Biotecnologie genetico-molecolari

OPERONE RIBOSOMIALE

Un altro operone, di importanza vitale per le cellule è l'operone ribosomiale. Esso è caratterizzato dalla presenza dei geni strutturali necessari per la sintesi dell'rRNA 16S, 23S e 5S, indispensabili per la formazione dei ribosomi attivi. I geni 16S r-DNA ed i geni 23S r-DNA sono considerati, in termini evolutivi, i più significativi orologi molecolari: essi sono presenti in tutte le cellule, dove svolgono la stessa funzione ed hanno una sequenza nucleotidica che si è conservata nel tempo.

Importante per le metodologie genetiche è la presenza tra il gene 16S rDNA ed il gene 23S rDNA di una regione nucleotidica che può presentare maggiori variazioni di sequenza e di lunghezza rispetto ai geni strutturali. Tale regione è nota come Regione Spaziatrice (RS).

I vari microrganismi possono possedere lungo il genoma più di un operone ribosomiale (da 1 a 11 copie): la presenza di molteplici copie di questo operone

è stato correlato alla necessità cellulare di disporre di più ribosomi attivi (ad esempio cellule con metabolismo energetico respiratorio), per una attiva sintesi proteica. È stato osservato che anche all'interno di uno specifico genoma, le varie copie dell'operone ribosomiale possono variare leggermente in sequenza e soprattutto per la RS, in lunghezza. In funzione del tipo di microrganismo gli operoni possono presentare una maggiore complessità rispetto a quelli presi come esempio, sia per quanto riguarda il tipo di regolazione che il numero di geni strutturali in essi contenuti; al riguardo è possibile osservare in operoni complessi come la cellula possa aver riunito anche geni strutturali che possono in situazioni metaboliche differenti essere accesi singolarmente anche per altre vie metaboliche. In tal caso c'è da aspettarsi che all'interno dell'operone e a monte del gene in questione sia presente un promotore.solitamente più debole del promotore dell'operone, che consente la regolazione e l'espressione del singolo gene. Le proteine che legano il DNA durante la regolazione genica (di natura enzimatica quale la DNA-polimerasi e la RNA-polimerasi, ma anche le proteine regolatrici) sono proteine in grado di riconoscere particolari sequenze nucleotidiche lungo il DNA e di interagire con esse attraverso la formazione di legami idrogeno tra le basi nucleotidiche e i gruppi R degli amminoacidi presenti nella struttura di riconoscimento della proteina. Nelle proteine, la configurazione elica-giro-elica (helix-turn-helix o HTH) è il motivo strutturale principale in grado di legare il DNA. È composta da due α-eliche unite da una piccola sequenza di amminoacidi e si trova in molte proteine che regolano l'espressione genica: Motivo HTH = helix-turn-helix LA VARIABILITÀ GENETICA Una caratteristica dei geni è che essi accumulano cambiamenti dovuti non

Solo a ricombinazioni, ma anche a errori durante la replicazione, mutazioni e al processo di trasposizione. Questa potrebbe essere l'unica variazione su centinaia di amminoacidi che costituiscono quella proteina, e tale variazione potrebbe essere irrilevante per l'attività della proteina, ma anche scatenare effetti importanti. Il DNA può cambiare generalmente con 3 modalità:

1. Errori durante la replicazione
2. Mutazioni
3. Trasposizione

ERRORI DURANTE LA REPLICAZIONE

Il processo della replicazione è molto veloce. È stato calcolato che la forca di replicazione in E. coli, ad esempio, si muove alla velocità di 1000 nucleotidi/secondo e questo può causare errori da parte della DNA polimerasi. Come tutte le polimerasi, anche la DNA polimerasi possiede oltre che attività polimerasica anche attività esonucleasica in grado di rimuovere nucleotidi non corretti non appena vengono incorporati permettendo la correzione delle bozze (proofreading).

Attività esonucleasica della polimerasi). Nonostante ciò, durante la replicazione si possono verificare errori che possono provocare un cambiamento nella sequenza nucleotidica.

MUTAZIONI

Vengono considerate come un cambio casuale, dovuto a geni mutageni, ma stabile ed ereditabile dalle cellule figlie. Possono essere:

• Letali
• Negative
• Positive

E sono divise come:

• Mutazioni da transizione: quando lo scambio è purina/purina oppure pirimidina/pirimidina
• Mutazioni da transversione: purina/pirimidina
• Puntiformi: sono quelle più frequenti e danno luogo a delezione o inserzione di una base, frame shift. Può avere effetti notevoli perché si cambia lo schema di lettura delle triplette completamente.

L'espressione di una mutazione sarà rilevata solo se produce un fenotipo alterato riconoscibile. Se il codone codifica comunque per la proteina, con mutazione sull'ultima base, la mutazione è detta silente.

Se la mutazione crea un segnale di stop è detta non senso (in quanto sarà presente una proteina incompleta). Se la mutazione è a carico della prima base, la mutazione è detta missenso, in quanto si crea una proteina difettata. In ultimo se viene modificata con la propria tripletta complementare, si avrà comunque la stessa proteina codificata.

TRASPOSIZIONE
I trasposoni sono segmenti mobili di DNA, con lunghezza compresa tra i 750 e 40k paia di basi. Nei batteri ne sono stati trovati due tipi:
1. Semplici, chiamati anche sequenze di inserimento o di inserzione, e contengono sequenze di DNA capaci di spostarsi autonomamente da un punto all'altro del genoma. Le IS possiedono solo i geni necessari per la trasposizione, codificano per un enzima chiamato trasposasi nella parte centrale, accompagnato a monte e a valle da sequenze ripetute e invertite, ovvero delle sequenze di basi che non codificano per nessun enzima, disposte specularmente alle due estremità.

Quando una IS traspone rimane sempre una copia nella posizione originaria mentre una nuova copia si inserisce in una nuova posizione del genoma; in altre parole, la trasposizione è sempre replicativa. Le sequenze IS, quando traspongono, si inseriscono in luoghi casuali del genoma; il sito in cui avviene l'inserzione di una IS viene chiamato sito bersaglio. Perché sia possibile l'integrazione dell'IS, il sito bersaglio viene rotto dagli enzimi prodotti dalla IS, e successivamente questa si integra nella sequenza. Poiché l'integrazione di una IS è casuale, può avvenire anche all'interno di un gene funzionante; in questo caso, la corretta espressione del gene può venire alterata o interrotta, causando così una mutazione genetica. 2. Complessi: Si tratta di due sequenze di inserzione, in molti casi uguali, che affiancano una serie di geni contenuti in una regione nucleotidica. Sono detti complessi in quanto, se vengono attivatele sequenze a monte e a valle, sispostano anche le regioni centrali dei geni. Le regioni esterne producono gli enzimi trasposasi, necessari per lo spostamento. Le trasposasi hanno bisogno di riconoscere le ripetizioni invertite degli elementi IS alle estremità del trasposone, per iniziare il processo. I trasposoni procariotici contengono tutti i geni necessari alla integrazione e alla escissione dal genoma. Inoltre, normalmente contengono anche dei geni aggiuntivi, come quelli relativi alla resistenza agli antibiotici, o alla capacità di sintetizzare una particolare molecola. Se sono presenti dei plasmidi nella sezione centrale, una coppia dei trasposoni può inserirsi a livello plasmidico e se sono coniugativi, mediante coniugazione possono trasferire antibiotico resistenza. L'effetto dipende da dove questi si inseriscono: se si porta all'interno del gene, quest'ultimo viene inattivato, mentre se si inseriscono a livello del promotore si trasforma.un promotore debole in un promotore forte (perché a livello della IS ci sono regioni più simili alla sequenza consensus). Sono meccanismi indotti dallacellula quando ha bisogno di cambiare, in quanto dispone di specifici siti di inserimento, quindi si puòparlare di meccanismo di regolazione genica. Definisce spesso la variabilità intraspecie presenti tra ceppidiversi, che consentono comunque il mantenimento nello stesso macrogruppo. Meccanismi di trasposizione: - Semplice o non replicativa: entrambi i filamenti del DNA originale si spostano insieme da una regione all'altrasenza replicarsi. - Replicativa: coinvolge la replicazione del DNA, una copia del trasposone rimane nel suo sito originario mentrel'altra si inserisce in un nuovo locus. LA RESTRIZIONE Tra gli strumenti più utili alla cellula per riparare danno al DNA e soprattutto per difendersi da DNA estraneo entratonella cellula, si annoverano le endodesossiribonucleasi direstrizione (enzimi di restrizione, endonucleasi, ER). Esse prendono nome dal fatto che impediscono l'invasione da parte di DNA esogeno, tagliandolo in frammenti. Di conseguenza "restringono" lo spettro di possibili ospiti indesiderati, riconoscendo le sequenze specifiche con tagli specifici (tagliano in siti presenti all'interno del DNA esogeno, e non a partire dalle estremità, per questo si chiamano "endo"). Gli enzimi di restrizione prendono le prime 3 lettere del loro nome dal nome latino del microrganismo che li produce (esempio Eco, dove E è l'iniziale del genere Escherichia e co l'iniziale della specie coli) e poi viene aggiunta la sigla del particolare ceppo da cui l'ER è stata estratta (esempio EcoR1). Si riconoscono così: 1. EcoRI da Escherichia coli 2. HindIII da Haemophilus influenzae 3. BamHI da Bacillus amyloliquefaciens Tali enzimi sono capaci di riconoscere sul DNA brevi sequenze bersaglio, disolito palindromiche tagliandole in posizioni specifiche.
Palindrome è una parola che si legge allo stesso modo sia da destra che da sinistra, e un sito di riconoscimento palindromico è una sequenza in cui il filamento superiore e inferiore, letti in direzione 5'-3', sono uguali, per es. la sequenza: 5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5'
Esistono tre classi di enzimi di restrizione, ma solo gli enzimi di classe II sono caratterizzati da una elevata specificità di taglio. Ogni particolare enzima di restrizione, infatti, riconosce una sequenza specifica di basi all'interno di una catena polinucleotidica. La maggior parte degli enzimi più comuni riconoscono da 4 a 6 basi. Il numero di basi riconosciute è di importanza pratica perché determina la frequenza media di taglio e la dimensione media dei frammenti generati. È ovvio che un enzima che riconosce una sequenza di 4 basi taglierà più frequentemente di uno.che ne riconosce 6. Un'altra particolarità è la modalità di taglio. Si conoscono ER che tagliano in