Biotecnologie animali

Principali aspetti della normativa in materia di impiego di animali a fini scientifici

Introduzione

È di nostro interesse perché nella normativa precedente non erano previsti gli animali da reddito e nel caso dello studio di alcuni aspetti a livello molecolare cellulare, si utilizzano degli animali da laboratorio, che servono per fare delle prove prima di sperimentare in campo sugli animali da reddito.

A fronte della nuova sensibilità nei confronti del regno animale e lo sviluppo delle conoscenze in campo scientifico, si è reso necessario modificare le leggi sulla sperimentazione animale, ormai ancorate a norme veramente obsolete fissate più di 30 anni fa nella direttiva 86/609/CEE. È iniziato il lavoro di revisione e si è realizzato nella disposizione attuale, la direttiva 2010/63/UE, testo che contiene indubbie migliorie rispetto al passato, frutto anche di 10 anni di confronti e di discussioni tra tutte le parti in gioco, mondo protezionistico, comunità scientifica e industria.

La disposizione vale per tutti i Paesi facenti parte dell'UE e ogni Stato deve integrare nel proprio quadro normativo. I tempi sono stati lunghi perché c'è stata una fase di prenormativa dove sono stati consultati svariati enti, e poi una fase di normativa che ha permesso poi la pubblicazione di essa.

Disposizione europea

La disposizione europea è un grandissimo passo avanti nei confronti della tutela del benessere animale, che è l'argomento centrale, piuttosto che la ricerca scientifica. La direttiva dell'UE, come strumento è meno rigido rispetto al regolamento, e permette allo stato membro di apportare delle modifiche quando viene introdotta nel proprio ordinamento giuridico.

Nel caso dell'Italia, è stata introdotta nel 2014, in ritardo rispetto al tempo limite, e ha introdotto ulteriori restrizioni:

• Il divieto di condurre ricerche sugli xenotrapianti di organi (trapianti di organi di altre specie nell'uomo)
• Il divieto di allevare cani, gatti e primati non umani
• Le restrizioni al riutilizzo degli animali nelle procedure (se sono stati utilizzati degli animali per delle ricerche non possono essere riutilizzati per altre sperimentazioni)
• La stretta regolamentazione della produzione e dell’uso di animali geneticamente modificati

I cardini della nuova direttiva 2010/63/UE

1. Ridefinizione dell’oggetto e del campo di applicazione
2. Categorizzazione della gravità delle procedure
3. Definizione dei ruoli di responsabilità
4. Organizzazione del nuovo sistema autorizzativo
5. Affermazione del principio delle 3R

Oggetto e campo di applicazione

L’oggetto della norma definisce le misure di protezione degli animali, e lo fa attraverso:

• Applicazione delle 3R
• Controllo e verifica della provenienza degli animali
• Controllo e verifica delle attività degli allevatori, fornitori e utilizzatori
• Controllo e verifica delle tecniche di allevamento, di identificazione, cura e soppressione degli animali
• Valutazione e autorizzazione di tutti i progetti scientifici che prevedono l’utilizzo degli animali (prima si chiedeva l’autorizzazione solo per cani, gatti e primati non umani)

Gli animali inclusi nella disciplina sono:

• Tutti i vertebrati vivi non umani;
• Le forme larvali in grado di alimentarsi autonomamente;
• Le forme fetali di mammiferi a partire dall’ultimo terzo del normale sviluppo;
• I cefalopodi vivi.

Gravità delle procedure

È definita la soglia minima di «danno» all’animale, oltre la quale si ritiene che il suo impiego debba essere tutelato per legge. La procedura è qualsiasi uso invasivo o non invasivo di un animale a fini sperimentali che possa causare un livello di dolore sofferenza, distress, danno prolungato superiore o equivalente all’inserimento di un ago, secondo le buone pratiche veterinarie.

Ci sono diversi gradi di sofferenza attesa delle procedure: non risveglio, lieve, moderata, grave. In funzione alla gravità delle procedure sperimentali, a cascata ne verranno una serie di conseguenze. Nel caso si dichiari una procedura «grave» la normativa prevede un’analisi retrospettiva, cioè finita la sperimentazione, il responsabile della ricerca deve rendicontare al ministero sulla sperimentazione effettuata. Indicare il numero di animali, dettagliare le procedure e quindi documentare e relazionare la ricerca effettuata.

Ruoli di responsabilità

Nella normativa vengono introdotte delle figure individuali e organi collegiali che hanno delle responsabilità che possono tradursi in sanzioni pecuniarie e amministrative e anche penali, nel caso non rispettino la normativa.

Individuali

• Veterinario designato: ha la competenza di assistere e curare gli animali, di prescrivere le terapie e di indicare le modalità per il loro benessere, con una formazione specifica (a seconda della specie dell’animale).
• Utilizzatore dello stabilimento: è la persona fisica o giuridica autorizzata a porre in esercizio uno stabilimento. Ha la responsabilità sulla sistemazione degli animali, sull'adeguatezza delle strutture e sulla formazione del personale. (nel caso dell’Università è il Rettore)
• Responsabile del benessere animale: figura nuova, con ruolo di vigilanza ed operativo sul benessere e assistenza animale, sia nelle operazioni quotidiane (mantenimento giornaliero degli animali nella struttura) che durante le procedure sperimentali, anche sulle attrezzature e sul personale.
• Responsabile del progetto: presenta la richiesta e il progetto ed è la persona che viene autorizzata e per questo è il responsabile del rispetto delle norme nel progetto sperimentale approvato e della formazione e dell’operato dei propri collaboratori. È la prima persona che subirà delle conseguenze nel caso non vengano rispettate le normative.

Collettivi

• OPBA: Organismo Preposto al Benessere Animale: ha diversi ruoli molto importanti. È composto minimo da: responsabile del benessere animale, il veterinario designato e il membro scientifico (spesso sono più di uno) che deve essere un ricercatore esperto del campo.

I compiti sono: attività di consulenza e di assistenza al personale ed ai ricercatori sul benessere animale, valutazione ed approvazione dei progetti di ricerca, intermediario tra ricercatore e il ministero, amministrazione del dossier progetto e del registro degli animali. Per presentare il progetto serve anche la preparazione e la presentazione di un dossier che contiene una quindicina di documenti e l’OPBA deve inviarlo al ministero insieme al progetto.

Il decreto legislativo prevede la raccolta e la registrazione di una serie di dati ed informazioni:

• Gli animali devono essere identificati tramite un apposito registro (carico/scarico) quindi il numero di animali utilizzati, gli animali che vengono riutilizzati in casi eccezionali per altre sperimentazioni, gli animali destinati alla re immissione nella natura;
• L’uso dei farmaci e degli stupefacenti va documentato;
• Gli esperimenti devono essere previamente autorizzati, così come le persone incaricate di effettuarli, individuando in maniera precisa gli incarichi di ciascuno, in particolare i responsabili del progetto, degli esperimenti e dello stabulario;
• Devono essere indicati molto chiaramente i tipi di interventi che verranno effettuati sull'animale;
• Sono regolate anche le condizioni di mantenimento, le diete e la tipologia di stabulazione.

Questa documentazione, questi registri, vanno conservati per almeno 6 anni.

Sistema autorizzativo

Lo studio infatti prima deve essere approvato da un organismo preposto al benessere animale interno all’Istituto di ricerca, poi deve essere inviato al Ministero della Salute che lo invia poi all’Istituto Superiore di Sanità per l’approvazione finale o per la bocciatura. Tutto questo iter è lunghissimo. Oggi 40gg + 15gg.

Documentazione di base: allegato VI, proposta di progetto, sintesi non tecnica, il parere motivato dell’Opba, il CV del responsabile del progetto, la dichiarazione di assenza di condanne penali del responsabile.

Documenti integrativi: sono la dichiarazione di copertura finanziaria, cioè la presenza di fondi monetari per la sperimentazione (se senza fondi, può essere approvato, ma bisogna dichiarare di avere prossimi fondi nei prossimi 3 mesi); dichiarazione di “assenza di conflitto” d’interesse del membro scientifico (nel senso che non deve far parte del progetto o un membro familiare non deve far parte del progetto), copia dei documenti di identità Rp, Rba, Ms.

Autorizzazione delle strutture

Le strutture in cui sono stabulati ed allevati gli animali, gli stabilimenti di fornitura ed allevamento degli animali devono essere autorizzati dal Comune, previa autorizzazione dei requisiti gestionali e strutturali a carico della ASL. Per porre in esercizio uno stabilimento utilizzatore è necessaria l’autorizzazione rilasciata dal Ministero della Salute. L’autorizzazione ha una validità di 6 anni e alla scadenza va richiesta la domanda di autorizzazione della struttura. Il ministero della salute si fa carico anche di mandare dei controlli da parte della ASL durante tutto il periodo.

Il principio delle 3R

Nel 1959 due accademici britannici, Rex Burch e William Russell, membri della Universities Federation of Animal Welfare (UFAW), associazione tuttora molto attiva nel campo del benessere animale, proposero un principio, o modello, che i ricercatori dovrebbero adottare per attuare una forma di sperimentazione animale più attenta al grado di sofferenza che tale pratica scientifica causa nei soggetti sperimentali.

I pilastri della direttiva

La Direttiva Europea si fonda infatti sul principio delle 3R:

• Rimpiazzare (Replacement completo o parziale): sostituzione del modello animale con metodologie alternative quando possibile (es, utilizzazione di individui non senzienti, o scegliere un animale con minore sensibilità)
• Ridurre (Reduction): riduzione del numero di animali impiegati a fini sperimentali, tale comunque da ottenere una quantità di dati numericamente significativi di sufficiente precisione.
• Rifinire (Refinement): riduzione, a un minimo assoluto, del disagio imposto agli animali usati nella sperimentazione, migliorando le condizioni di vita degli animali da sperimentazione.

Sostanzialmente il ricercatore dovrebbe inizialmente cercare di sostituire il proprio modello animale con un modello alternativo; ridurre il più possibile il numero di individui utilizzati in un certo protocollo sperimentale; e deve cercare di migliorare le condizioni alle quali sono sottoposti gli animali. Il ricercatore deve documentare che non ci sono metodi alternativi per quella ricerca e documentare che una ricerca del genere non è mai stata effettuata e che l'unica via è quella proposta nel progetto.

Come si può applicare ogni principio delle 3R?

• Per Rimpiazzare: valutazione metodi alternativi e pertinenza e adeguatezza del modello animale;
• Per Ridurre: studi pilota, analisi retrospettive di dati precedenti o pubblicati, armonizzazione dei protocolli a livello internazionale. Animali sani, modalità di stabulazione, pianificazione procedure, personale preparato per permettere che anche quel numero più basso di animali arrivi alla fine della sperimentazione con successo;
• Per Rifinire: migliorare le procedure sperimentali, includendo trasporto (prevedere l’acquisto di animali in posti vicini alla struttura di sperimentazione ad es.), acclimatazione, stabulazione, gli animali devono disporre di spazio sufficientemente complesso che consenta loro di esprimere un ampio repertorio di comportamenti normali; stabulazione in gruppo per specie sociali (numero e composizione); arricchimento ambientale per ampliare la gamma di attività a disposizione e aumentare la loro capacità di risposta tra cui l'esercizio fisico, il foraggiamento (es, premio alimentare) e le attività di manipolazione e cognitive adeguate alle specie interessate; formazione adeguata del personale.

Il ricercatore deve rispettare queste 3R, analizzare la validità dei risultati che ottieni e valutare se vale la pena il trasferimento della sperimentazione sugli animali e va fatta un analisi costi-benefici dell’impiego degli animali a fini scientifici. Un modo per ridurre la quantità di animali da utilizzare è la riutilizzazione degli animali già usati per delle sperimentazioni lievi, piuttosto che usare un altro gruppo di animali.

Legislazione italiana

Decreto legislativo 4 marzo 2014, n. 26 Entrata in vigore del provvedimento: 29/03/2014. La legge italiana spinge fortemente verso l’adozione di metodi sostitutivi, anche se in alcuni campi di ricerca questi non possono esser ancora efficaci, perché le conoscenze sono troppo scarse, per esempio per lo studio del sistema nervoso centrale, nel quale è ancora necessario l’uso di animali. Ma enormi progressi sono stati fatti per quanto riguarda i tumori e la tossicologia, che hanno permesso di diminuire drasticamente l’uso di animali.

Colture cellulari

Secondo la prima regola delle 3R, il Replacement, un'alternativa alle sperimentazioni in vivo sono le colture cellulari o colture in vivo. Le differenze tra cellule animali e vegetali sono:

• La totipotenza, mancante nelle cellule animali;
• La differenziazione delle cellule animali;
• Hanno una capacità proliferativa differente;
• Le condizioni di coltura sono più stringenti;
• Le esigenze di tipo nutrizionale sono differenti;

Che cosa sono le colture cellulari? Sono sistemi artificiali in cui le cellule isolate dal loro ambiente (libere od organizzate in tessuti o organi), sono messe in condizioni di vivere all’interno di un sistema definito, dove continuano a svolgere le loro funzioni specifiche e si accrescono per un tempo limitato o indefinitamente. È, appunto, uno strumento di indagine alternativo per evitare i problemi etici e morali legati alla sperimentazione animale. Sono strumento fondamentale per studi biochimici, microbiologici, farmacologici e fisiologici.

Tipologie di colture cellulari

Le colture cellulari animali si distinguono in:

• Colture primarie di cellule animali;
• Colture secondarie;
• Linee cellulari.

Storia delle colture animali

1885: Roux cervello di embrione di pollo (hanno visto che potavano mantenere per tempi brevi vitali degli organi animali)

1907: Harrison campioni di midollo spinale di anfibio (anfibio→animale a sangue freddo)

1913: Carrel porzioni di tessuti in specifici terreni di coltura e era importante creare condizioni asettiche e ricreare condizioni termiche simili a quelle fisiologiche

1943: Earle crescita in vitro di cellule singole isolate da tessuto.

Il vero inizio risale al 1951 con la creazione della prima linea cellulare continua (HeLa) coltivate dal dottore George Otto Gey che coltivò le cellule tumorali della cervice uterina dell’involontaria donatrice Henrietta Lacks e il medico si accorse che queste cellule riuscivano a propagarsi senza grandi difficoltà e infatti il medico iniziò anche a commercializzarle. Dagli anni 50 in poi, negli ultimi 20-30 anni le colture cellulari hanno subito uno sviluppo e una larga diffusione perché migliorate esponenzialmente. Hanno avuto i seguenti progressi:

• Dispositivi di coltura
• Tecniche di sterilità
• Tecniche di dissociazione delle cellule
• Controllo dei mezzi di coltura
• Analisi dei fattori necessari per la crescita in vitro

Strutture per le colture cellulari

Ci sono delle strutture che si sono fatte carico di isolare, di stabilizzare, di propagare e di commercializzare colture cellulari animali, vegetali e umane:

• ATTC: American Type Culture Collection, USA
• ECACC: European Collection of Cell Cultures, UK
• DSMZ: Deusche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Germany
• JCRB: Japanese Collection of Research Bioresources, Japan

Il vantaggio di appoggiarsi a queste banche cellulari è che ci sono dei veri e propri cataloghi dove scegliere la migliore coltura a seconda delle sperimentazioni da effettuare e per ogni coltura ci sono tutte le indicazioni di coltura, per facilitarne l’uso. Accanto alle banche cellulari ci sono i siti di sperimentazione che hanno le proprie banche cellulari.

Campi di applicazione delle colture in vitro

I campi di applicazione delle colture in vitro sono:

1. Per la produzione di sostanze farmacologicamente attive (anticorpi, vaccini, fattori di crescita ecc.);
2. Nei test di tossicità di farmaci, prima che questi vengano saggiati sugli animali o sull’uomo;
3. Nei test di ecotossicità, per valutare l’effetto di inquinanti ambientali;
4. Negli studi relativi ai meccanismi della fisiologia e dello sviluppo cellulari;
5. Negli studi oncologici;
6. Nella diagnosi di malattie genetiche;
7. Nella creazione di organismi transgenici.

Vantaggi e svantaggi della tipologia delle colture cellulari

Colture d’organo: quando è possibile mantenere e sviluppare in vitro intere parti di organo; si mantiene dunque una struttura di tipo organizzato. Il vantaggio è che ho una situazione più vicina, rispetto alle cellule, all’organismo completo. Lo svantaggio è che gli organi in coltura hanno vita breve, perché vanno incontro a necrosi, soprattutto le cellule che stanno nella parte più interne, perché ossigeno e nutrienti non arrivano più attraverso la circolazione sanguigna, e quindi quelle esterne ne riceveranno di più, perché poggiate al substrato, mentre quelle interne no.

Tessuto coltura: quando si mantengono le interazioni tra cellule diverse di un tessuto e si studiano i relativi processi. Come l’organo posso tenerli per tempi limitati e quindi anche le sperimentazioni devono essere brevi.

Colture cellulari (cellule disperse): quando c’è un sistema omogeneo di cellule isolate.