può rappresentare il

cosiddetto orologio molecolare, cioè una molecola che doveva essere presente

necessariamente dalla cellula progenitrice fino alle cellule attuali, nelle quali svolgesse la

stessa funzione e che la cellula, nel corso di questi miliardi di anni, ha cercato di

proteggere il più possibile dai cambiamenti di sequenza legati alle condizioni esterne,

dovuto al fatto che contiene informazioni essenziali alla vita della cellula.

Possono essere diversi gli orologi molecolare ma la molecola più comunemente usata si è

rivelata essere è il gene che codifica per RNA ribosomale 16s.

Questa ipotesi trova conferma nel fatto che la cellula ancestrale possiedono RNA (e non

DNA) e che i ribosomi delle cellule procariote hanno un loro cromosoma, appunto, 16s.

L’RNA ribosomale è uno degli RNA contenuti nella cellula, così chiamata perché, appunto,

contenuto nei ribosomi che sono delle strutture costituite da due sub unità, chiamate con

sigle differenti in funzione della densità di questi corpuscoli, nelle quali avviene la sintesi

proteiche. Nei batteri abbiamo la sub-unità 30S e 50S (Svedberg: il ricercatore che ha

messo appunto l’ultracentrifugazione utilizzata per calcolare le densità detto coefficiente di

sono attive se contengono al loro interno l’RNA

sedimentazione). Queste due sub-unità

ribosomale (rRNA) e una serie di polipeptidi la cui attività permette alle due sub-unità di

unirsi e di leggere il messaggio dell’RNA messaggero (mRNA). L’rRNA contenuto nella

sub-unità 30S viene definito RNA ribosomale 16s. Mentre quello nella sub-unità da 50S

viene chiamato 23s.

L’rRNA viene codificato a livello del DNA che conterrà un gene che codifica, appunto, per

l’rRNA. Questo è un gene altamente conservato che può essere utilizzato negli studi di

filogenesi.

La sequenza nucleotidica che codifica per questo rRNA ha, nel tempo, riportato

pochissime variazioni di sequenze anche tra cellule molto lontane tra loro, sviluppate in

condizioni totalmente diverse. Di conseguenza è possibile comparare cellule che hanno

grandi distanze evolutive anche ampie.

La cellula eucariota possiede ribosomi diversi, più grandi con sub-unità di densità

maggiore. Il ribosoma batterico si identifica con la sigla 70S che deriva dalla ‘somma’ delle

due sub-unità. Non è,però, una somma aritmetica: 30 + 50 non fa 70 matematicamente,

ma fa 70 ‘biologicamente’ per via del coefficiente di sedimentazione, per cui il ribosoma

non è dato dalla somma delle densità delle sub-unità.

E’ inoltre il gene che viene utilizzato in tante metodiche di laboratorio.

L’obiettivo dei batteri è quello di colonizzare l’ambiente in cui vive attraverso la crescita,

cioè si intende l’aumento del numero di cellule. L’aumento del numero di cellule porta ad

una comunicazione tra cellule aumentando il turn over interno per portare avanti la specie

attraverso le cellule figlie. La cellula, quindi, scambia con l’esterno tutto ciò che è

necessario a tal fine. che sono poi alla base dell’evoluzione.

La cellula può, inoltre, subire delle modificazioni

Queste modificazioni in parte derivano dall’ adattamento ambientale, in parte da eventi

subisce nell’ambiente, in parte ad errori in fase di

casuali come mutazioni che la cellula

riproduzione ma in parte sono dettati e voluti dalla cellula come i processi di

ricombinazione genetica per crescere meglio nelle condizioni in cui si trova. Nonostante

ciò le ricombinazioni avvengono con una frequenza bassissima in natura perché vengono

indotti solo in condizioni particolari in cui non può scegliere: o cerca di cambiare o

soccombe. La cellula sa di poter dirigere uno di questi processi, ma non sa l’esito della

sua ‘’scelta’’: può scegliere di acquisire del nuovo DNA ma non sa se sarà mortale o no.

Per questo non affronta questo rischio se non strettamente necessario. Questo vale

almeno per due dei tre processi: trasformazione e coniugazione. Mentre nel terzo

a metà, in seguito ad un’infezione fagica da cui la

processo, si tratta di una situazione

cellula è si malata, ma fa affidamento su un errore del fago per riuscire a sopravvivere

acquisendo altre caratteristiche.

Questi processi potrebbero somigliare a quella che nella cellula eucariota avviene nella

vera riproduzione sessuata delle cellule, differisce però dalla riproduzione vera è proprio

perché nei procarioti non avviene la fusione di due nuclei, ma uno scambio unidirezionale:

ci sarà sempre una cellula che dona e una che riceve. Non acquisisce, però, tutto il

genoma di un’altra cellula, anche se potrebbe; non lo fa perché per una cellula semplice

come quella procariote l’intero genoma porterebbe più danno che bene.

PROCESSI DI RICOMBINAZIONE GENETICA

TRASFORMAZIONE

Per definizione implica l’acquisizione da parte di una cellula ricevente di parte del DNA che

proviene da un’altra cellula ma che, in quel momento, si trova libero nell’ambiente

circostante.

Vi sono dei batteri che in particolari condizioni si vengono a trovare nel cosiddetto stato di

competenza: hanno ricevuto dei segnali chimici per cui attivano una serie di geni

predisposti a sintetizzare delle molecole che servono per questo processo di trasferimento

genico dall’esterno verso l’interno. Questo stato di competenza è quindi indotto dalle

condizioni ambientali e guidato da una serie di proteine che vengono sintetizzate per

questa specifica necessità. Il processo prevede che la superficie cellulare venga a contatto

con DNA esterno che provenga, per esempio, da un habitat naturale colonizzato da

diverse tipologie di batteri o da cellule di batteri morti che si sono lisate rilasciando frazioni

di DNA libero che raggiunge la superficie delle cellule in stato di competenza, sulla quale

viene legato da proteine specifiche che riconoscono le molecole di DNA, per un passaggio

selettivo.

In molti casi le cellule non fanno entrare DNA a doppio filamento, per cui posseggono delle

filamento in modo da portare all’interno della cellula un solo

nucleasi che scinde il doppio

filamento che sarà più facilmente integrabile nel cromosoma batterico.

Ci sono poi delle specifiche proteine che vanno a legarsi a questo singolo filamento di

in modo tale da stabilizzarlo per impedirne l’avvolgimento (qualora dovesse essere

DNA

abbastanza lungo) che creerebbe la formazione di legami intramolecolari tra le basi

nucleotidiche.

Dopo di che intervengono altre proteine enzimatiche specifiche per questo processo,

che cerca se lungo il DNA cromosomale esiste un sito all’interno del quale

come la recA,

quel filamento esterno di DNA può integrarsi. In caso affermativo, il frammento di DNA

esterno si legherà al cromosoma sostituendo una frazione di DNA esistente.

Questo implica che, nei successivi stadi della replicazione, sul DNA cromosomale è

portato un filamento del DNA nuovo che apporterà delle modificazioni rispetto

all’informazione originaria della cellula madre che dipenderanno dalle informazioni portate

da quel singolo filamento di cui la cellula non conosce l’utilità o la dannosità o addirittura la

morte. Se del DNA si inserisce in un punto non corretto potrebbe bloccare l’azione di geni

vicini che potrebbero portare all’inattivazione della crescita e riproduzione cellulare. Da qui

il rischio della trasformazione. Se apporterà un danno la cellula soccombe. Se apporterà

un vantaggio, le cellule figlie avranno acquisito delle informazioni e caratteristiche

addizionali che prima non esistevano che, se fortunata, le permetteranno di vivere meglio

nell’ambiente in cui si trova e, se riuscirà, conserverà tale informazione e la trasferirà alle

cellule figlie.

Se, invece, questo filamento singolo non trova alcun sito lungo il DNA cromosomale, la

energia per portarla di nuovo all’esterno. Bensì attiverà delle altre

cellula non sprecherà

nucleasi specifiche che andranno a idrolizzare quel filamento di DNA esterno rendendo

disponibili le basi nucleotidiche che utilizzerà in fase di replicazione in una successiva

sintesi. CONIUGAZIONE

Prevedono un contatto tra le cellule donatrice e ricevente.

Quello più conosciuto è la coniugazione che avviene attraverso un pilo a carico del

plasmide F che alcuni Gram negativi posseggono.

all’interno delle cellule che posseggono il pilo

Il plasmide F è un plasmide contenuto

contenente le informazioni per la sintesi del pilo stesso.

Questo plasmide è abbastanza piccolo che porta le informazioni per la propria replicazione

e per la sintesi del pilo e, solitamente, si trova come molecola extra-cromosomale, cioè

staccato dal DNA cromosomale.

Quando avviene il contatto, che riduce la distanza tra i due m.o., di una cellula F+

(donatrice) con una cellula detta F- (ricevente perché priva del plasmide F), il plasmide

di srotolamento, detto ‘’rolling

migra dalla cellula F+ alla cellula F- attraverso un processo

circle’’ dalla sua forma rilassata circolare del plasmide con la rottura di un singolo

filamento il quale passa attraverso il pilo F il quale forma il ponte coniugativo, inserendosi

nella cellula ricevente. Questo avviene perché la cellula F+ non vuole perdere l’intero