Biotecnologie animali

MATERIALI E METODI

Come già detto la linea cellulare utilizzata è composta da preadipociti murini 3T3-L1 che sono stati acquistati dalla ECACC (European Collection of Cell Culture). FASI: 1. Cellule piastrate e messe in coltura e dopo 48 h sono stati aggiunti gli ormoni per far differenziare i preadipociti in adipociti. 2. Dopo 8-12 giorni dall'aggiunta degli ormoni le cellule sono state trattate con alte temperature per 24h in modo da indurre lo stress da caldo. - Il controllo è stato trattato a 37°C. - Una coltura è stata trattata a 39°C per indurre una media ipertermia. - Una coltura è stata trattata a 41°C per indurre una severa ipertermia. 3. Dopo di che sono stati misurati i seguenti parametri: - La vitalità cellulare: Cell proliferation KIT (XTT) con 50µl di XTT e assorbanza a 450 nm. - L'espressione genica delle adipochine: attraverso l'estrazione dell'RNA, la quantificazione.dell'RNA, retro trascrizione dell'RNA e una rt-PCR utilizzando l'espressione di Hspa-2 come biomarcatore (HSP-70) per leptina e adiponectina;  La secrezione delle adipochineTest ELISA, con assorbanza a 540nm. RISULTATI 1. VITALITA' CELLULARE: La vitalità cellulare non mostra differenze rispetto al controllo, se non un minimo nel trattamento a 41°C. 52 2. QUANTITA' m-RNA DEL BIOMARCATORE Hspa2 La differenza maggiore si nota nel trattamento a 41°C, che fa intendere che il trattamento più severo ha maggiorato l'espressione del biomarcatore. 3. QUANTITA' m-RNA ADIPONECTINA E LEPTINA 4. SECREZIONE ADIPONECTINA E LEPTINA CONCLUSIONI I risultati dimostrano che l'espressione genica e proteica delle due adipochine è regolata in modo differente.  Rispetto alla temperatura di 37°C (controllo), i livelli di mRNA e di secrezione della adiponectina sono aumentati a 39°C, invece la leptina non si modifica. 53  Quando latemperatura viene aumentata a 41°C, l'adiponectina risulta significativamente ridotta e la leptina notevolmente incrementata. L'incremento della leptina è dovuto al coinvolgimento della leptina nella termoregolazione a livello centrale per limitare l'ipertermia attraverso la riduzione dell'ingestione del cibo, del metabolismo energetico e del peso corporeo. La leptina, inoltre, a livello periferico è coinvolta nell'induzione dell'apoptosi negli adipociti. L'aumento della adiponectina serve a aumentare la sensibilità all'insulina dei tessuti. La riduzione dell'adiponectina probabilmente è una risposta adattativa della cellula allo shock termico, che comporta una riduzione della sintesi proteica nella cellula per favorire l'induzione della risposta allo shock termico sul programma genetico in corso. L'upregulation della leptina e la downregulation della adiponectina causato dallo shock termico severo.

Sono la risposta adattativa allo stress termico, e contribuiscono a chiarire i meccanismi che regolano le alterazioni del metabolismo energetico e lipidico che si osservano nelle vacche da latte esposte alle elevate temperature ambientali registrate durante le ondate di calore della stagione estiva.

EFFETTI DELLO STRESS DA CALDO NELLA SECREZIONE DELLE ADIPOCHININE NEL TOPO

In ambienti caldi, gli animali attivano una serie di risposte adattative responsabili degli effetti negativi dello stress da calore (SA) sullo stato metabolico, sulla salute, sull'efficienza della produzione e della riproduzione. Lo stress da calore è associato alle variazioni del metabolismo del glucosio e dei lipidi nei ruminanti. Il tessuto adiposo è un organo secretorio attivo e gli adipociti comunicano con altri sistemi secernendo molecole, le cosiddette adipochine. Due di questi, la leptina e l'adiponectina, sono in genere associati alla regolazione del bilancio energetico e al metabolismo dei carboidrati/lipidi.

Nel recente studio in vitro condotto su adipociti 3T3-L1 si è dimostrato che un forte shock termico regola direttamente la leptina e riduce l'espressione dell'adiponectina. Pertanto, sembra ipotizzabile che lo shock termico, inducendo cambiamenti nella biologia delle adipochine, possa essere un cofattore coinvolto nell'acclimatazione del metabolismo energetico negli animali esposti all'ambiente caldo.

Lo scopo di questo studio in vivo era verificare l'effetto dello stress da calore (HS) sulla secrezione di leptina e adiponectina e il possibile ruolo dell'HS nella modulazione del metabolismo del glucosio nei soggetti HSed.

MATERIALI E METODI

Animali

48 topi maschi di 8 settimane (Mus musculus, C57BL/6)

Disegno sperimentale

Dopo un periodo di adattamento di 14 giorni in condizioni termo naturali (TN: 20-24°C, 50-60% umidità relativa, fotoperiodo di 12:12 ore luce:buio), gli animali sono stati suddivisi in due gruppi, 24 individui ciascuno.

Un gruppo è stato mantenuto nelle condizioni TN, l'altro è stato esposto a una temperatura ambientale di 35°C (HS). L'esperimento è durato 7 giorni. Questo esperimento è stato esaminato dal comitato dell'Etica sugli esperimenti sugli animali dell'Università degli Studi della Tuscia-Viterbo e del Governo italiano.

Misurazioni e campionamenti: All'inizio (0) e dopo 2, 5 e 7 giorni dell'esperimento sono stati prelevati dei campioni di sangue. All'inizio (0), 5 e 7 giorni, sei animali di ogni gruppo sono stati usati per effettuare un test di tolleranza al glucosio (GTT). Il sangue è stato centrifugato e il plasma raccolto e tenuto a -20°C fino alle analisi.

Analisi di laboratorio:

1. La concentrazione plasmatica di leptina, adiponectina e insulina è stata determinata mediante un ELISA indiretto utilizzando kit commerciali. I limiti di sensibilità di questi test erano: 0,05 ng / mL per la leptina,

1. 0,5 ng / mL per l'adiponectina e 0,2 ng / mL per l'insulina.

2. La GTT è stata eseguita su animali affamati per 12 ore. I topi hanno ricevuto una soluzione di glucosio mediante iniezione intraperitoneale (1,5 g / kg di peso corporeo) e la glicemia è stata determinata a 0, 30, 60, 90 e 120 minuti dopo l'iniezione mediante un glucometro. La GTT è stata eseguita su topi coscienti tenuti in trappola. La coda del topo è stata incisa usando una lama affilata. Una piccola goccia di sangue è stata posta sulla striscia reattiva del glucometro e dopo pochi secondi è stato registrato il valore della glicemia.

3. RISULTATI

   1. Cambiamenti nella secrezione di Leptina, Adiponectina e Insulina

      Rispetto al gruppo TN, i livelli plasmatici di leptina, adiponectina e insulina erano più alti nel gruppo stressato da calore a 2, 5 e 7 giorni del periodo sperimentale.

   2. Test di tolleranza al Glucosio (GTT) 54

      I topi sottoposti a stress da calore avevano uno

smaltimento del glucosio maggiore (P<0,05) rispetto alle loro controparti TN.

CONCLUSIONI

Questo studio in vivo convalida il precedente studio in vitro e fornisce le prime prove di un effetto diretto dello stress da calore sulla secrezione di adiponectina e leptina, suggerendo un ruolo modulante di questi adipociti nelle risposte adattative metaboliche osservate nei soggetti esposti all'ambiente caldo.

I dati indicano anche che lo stress da calore è responsabile di un aumento dei livelli e della sensibilità dell'insulina.

L'adiponectina può essere coinvolta nel miglioramento della tolleranza al glucosio osservata nei soggetti sottoposti a stress termico.

File PDF: Applicazione colture cellulari 4

APPLICAZIONI DELLE COLTURE CELLULARI IN PRODUZIONI ANIMALI

ESEMPIO IV

Effetto antiossidante ed antinfiammatorio dei CLA e di Acidi Grassi Essenziali in cellule di ghiandola mammaria bovina (BME-UV1)

L'allevamento della bovina da latte è presente in tutta Italia.

ma sicuramente è concentrato nelle zone dove è reperibile facilmente e coltivabile il formaggio, che sono per lo più le pianure d'Italia. La razza più allevata in Italia è la Frisona e la selezione genetica, negli ultimi anni, si è spinta per aumentare la quantità del latte prodotto e per aumentare il contenuto proteico e lipidico del latte. Questa selezione ha determinato la formazione di animali, sì, altamente produttivi, ma più suscettibili alle dismetabolie e a varie patologie di tipo infettivo. Quindi è importante riuscire a prevenire l'insorgenza di queste patologie negli animali, soprattutto in questi più produttivi, attraverso una corretta alimentazione e attraverso una corretta gestione. In particolare nella bovina da latte il periodo più critico è il così detto periodo di TRANSIZIONE.

Alla base dell'insorgenza di queste patologie ci sono due processi:

1. Infiammazione;
2. Stress ossidativo.

La fase di transizione rappresenta quel periodo che va dall'ultimo periodo della gestazione fino all'inizio della lattazione (3 settimane prima del parto fino a 3 settimane di lattazione). L'animale si trova in una condizione di:

• cambiamenti ormonali;
• il vitello all'interno della mamma sta avendo l'ultima fase esponenziale di crescita e quindi richiede elevate quantità di energia;
• la ghiandola mammaria comincia a differenziarsi per la produzione del latte.

Quindi questo periodo richiede molta energia, molto ossigeno e quindi si assiste ad un aumento dell'attività metabolica, questo determina l'aumento della produzione di ROS (specie reattive dell'ossigeno).

La causa di questa overproduzione di ossigeno è che si viene a creare una condizione in cui la bovina, anche se ha bisogno di grande quantità di energia, non riesce a coprirle con l'alimentazione, che è ridotta del 30%, e

L'animale va in BILANCIO ENERGETICO NEGATIVO. L'animale quindi comincia a rimuovere dal tessuto adiposo i lipidi che vengono rimessi in circolo da utilizzare come fonte di energia. Questi Acidi Grassi Esterificati devono arrivare al fegato per essere ossidati e produrre energia. Il fegato si trova quindi in sovraccarico e molto spesso non riesce a ossidare tutti i NEFA e quindi molto spesso si assiste al rilascio in circolo del beta-idrossibutirrato che sono degli intermedi dell'ossidazione degli acidi grassi e si determina quindi questa overproduzione di ROS e quindi l'insorgenza dello stress ossidativo e di una serie di disordini metabolici come: chetosi, fegato grasso, mastiti, riduzione fertilità degli animali e riduzione produzione del latte. La MASTITE è una delle patologie che può verificarsi e consiste nell'infiammazione della ghiandola mammaria provocata da un'infezione batterica che porta alla disfunzione della ghiandola.

La mastite può essere:

• Clinica: sintomi evidenti come sintomi infiammatori;