Biotecnologie genetico-molecolari

Biotecnologie microbiche mod.1 – genetico molecolari

Le metodologie genetico molecolari in ambito alimentare e microbiologico sono indispensabili per una risposta rapida e sicura: gli alimenti veicolano microorganismi indesiderati o patogeni motivo per cui il laboratorio controllo qualità deve disporre di metodi rapidi per dare una risposta in linea con i tempi di produzione e distribuzione. Lo sviluppo di nuovi processi di produzione in cui sono coinvolti specifici starters deriva dallo studio di nuove colture e delle loro potenzialità. Questo consente l’innovazione di processo e di prodotto.

Cellula procariota

Lo studio a livello genetico e biochimico è partito dall’uso di cellule procarioti, le più semplici, iniziando con Escherichia coli e successivamente con il gram + Bacillus subtilis. La cellula procariote non possiede organelli specializzati, e le funzioni sono svolte a livello della membrana cellulare (quindi non funge solo da veicolante di materiali dall’interno all’esterno e viceversa), funge per esempio da centro della respirazione. La differenza più importante con la cellula procariote è che hanno genomi diversi.

Il genoma è costituito da un’unica molecola di DNA a doppio filamento, circolare, con più di un milione di basi nucleotidiche in sequenza, contenute in un unico cromosoma batterico, e prende il nome di DNA cromosomale. Distesa in tutta la sua lunghezza la molecola raggiunge la dimensione di 1 mm quindi, per entrare nel cromosoma, deve avere configurazione super aggomitolata, con avvolgimento e riavvolgimento guidato da un certo numero di proteine che sono deputate esclusivamente a questa funzione. La cellula procariote è quindi aploide (N) e non diploide (NN).

Il DNA extracromosomale è portato da plasmidi. I plasmidi sono molecole di DNA, sempre circolari e super avvolte, ma con dimensioni molto minori del DNA cromosomale, che possono replicarsi autonomamente, indipendentemente dalle informazioni del DNA della cellula che li ospita, e permanere nella cellula batterica per numerose generazioni. Alcuni batteri ne possiedono più copie, altri non ne possiedono. In parole brevi, sono frammenti di DNA cromosomale indipendenti:

• Le informazioni che veicolano non sono essenziali per la sopravvivenza della cellula
• Alcuni plasmidi possono integrarsi nel cromosoma. In tal caso prendono il nome di episomi e, in queste condizioni, non si replicano più in modo autonomo ma in sincronia con il cromosoma stesso
• Un episoma può separarsi dal cromosoma e tornare a replicarsi autonomamente sotto forma di plasmide.

Solitamente questi plasmidi codificano per fattori di virulenza batterica perché portano l’informazione per la produzione di pili, organi di adesione alla cellula, che possono provenire da patogeni, ma codificano anche per la produzione di batteriocine, adesine e fattori antibiotico resistenti (fattori R). I principali responsabili di questa trasmissione di antibiotico resistenza sono proprio i plasmidi. Si dividono in plasmidi F (coniugativi o sessuali) oppure plasmidi criptici, a funzione non nota.

Sono definiti elementi genetici mobili poiché attraverso diversi meccanismi la cellula può acquisire un plasmide che non possedeva o separarsi con espulsione di un plasmide non utile ad essa. Possono facilitare la vita della cellula solo in particolari condizioni: se si presenta antibiotico resistenza un microorganismo può facilitare la vita di una cellula e la colonizzazione di un organismo, con conseguenze negative nell’organismo ospite. La semplicità le ha rese più velocemente adattabili a habitat diversi rispetto alla cellula eucariote. Due dei tre domini sono relativi a cellule batteriche (Bacteria, Archea, Eucarya). Gli Archea sono batteri detti estremofili, in quanto in grado di crescere in ambienti fortemente ostili alle cellule attuali, e questa forte resistenza è data dalla semplicità.

Teoria dell’endosimbiosi

Attraverso la fusione di due cellule procariote che condividevano uno stesso habitat non più idoneo alla loro crescita, una cellula è entrata nell’altra combinandosi al fine di sopravvivere. Quella più piccola adsorbita si è specializzata nella respirazione (mitocondri o cloroplasti) mentre l’altra funge da guscio esterno. Questa teoria dell’evoluzione è stata poi confermata da evidenze scientifiche in quanto mitocondri e cloroplasti mostrano DNA proprio correlabile a quello batterico, con conferma della teoria e studio dell’evoluzione e la costruzione dell’albero filogenetico tramite confronto di frammenti di sequenze presenti in tutti i microorganismi finora conosciuti a partire dal progenitore ancestrale.

Ciò è stato possibile in quanto sono stati estratti i materiali genetici dai fossili e individuati i cosiddetti orologi molecolari, molecole e macromolecole informazionali presenti in tutti i microorganismi che consentono di verificare l’andamento evolutivo di quella specie e correlarle alla distanza temporale evolutiva. L’orologio ribosomiale scelto è l’RNA ribosomiale, o tRNA 16S presente nei ribosomi batterici, in primis perché tutte le molecole contengono RNA e in secondo luogo perché mitocondri e cloroplasti hanno mostrato ribosomi uguali ai batterici. È indicato come RNA 16S o 16 Svepper dallo studioso che per ultracentrifugazione ha misurato la densità dei diversi ribosomi, infatti i ribosomi si compongono di 2 subunità con densità diversa, la cui più piccola possiede il 16S. Il gene che codifica per questa molecola è uno dei più usati per biologica molecolare, con sequenza nucleotidica minimamente variata e comparabile tra specie batteriche diverse. La cellula batterica non solo scambia energia e materia con l’ambiente per vivere e riprodursi, ma anche per evolversi (volente o nolente) al fine di salvaguardare la specie.

Processi di evoluzione batterica

I primi processi di evoluzione batterica sono detti di ricombinazione genica compiuti dalla cellula con frequenza molto bassa, solo quando in difficoltà, in quanto gli esiti di questi processi non sono noti alla cellula che li vuole compiere, con il rischio di mutazioni in forme più deboli o non adatte. Questi processi devono essere:

• Unidirezionali, una cellula dona e l’altra riceve
• Parziali, la cellula batterica è semplice, non acquisisce porzioni molto grandi di DNA di altre cellule
• Occasionali, sostituiscono la riproduzione sessuale con crossingover (variabilità) degli eucarioti.

Gli unici che non danno variabilità sono:

• Trasformazione: acquisizione di un DNA libero esterno senza contatto tra cellule
• Coniugazione: trasferimento di DNA con contatto
• Trasduzione: trasferimento di DNA con un fago che funge da mediatore/vettore

Trasformazione

Soltanto i batteri naturalmente trasformabili, aventi nel genoma geni specifici deputati a raggiungere uno stato di competenza, possono assorbire dall’esterno materiale genetico libero che si trova nell’ambiente e quindi trasformarsi. Tale processo è indotto da condizioni ambientali non più favorevoli per la vita della cellula e quindi la cellula decide di cambiare se nell’ambiente circostante sono presenti queste frazioni di DNA di altre cellule lisate.

1. Quando la cellula si trova in questo stato di competenza, la cellula attiva geni che codificano per prodotti (proteine e enzimi) debiti a questo processo. Il primo stadio è quello di adsorbire le porzioni di DNA libero presente nella cellula, mediante proteine che legano a livello della parete cellulare.
2. Entrano poi in gioco nucleasi, in quanto la cellula preferisce inserire DNA ad un filamento, quindi le nucleasi rompono il doppio filamento.
3. Attraverso proteine specifiche di trasporto il DNA ad un filamento entra e viene riconosciuto da altre proteine, che si attaccano ad esso impedendone il riavvolgimento.
4. Interviene la proteina REC-A che riconosce a livello del DNA cromosomale dei siti (di sequenze) omologhi a quelli presenti nel DNA esogeno, in modo da permettere l’incorporazione di queste in un sito invece di una frazione di DNA cromosomale. Se i siti non sono presenti non si lega e il DNA esogeno viene distrutto e riutilizzato per il turnover cellulare.
5. Questa porzione integrata potrà o meno contribuire a dare variabilità alla cellula a seconda di come viene incorporata, in quanto questi processi di combinazione non hanno esiti assicurati positivi o negativi, possono anche non portare a nulla.

Anche i plasmidi possono essere inglobati. È un evento raro in natura, ma utilizzato in laboratorio per fini ingegneristici, con obbiettivo il trasferimento di informazioni utili nella cellula ospite, poiché non necessitano di regioni omologhe per integrarsi nel DNA cromosomale della cellula ospite, in quanto entità autoreplicanti quindi rimangono liberi ed autonomi.

Coniugazione

Più conosciuta nell’ambito dei gram- perché possiedono il plasmide coniugativo F/sessuale che codifica per l’informazione di produzione di pili (F/coniugativo) mediante il quale si riesce ad avere un contatto tra cellula ricevente e cellula donatrice. La cellula che possiede il pilo F viene definita F+, quella che riceve il contatto F-.

Quando si crea contatto inizia la coniugazione. Il pilo F è una struttura cava che permette di far passare un filamento del plasmide F al suo interno, ovvero rompe i legami di un filamento, consentendo lo srotolamento e permettendone il passaggio fino alla cellula ricevente (rolling circle). Il tempo di contatto non è molto ma consente comunque il passaggio del filamento da una cellula F+ a F- (che nel frattempo è diventata F+) con ricostruzione, a termine, del plasmide con doppio filamento. Non dà luogo ad una grande variabilità genetica il solo passaggio, ma ciò che dà variabilità è l’evento che fa si che il plasmide F si inserisca nel DNA cromosomale sotto forma di episoma (sito di riconoscimento).

Queste cellule aventi l’episoma al loro interno sono definite come HFR (ad alta frequenza di ricombinazione) perché quando avviene il contatto tra la cellula F+ e la cellula F- e si forma il ponte coniugativo, il plasmide F induce la rottura di un filamento e lo srotolamento, a partire da un punto specifico del plasmide (oriT).

In questo caso la cellula acquisirà una porzione del plasmide F e una del cromosoma: la cellula diviene dunque Hfr+ ma F- perché il contatto tra le cellule è un processo breve e non riesce a passare tutto il DNA della cellula donatrice. Se riesce ad acquisire tutto il plasmide la cellula diviene F+ Hfr+. Ciò dipende dal plasmide, dalle condizioni esterne, dal tempo di contatto.

Anche i gram+ possono compiere la coniugazione, ma con contatto diretto tra 2 cellule e non con intermediario il pilo F. La cellula ricevente in questo caso, quando percepisce la presenza nell’ambiente di un donatore, rilascia feromoni che vanno a indurre nella cellula donatrice la creazione di sostanze aggreganti che consentiranno successivamente il contatto, con formazione di un canale tra le membrane/pareti tra queste e il trasferimento di plasmidi (plasmidi coniugativi dei gram+, difficilmente episomi). Si parla di trasferimento genico orizzontale.

Trasduzione

Trasferimento di frammenti di DNA cromosomale trasmessi mediante fago (o batteriofago) trasducente che rimane esterno alla cellula, riconoscendo solo la possibile ricevente con alta specificità (solo se la cellula ospite ha i meccanismi di replicazione necessari al fago per riprodursi). A partire dal capside (testa) viene rilasciato il genoma fino alla coda, che tramite pori rilascia il prodotto nell’ospite. Il fago è detto aberrante, in quanto durante uno dei due cicli compie un errore. Il fago si adsorbe sulla superficie della cellula bersaglio, inietta il proprio genoma e induce la cellula a utilizzare tutti i sistemi per il fago e non per sé stessa.

Durante questa fase di infezione, con tante copie del genoma fagico, si formano particelle fagiche all’interno. Intanto il DNA cromosomale si disgrega. Durante l’assemblaggio delle varie parti del fago, all’interno del capside, può capitare che si inserisca un frammento del DNA cromosomale. La particella così sbagliata può ancora andare a infettare un’altra cellula batterica, perché le informazioni contenute nella coda sono ancora corrette, è mutato solo il capo. Quindi quello che viene iniettato non è più un genoma virale che dà luogo a ciclo litico, ma il frammento di DNA, che se trova siti di inserimento si inserisce nel cromosoma della nuova cellula, acquisendo nuove informazioni. Se questo frammento non trova compatibilità verrà degradato, mentre la cellula rimarrà attiva perché il fago aberrante non intaccherà nel DNA cromosomale.

Ciò può avvenire con due modalità:

• Ciclo litico: il fago si riproduce immediatamente, uccidendo la cellula ospite che va incontro a lisi, liberando la progenie fagica. Il ciclo litico rappresenta la via più facile di replicazione del virus: si infetta la cellula ospite iniettando il proprio materiale genetico e si trascrivono e traducono le informazioni virali. In generale, nelle sequenze codificate dal virus vi sono proteine in grado di escludere la traduzione del genoma cellulare in favore del genoma virale, così il virus prende il sopravvento sull’ospite.
• Ciclo lisogeno: il fago (definito in questo caso temperato) integra il proprio acido nucleico nel genoma della cellula ospite (profago), che può rimanere silente per molto tempo finché verrà attivato e, abbandonato il cromosoma batterico, innescherà il ciclo litico. Quando un fago temperato instaura una fase di lisogenia, integra il proprio cromosoma virale in quello batterico in un sito specifico del DNA cromosomale della cellula. Quando un evento esterno causa l’escissione del genoma virale, può capitare che questa escissione non avvenga correttamente e che rimanga parzialmente legato ad uno dei due estremi del genoma virale, un po' del DNA cromosomale, che comporta comunque l’inizio del ciclo litico e particelle virali che contengono entrambi i genomi, con capacità infettiva. Se compiono il ciclo lisogenico, questi fagi aberranti inseriscono il loro genoma virale nel DNA cromosomale. La cellula riconosce il virale e blocca la sua espressione per tutta la durata del ciclo lisogenico, ma quella frazione del DNA cromosomale che si è portata dietro il fago non viene riconosciuto come DNA fagico, quindi quel frammento esogeno può esplicarsi e contribuire a dare variabilità alla cellula che lo ha incorporato.

Ciclo vitale della cellula

Le funzioni vitali della cellula sono:

• Adattarsi e sopravvivere in un dato habitat, e questo comporta esprimere quelle specifiche caratteristiche fenotipiche che consentono alla cellula di utilizzare un dato substrato, o adattarsi ad un cambiamento ambientale.
• Riprodursi, affinché la propria progenie sia in grado di colonizzare un dato habitat: e questo comporta la costituzione di nuove cellule figlie dotate dello stesso patrimonio genetico della cellula madre.
• Evolversi, là dove le condizioni ambientali sono tali da ridurre drasticamente le possibilità di sopravvivenza: e questo comporta in particolari condizioni, la capacità di compiere dei processi di ricombinazione genetica, allo scopo di acquisire qualche caratteristica fenotipica utile (ricordiamo che i batteri non sono in grado di compiere una riproduzione sessuale).

Tutto questo comporta lo svolgimento di tre fondamentali processi: la replicazione del DNA, la sua trascrizione in RNA messaggero e la successiva traduzione in fenotipo, a livello dei ribosomi cellulari, con il coinvolgimento dell’RNA ribosomale (contenuto nei ribosomi) e dell’RNA transfer. Questi tre processi sono il dogma centrale della vita, su cui si basano anche studi come la PCR.

Struttura del DNA (acido desossiribonucleico)

Il DNA nella sua forma nativa è composto da due filamenti avvolti a doppia elica: in ciascun filamento un gruppo fosfato lega la posizione 5’ di una molecola di zucchero pentoso alla posizione 3’ della molecola successiva. Ad ogni molecola di zucchero è poi legata una diversa base azotata. Il DNA possiede 4 basi azotate diverse, 2 pirimidine, la timina T e la citosina C e 2 purine, la guanina G e la adenina A. Poiché le purine sono più grandi delle pirimidine, in una doppia elica regolare, la presenza di una pirimidina in un filamento è sempre accoppiata alla presenza di una purina nell’altro. Inoltre, la regolarità della struttura a doppia elica richiede la formazione di specifici legami idrogeno fra le basi, in modo tale che esse possano incastrarsi correttamente, perciò una A si contrappone sempre ad una T (con 2 legami idrogeno) ed una G sempre ad una C (con 3 legami idrogeno). Ci si riferisce a questi accoppiamenti fra basi con il termine complementari.

I due filamenti inoltre sono orientati in direzione opposta, uno 5’ 3’, l’altro 3’ 5’. Dal momento che i due filamenti sono complementari, l’informazione contenuta in un filamento può essere dedotta dal filamento complementare, quindi per convenzione una sequenza di DNA a doppio filamento si rappresenta solo scrivendo la sequenza di uno dei due filamenti in direzione 5’ 3’. La struttura del DNA possiede una carica netta negativa per via dei gruppi fosfato, causando una repulsione elettrostatica che tende a far allontanare i due filamenti: la stabilità della molecola è conferita proprio dai legami idrogeno tra le basi complementari dei due filamenti a da interazioni idrofobiche tra le basi stesse. La sintesi del DNA avviene mediante allungamento dalla estremità 3’-OH con la formazione di un legame fosfodiesterico tra il 3’-OH e un nuovo dNTP (desossiribonucleotide trifosfato = base nucleica = zucchero-fosfato-base azotata). Il DNA a doppio filamento nel suo stato rilassato è presente come doppia elica destrorsa con 10 coppie di basi per giro dell’elica.