Biotecnologie vegetali

Biotecnologie vegetali

Nelle biotecnologie, organismi viventi vengono utilizzati per ottenere beni e servizi utili alla società. Secondo EFB, è l'integrazione di cellule o parti di organismi viventi nei processi industriali per produrre beni e servizi. Vengono supportate dall’ingegneria genetica (DNA ricombinante, splicing) che comporta vantaggi (tempo, costi) ed applicabilità a diversi settori: agricoltura, zootecnica, medicina, produzione di alimenti, industria farmaceutica.

Splicing

Lo spliceosoma è una macchina biochimica capace di "tagliare e cucire" l'RNA. Una snRNP (small nuclear ribonuclei protein) si lega alle sequenze consenso che delimitano gli introni nel pre-mRNA, successivamente altre proteine si aggiungono al complesso e formano lo spliceosoma; questo permette di determinare con estrema precisione la posizione in cui devono avvenire i tagli.

Trascritto primario di mRNA:

• snRNP si legano in prossimità delle sequenze consenso 5’ e 3’
• Altre proteine si aggiungono al complesso ed originano lo spliceosoma
• Taglio tra esone 5’ e l’introne
• Dopo il primo taglio, l’introne in prossimità di 5’ forma un’ansa
• Il gruppo OH libero, in corrispondenza di 3’ dell’esone tagliato, reagisce con il fosfato 5’ del secondo esone
• L’esone 3’ viene tagliato e riunito con l’esone 5’
• mRNA maturo viene esportato per la traduzione
• L’introne rimosso viene degradato nel nucleo

Tecnologia del DNA ricombinante

Permette di isolare/tagliare brevi sequenze di DNA per trasferirle/inserirle nel genoma di altre cellule, in modo da modificarne uno o più geni. Le fasi includono identificare il gene, tagliarlo (enzimi di restrizione e ligasi) e isolarlo dalla molecola del DNA, unire il gene a un vettore a sua volta costituito da DNA, e trasferirlo all’interno di una cellula ricevente.

Gli scopi di questa operazione possono essere diversi:

• Migliorare geneticamente l’individuo ricevente (es. maggiore resistenza agli attacchi dei patogeni)
• Usare l’organismo ricevente per clonare il gene introdotto e servirsi della cellula ospite come una "fabbrica" per la produzione di molecole utili

Colori della biotecnologie

• Rosse (medicina, veterinaria, industria farmaceutica): nuovi farmaci e procedimenti per il trattamento di patologie, es. riparare/ricostruire tessuti, farmaci, terapia genica, vaccini. Genentech (1982) produce insulina umana (Hinulin) usando batteri geneticamente modificati (usata per il trattamento del diabete).
• Verdi (agricoltura): impiego di biofertilizzanti e biopesticidi a basso impatto ambientale e buona efficacia; le piante possono essere manipolate geneticamente.
• Bianche (industria): produzione di prodotti commerciali o di consumo di massa (settore alimentare, cosmetico, energetico). Es. produzione di enzimi catalizzatori di diversi processi come energie rinnovabili, fermentazione. Queste tecnologie sono usate per produzioni innovative più sostenibili rispetto a quelle convenzionali. Nelle biotecnologie bianche ci sono due macroaree: chimica fine (bio-molecole e biomateriali) e produzione di bio-energia (bio-combustibili). Partendo da materiali rinnovabili o di scarto, usano i microrganismi e i loro enzimi per ottenere prodotti in modo sostenibile.

Colture vegetali in vitro

La coltura in vitro permette di produrre cellule, tessuti e organi vegetali in condizioni controllate (temperatura, irraggiamento, nutrienti, pH) su substrati artificiali. Le colture sono condotte in condizioni di sterilità per evitare la proliferazione di batteri.

Colture axeniche

Contengono microrganismi selezionati. La totipotenza delle cellule delle piante è alla base delle colture in vitro vegetali; non tutte le cellule sono totipotenti e le cellule vegetali svolgono il loro compito da morte. Ci sono due processi usati nelle colture vegetali:

• Dedifferenziamento: cellule differenziate tornano ad avere attività meristematica (mitotica), avviene in seguito a traumi o fenomeni legati allo sviluppo della pianta.
• Rigenerazione: capacità di una singola cellula di riformare organi interi oppure organismi completi.

Espianti

Nell’espianto, frammenti di piante (meristemi, gemme apicali, gemme ascellari, foglie, fusti, radici, elementi fiorali) vengono usati per avviare una coltura in vitro. Si prediligono porzioni epigee in struttura primaria (perché giovani e meno soggette alla contaminazione di microrganismi).

Gli espianti vengono lavati e sterilizzati usando blandi agenti disinfettanti e tensioattivi poco aggressivi per evitare di danneggiare il tessuto di partenza. I terreni di colture e gli strumenti vengono sterilizzati in autoclave (121°C per 15-20 minuti). Ad esempio, baccelli e boccioli di fiori vengono sterilizzati tramite immersione in Etanolo 70% e passati sulla fiamma (bunsen). Questi elementi vengono escissi asetticamente e messi in coltura evitando il contatto con agenti chimici per migliorare la sopravvivenza dell’espianto in coltura (usato per baccelli integri di orchidee e antere in boccioli chiusi).

L’espianto consente quindi la rigenerazione di nuovo tessuto o di una pianta da frammenti di piante; il suo successo dipende dall’età e dallo stato fisiologico della pianta. Per l’espianto si possono usare:

• Cotiledoni di piante di 3-6 giorni: migliori fonti per la generazione di germoglio avventizi e trasformazione genetica mediante agrobacterium.
• Foglie vere (non embrionali): devono essere completamente sviluppate e se la specie è arborea si preferiscono quelle giovani.
• Radice, ipocotile.
• Zigote (embrione): in alcuni cereali (es. riso, mais), specie erbacee e conifere.

Le operazioni sono condotte in cappe a flusso laminare orizzontale (per mantenere la sterilità di materiali e colture), in quanto le cappe di sicurezza biologica (usate in caso di materiale biologico patogeno) sono inefficaci per i rischi chimici. Nelle cappe, il flusso laminare può essere:

• Orizzontale: flusso unidirezionale di aria sterile (filtrata con filtri HEPA), costituito da filetti di aria paralleli tra loro ed aventi stessa velocità, in questo modo allontanano i contaminanti dall’area di lavoro. Filtri HEPA: formati da fogli di vetro ripiegati che trattengono le particelle. Queste cappe proteggono il campione da contaminazione, ma non la protezione da operatore ed ambiente.
• Verticale: l’aria ambientale viene catturata da 2 filtri HEPA e distribuita, sterile, in un flusso laminare verticale verso il piano di lavoro.

Mezzi colturali

Mezzi di coltura influenzano la crescita e la morfogenesi delle colture vegetali; devono contenere il necessario per sopravvivenza, crescita, moltiplicazione, differenziamento delle cellule. Il mezzo di coltura consiste in una miscela di zuccheri, vitamine, micro/macroelementi ed il pH del terreno viene modificato a 5.8 ± 0.2 usando soluzioni diluite di NaOH o HCl. Se richiesto viene aggiunto un agente gelificante (Agar, Phytagel, Gelrite). I terreni vengono sterilizzati in autoclave a 121°C per 20 min, fitormoni/antibiotici devono essere aggiunti al mezzo di coltura già autoclavato perché sono sensibili alle alte temperature.

Un buon terreno di colture deve contenere:

• Macronutrienti
• Micronutrienti
• Vitamine
• Amminoacidi o integratori di azoto
• Fonte di carbonio
• Integratori organici indefiniti
• Regolatori della crescita
• Agenti di solidificazione

Macroelementi: nutrienti necessari alla cellula in quantità elevate, presenti nei mezzi di coltura in concentrazioni millimolari sotto forma di sali. Esempi: S, P, Mg, Ca, K, N, O, C; es. CaCl₂, KNO₃, MgSO₄, NaH₂PO₄.

Microelementi: necessari in tracce nei mezzi di coltura in concentrazioni micromolari. Esempi: Al, B, Cl, Co, Fe, I, Mn, Mo, Ni, Cu, Zn.

Vitamine: es. Mio-inositolo, Tiamina-HCl, Acido Nicotinico, Piridossina-HCl.

Funzione dei sali minerali nella crescita in vitro:

• N: Componente di proteine, acidi nucleici, coenzimi (richiesto in alte quantità)
• K: Potenziale osmotico (principale catione inorganico)
• Ca: Parete cellulare, signalling
• Mg: Cofattore, componenti clorofilla
• P: Componenti di acidi nucleici, metaboliti secondari
• S: Componente di amminoacidi e cofattori
• Cl: Fotosintesi, movimenti stomatici
• Fe: Componenti citocromi (trasferimento energia)
• Cu: Trasferimento elettronico, cofattore
• Zn: Biosintesi clorofilla, cofattore

Nitrati: Concentrazione e forma dell’azoto con cui viene somministrato nel terreno influenza la crescita della coltura. Ione nitrato (NO₃^-): forma principale in cui viene aggiunto in coltura, per la morfogenesi è necessario NH₄⁺ (ione ammonio); il rapporto dei due ioni deve essere bilanciato per evitare fenomeni di vitrescenza dei germogli. Nei terreni che necessitano di elevata presenza di concentrazione di sostanze azotate l’N è sotto forma di ammoniaca.

Carboidrati: Importanti perché l’efficienza fotosintetica in vitro è limitata (bassa concentrazione di CO₂), si usa principalmente Saccarosio, fruttosio o glucosio, meno frequentemente amido, lattosio, galattosio, maltosio. Ridurre la concentrazione di saccarosio aumenta l’attività fotosintetica perché la pianta, in mancanza di una delle due fonti di carbonio (CO₂/saccarosio) ed usa l’altra per soddisfare il suo fabbisogno; se le condizioni di luce e concentrazione di CO₂ sono ottime, il saccarosio non diventa indispensabile per la crescita in vitro.

Vitamine: Cofattori indispensabili per i processi metabolici/fisiologici, le piante producono tutte le vitamine di cui necessitano, ma in colture bisogna integrarne alcune (es. Tiamina B₁, Acido nicotinico, Piridossina B₆). TDP (tiamina difosfato): cofattore nel metabolismo di carboidrati, amminoacidi, resistenza a stress biotici/abiotici; la biosintesi delle molecole di tiazolo e pirimidina avviene nel cloroplasto, la fosforilazione nel citosol. La tiamina è fondamentale per la crescita di espianti di radice (eccezioni sono le radici di lino e trifoglio), in quanto pochi geni per la biosintesi della tiamina sono espressi nelle radici, quindi esse dipendono dalle parti verdi della pianta per la sua produzione. Radici e foglie possono assorbire la tiamina dal mezzo di coltura (il trasporto può essere acropeto o basipeto); altre vitamine (es. biotina, ac. folico, ac. ascorbico, riboflavina ecc) non sono fattori limitanti la crescita. Mio-inositolo: chimicamente è un carboidrato idrogenato, clinicamente una vitamina B; è un costituente naturale delle piante e viene incorporato come fosfatidio inositolo per il funzionamento delle membrane. Stimola la formazione di germogli, callo, ritarda necrosi, induce morfogenesi.

Amminoacidi: Non fondamentali, ma accelerano la crescita delle piante; alcuni sono fonte di azoto disponibile (es. glutammina, asparagina, glicina, cisteina, arginina, tirosina).

Altri composti organici (adiuvanti): La crescita delle colture viene favorita dall’aggiunta di composti organici es. idrolizzati proteici, latte di cocco (contiene mionositolo), estratti di lievito, malato, polpa di banana, succo di arancia, succo di pomodoro (usate solo quando il mantenimento delle colture è difficoltoso).

Carbone attivo (assorbente): Assorbe sostanze inibitorie o tossiche (es. composti fenolici) prodotte dalle cellule stesse, si può usare Charcoal che stimola crescita, differenziamento (in orchidee, cipolle, carote, pomodori) o inibisce la crescita (es. soia). In alternativa al carbone attivo si può usare PVP.

Agenti gelificanti: Aggiunti per solidificare il terreno, es. Agarosio solido a °C (stabile a temperature di incubazione delle colture).

Regolatori di crescita: ormoni vegetali

Gli ormoni vegetali permettono di orientare lo sviluppo delle colture e la loro azione deriva da regolazioni di crescita endogene ed esogene. I fitormoni usati sono: Auxine, Citochinine, Giberelline, Acido Abscissico.

Rapporto Auxina/Citochinine:

• Sbilanciato verso auxine -> formazione radici
• Pari -> formazione callo
• Sbilanciato verso le citochinine -> formazione germogli

Influenza delle diverse concentrazioni di auxina e citochina sul callo di tabacco in coltura solida:

• No fitormoni -> crescita ridotta
• Alta auxina -> radici
• Alta citochinina -> germoglio
• Pari auxina e citochinina -> germoglio

Auxina naturale (Acido Indol-3-acetico AA): Termolabile, fotolabile -> poco usata in vitro

2,4-D (Acido 2,4-diclorofenossiacetico) e IBA (acido indol-3-butirrico) -> auxine sintetiche usate in vitro.

Auxine: Callogenesi (proliferazione, distensione cellulare), Rizogenesi, embrioni somatici, inibiscono formazione di germogli. La loro azione avviene nelle fasi iniziali (induzione) di rizogenesi/embriogenesi e successivamente diventa inibitoria su neoradici ed embrioni.

Citochinine: Divisione cellulare, Caulogenesi, Gemme laterali, inibiscono Rizogenesi. Quelle naturali (es. zeatina, 2iP) non sono usate in vitro (stabilità, costi), si usano composti sintetici (BAP, chinetina).

Gibberelline: Fioritura, interruzione dormienza (es. bulbi, gemme laterali, semi), degradazione sostanze nutritive nei semi, allungamento internodi. Usato spesso GA₃ (ac. gibberellico), ABA (acido abscissico) usato per rimuovere/inibire crescita calli, promuove accrescimento di gemme vegetative o inibisce stadi tardivi di sviluppo embrionale.

Colture vegetali

Colture di cellule indifferenziate

1. Colture di Callo: Da un’espianto in coltura, usando auxina e citochinine, si forma un tessuto cicatriziale che proliferando genera un Callo (primario); dopo 3-4 settimane si preleva il callo e lo si mette nel mezzo di coltura fresco (callo secondario, subcultura). Una parte di callo può essere mantenuta indefinitivamente subculturandolo su terreno fresco. Un callo viene mantenuto a 25°C con/senza illuminazione. Modificando le concentrazioni di ormoni (auxine, citochinine) viene indotta la formazione di germogli, radici, embrioni o rigenerare l’intera pianta.
2. Sospensioni Cellulari: Colture di singole cellule/aggregati cellulari su un mezzo liquido partendo dal callo che può essere compatto o friabile. Gli agitatori orbitali vengono aggiunti alla coltura per mantenere l’ossigenzione e prevenire la formazione di aggregati cellulari troppo grandi. Dopo 2-3 settimane nella successiva subcultura vengono eliminati frammenti di callo e i clumps ottenendo una sospensione cellulare. Il rapporto tra volume del mezzo di coltura e densità (numero di cellule) deve essere individuato per evitare arresto della crescita o morte cellulare. La subcultura si fa quando la crescita esponenziale rallenta o all’inizio della fase stazionaria.
3. Colture di protoplasti: Protoplasti: cellule prive di parete cellulare ottenuto trattando un espianto (parenchima fogliare) con enzimi che digeriscono la parete (cellulasi, pectinasi). Le colture di protoplasti sono utilizzate per selezionare cellule mutanti ed ottenere ibridi somatici e per tecniche di ingegneria genetica. Dai protoplasti si può ottenere un callo e l’intera pianta.

Protoplasti: Contenuto della cellula (citoplasma + nuclei).

Metodi per la rigenerazione dei protoplasti

1. Meccanico: Plasmolisi (taglio/rottura parete). Usato con cellule vacuolate, ma la resa e vitalità dei protoplasti sono basse; si preferisce il metodo enzimatico.
2. Enzimatico: Enzimi (cellulasi, emicellulasi, pectinasi) digeriscono continuamente la parete; anche il mezzo di coltura deve contenerli. Questo metodo rende le cellule vitali e minimizza/evita il danneggiamento della cellula. Due step: tessuto trattato con pectinasi (separano le cellule degradando la lamella mediana), poi con cellulasi (protoplasti rilasciati rimangono avvolti solo dal plasmalemma); quindi le pectinasi rompono gli aggregati cellulari, le cellulasi degradano la parete cellulare di una singola cellula.
3. Combinato (enzimatico + meccanico): Soluzioni di sali o zuccheri determinano la contrazione del protoplasma senza danneggiare la cellula.

Esempio: Protoplasto separati da mesofillo fogliare, epidermide rimossa o la foglia viene tagliata in piccole strisce. Colture di protoplasti: i segmenti di tessuto vengono incubati con enzimi litici per 18 ore e la parete cellulare viene degradata; l’agitazione del campione permette il rilascio dei protoplasti nella sospensione. I protoplasti vengono poi lavati, filtrati (rimozione di aggregati ecc.) in soluzione con il giusto potenziale osmotico e trasferiti nel terreno di coltura; la capacità di crescita e divisione dei protoplasti è influenzata dal modo in cui è cresciuta la pianta da cui sono stati isolati. Testare la vitalità dei protoplasti: 1) FDA (Fluoresceina diacetato): evidenzia l’attività delle esterasi (coinvolte nell’assemblaggio delle membrane, solo nelle cellule vive).