Biotecnologie microbiche - Appunti

TATTTGA.

Ed infine una sequenza detta -35 = TTGACA, TTGATT.

Nel caso di studio la regione -35 si trova a 123: TTGATTA. La regione -10 si trova a 146:

TTATTTT. L’RDS è poco prima dell’ATG iniziale ed è una GAAAGG.

Sono separate da un frammento non specifico di 17-19bp.

L’analisi di queste sequenze ci permettono di dire se è un promotore forte o debole.

Banche dati:

CODONE LAC

La regolazione è molto complessa, anche perché esistono tantissimi tipi di regolazione.

Regolare la quantità di trascritto coinvolge il sito promotore: la trascrizione sarà quindi più

o meno veloce a seconda delle necessità della cellula. La cellula ha sviluppato un sistema

complesso di regolazione genica, che può essere diverso per i diversi geni ed operoni e

permette di modulare principalmente il livello di trascrizione. Poi ci sono alcuni casi in cui

la regolazione può avvenire anche a livello della traduzione.

Il primo operone ad essere scoperto, e quello più studiato, è l’ operone lac di E. coli:

esso contine 3 geni che codificano per gli enzimi che consentono alla cellula di utilizzare il

β-galattosidasi

lattosio: una lattosio permeasi, una e una galattoside transacetilasi.

I 3 geni sono raggruppati nell’ordine:

(β-galattosidasi):

- lacZ proteina di membrana che lega il lattosio e lo porti in modo

selettivo all’interno;

- lacY (lattosio permeasi)

- lacA (galattoside transacetilasi): serve per far entrare il galattosio nella via

glicolitica.

e vengono trascritti contemporaneamente per produrre un unico mRNA (chiamato

policistronico-cistrone è un sinonimo di gene), a partire da un unico promotore che si trova

a monte del primo gene dell’operone.

[i geni vengono identificati con tre lettere in corsivo seguite da un codice (che in questo

caso è una lettera che varia da m.o. a m.o.. Lo stesso enzima in un altro batterio può

avere codice diverso. Ciò che importa sono le tre lettere corsive]

Se questo operone è cosiddetto costitutivo (la cellula lo mantiene sempre attivo perché

necessita sempre dei prodotti di quell’operone) la modulazione della trascrizione dipende

da dove è posto il sito promotore e da quali sequenze sono presenti nei box -10 e -35. La

cellula deciderà nel corso della propria vita

se farne un promotore forte o uno debole.

Per molti m.o. il lattosio rappresenta una

fonte addizionale di carbonio che la cellula

utilizzerà solo quando verranno a mancare

fonti più prontamente utilizzabili come il

glucosio. Saranno gli enzimi deputati per

l’utilizzo del glucosio quelli costitutivi. Mentre

quelli per il lattosio sono detti inducibili.

operoni, l’operone lac è soggetto a due tipi di controllo.

Come molti altri che mantiene spento l’operone in assenza di lattosio.

Il primo è un controllo negativo, Questo avviene ad opera di un repressore

specifico, il repressore lac in questo caso,

prodotto da un gene regolatore lacI, che si lega

in un sito specifico, noto come sito operatore,

che sta appena a valle del sito promotore,

impedendo il giusto legame tra sito promotore

ed RNA polimerasi, inibendo così la

trascrizione.

l’operone in uno stato relativamente inattivo, con

In realtà le cellule riescono a mantenere

la produzione di poche molecole di enzimi per il lattosio. Il repressore è una proteina

allosterica: in presenza di un giusto induttore che si lega ad esso si determina una

conversione della struttura e il passaggio a una conformazione che ne favorisce la

dissociazione dall’operatore, inducendo così l’operone. In questo caso la presenza di

dell’operone. Il livello basale di enzimi per il lattosio fa

lattosio consente la de-repressione

si ch questa fonte di carbonio possa essere in parte metabolizzata ad allo-lattosio (legame

β 1-6 anziché β 1-4) che rappresenta l’induttore in grado di legarsi al repressore e

deprimere l’operone lac. stacca il repressore dall’operatore grazie ad un discorso di

Il lattosio, in altre parole,

I repressori hanno due siti che possono legare: quando non c’è il lattosio,

legami di affinità. Quando c’è il lattosio,

il repressore che viene prodotto trova affinità per il sito operatore.

c’è un riconoscimento tra il lattosio e la proteina repressore per cui c’è un’affinità

maggiore; la proteina cambia conformazione per far attaccare più saldamente il lattosio.

dell’operone. Le

Nel caso della crescita diauxica si osserva un tipo di controllo positivo

cellule inattivano i geni per il lattosio fino a quando è presente il glucosio: è necessaria la

presenza di una molecola in gradi di ‘sentire’ la mancanza di glucosio e di rispondere

positivo). Tale molecola è l’

attivando il promotore lac (controllo AMP ciclico, la cui

dei livelli di glucosio. Per ottenere l’attivazione

concentrazione aumenta al diminuire

dell’operone è però necessaria la presenza anche si un’altra proteina, chiamata proteina

attivatrice del catabolita o CAP (detta anche proteina recettrice di AM ciclico o CRP). Il

(sito di legame per l’attivatore) si trova subito a

sito di legame per il complesso CAP-cAMP

monte del promotore ed è stato dimostrato che il legame del complesso a tale sito stimola

legame dell’RNA polimerasi al sito promotore e quindi la trascrizione.

il

Tale processo è anche noto come repressione da catabolita in quanto è stata per lungo

tempo attribuita all’influenza di un qualche prodotto derivante dalla metabolizzazione del

glucosio, o catabolita.

In altre parole, c’è il sito operatore e il sito promotore. A monte del sito promotore c’è un

sito attivatore a cui si lega in modo specifico un complesso formato da CAP e AMP ciclico.

con il

Laddove il livello di cAMP è alto, si ha il legame dell’cAMP CAP per dare un

complesso che ha affinità con il sito attivatore.

Questo evento si verifica nella crescita di

E.coli il quale, quando trasforma il glucosio

blocca il gene per il lattosio, mentre se c’è

solo lattosio attiva i geni per questo

zucchero. Può però capitare di avere

contemporaneamente sia glucosio che

lattosio. In questo caso il comportamento è

diauxico: in un terreno contenente sia

glucosio che lattosio le cellule utilizzeranno

subito il glucosio, per il quale sono già

disponibili nel pool citoplasmatico gli enzimi

(costitutivi), e solo quando il glucosio sarà

esaurito, attiverà l’operone lac per produrre

gli enzimi necessari alla metabolizzazione

del lattosio (inducibili).

Graficamente abbiamo una specie di doppia curva di crescita: si ha una prima fase

esponenziale che termina in quella che sembra una fase stazionaria, ma in realtà è una

seconda fase di latenza, breve, che poi riparte in una seconda fase esponenziale in cui si

ha un nuovo aumento di cellule seguita, ancora una volta, dalla vera fase stazionaria.

gli enzimi deputati all’utilizzo

La seconda fase di latenza serve al m.o. per sintetizzare

della seconda fonte di carbonio addizionale. Quando questa seconda fonte di carbonio è

una fonte inducibile, come nel caso del lattosio, richiederà degli enzimi inducibili e

il glucosio, la cellula riceva i segnali dall’esterno e

richiederà del tempo affinché, terminato

decida di attivare il complesso per trascrivere e esprimere i geni.

Quando c’è il glucosio all’inizio i livelli di cAMP, che è uno dei cataboliti legati alla

utilizzazione del glucosio, è relativamente basso perché il glucosio inizia a d essere

utilizzato. Essendo basso non può formare il complesso cAMP-CAP e, di conseguenza, il

promotore non viene attivato e si ha una trascrizione molto bassa del lattosio. In altre

parole, il lattosio aveva staccato il repressore dal sito ma, non formandosi il legame

attivatore, ed essendo il promotore debole, la cellula utilizza al minimo il lattosio. Nel

momento in cui il glucosio inizia a terminare, allora cAMP può legarsi alla proteina K, il

complesso va a legarsi al sito vicini al sito promotore e tutto questo è come se spingesse

per un riarrangiamento delle sub unità del RNA polimerasi inducendola a trascrivere a

velocità maggiore.

Se tutto viene trascritto così come la cellula ‘vuole’, quello che si dovrebbe ottenere da

quel gene è un prodotto cioè una proteina che ha una certa sequenza amminoacidica,che

è quella di cui necessita.

Variabilità genetica

A volte, però, soprattutto in fase di replicazione ma anche per eventi di mutazione casuali,

possiamo avere un cambio nella sequenza nucleotidica che può andarsi a ripercuotere

sulla sequenza amminoacidica e quindi sulla proteina. Infatti, una caratteristica dei geni è

che essi accumulano cambiamenti o mutazioni.

Una mutazione è un cambio casuale ma stabile ed ereditabile. Possono essere: letali,

negative, positive. Ci sono mutazioni da transizione,

quando una purina si scambia con

un’altra purina, o una pirimidina con

un’altra pirimidina; oppure mutazioni da

transversione: quando a scambiarsi

sono una purina e una pirimidina; o

ancora, una delezione o inserzione di

una base: viene aggiunta o eliminata,

rispettivamente, durante la sintesi del

filamento complementare, una base.

Infatti, l’espressione di una mutazione sarà rilevata

Non sempre però, ce ne accorgiamo.

solo se produce un fenotipo alterato che può essere riconosciuto. Questo perché, nella

maggior parte dei casi, le mutazioni che possono verificarsi, sono le cosiddette mutazioni

che fanno cambiare soltanto una base dell’intera sequenza nucleotidica,

puntiformi

variazione che, in alcuni casi, non vediamo neanche o al massimo sono poco importanti,

in altri casi, possono portare a conseguenze molto differenti.

Nel fare l’allineamento utilizzando i software, questo ci darà l’allineamento migliore cioè

quello che, secondo il pc, è l’allineamento migliore in funzione della massima omologia

che riesce a trovare. Anche se trova la massima omologia, non sempre i dati sono

attendibili: dovremmo riuscire a capire che, anche se c’è un ottimo allineamento, ma se

manca anche solo una base, le conseguenze possono essere importanti a livello del

prodotto perché shifta (slitta) tutto il codice di lettura. Per questo i software sono da

utilizzare più di una volta, con diverse ‘letture’.

Analisi delle mutazioni puntiformi

Quando si inserisce, per caso, una ba