Biotecnologie molecolari

T

a capire la quantità iniziale del template – oppure – ciclo della reazione di amplificazione in cui il

segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello treshold

Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui C è inversamente proporzionale alla quantità

T



di template utilizzato. per calcolarmi la curva osservo la fluorescenza del campione

Ordinata = fluorescenza

Ascissa = n° cicli di amplificazione

SYBR green

Vantaggi Svantaggi

metodica semplice Non specifico

La molecola fluorescente si lega random a tutte le

Non costoso doppie eliche includendo dimeri di primers

E’ necessario ottimizzare la metodica per evitare la

formazione di prodotti aspecifici



PCR real time con sonde Taq-man più specific edl SYBR green

La sonda Taq-man è un oligonuceotide che, come i primer della PCR, viene disegnata per essere

complementare alla sequenza bersaglio da amplificare. Quindi questo metodo utilizza oltre ai primers delle

sonde.

La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’interno del frammento amplificato nella reazione di PCR.

Questa sonda contiene due fluorocromi:

R (5’) ---------------------------- Q (3’)

 (R) REPORTER = fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza

 (Q) QUENCHER = fluorocromo a bassa energia che maschera la fluorescenza del reporter

Se (R) è vicino a (Q), il Q “spegne” l’effetto del R in quanto i fotoni di R vengono assorbiti da Q.

Quando metto nella reazione i primer, la Taq polimerasi e la sonda, quest’ultima si va ad attaccare al

filamento complementare nucleotidico, in particolare si attacca ai primer. Durante la fase di amplificazione

la Taq-polim amplifica e, con la sua attività endonucleasica, digerisce la sonda/la sposta dal DNA

complementare e polimerizza l’amplificato.

 A questo punto la sonda non è più intatta, l’ R e Q sono rilasciati e non sono più vicini come nella

sonda.

 Il Q non maschera più la fluorescenza del R che a sua volta può emettere fluorescenza.

IN CONCLUSIONE: La fluorescenza viene rilasciata solo quando la sonda è spostata dalla sua posizione



iniziale (ossia quando viene digerita) questo avviene solo quando io ottengo un amplificato. Quindi tanti



più amplificati ottengo tanta più fluorescenza viene emessa. l’aumento di fluorescenza del R è

direttamente proporzionale al n° di ampliconi generati.

MOLECULAR BEACON

Simile al metodo precedente con sonde Taq-man. Anche qui sono presenti Q e R

 La sonda è studiata in modo che, formando un uncino il fluoroforo e il Q siano vicini. In questa

configurazione, quando viene illuminata dalla luce UV l’energia del fluoroforo viene assorbita dal Q.

 Al contrario quando la sonda si appaia alla sequenza di DNA il fluoroforo e il Q si allontanano e

avviene l’emissione di fluorescenza.

 Quindi: Sotto forma di uncino = no fluorescenza. Se la forma diventa simile a quella di una sequenza

di DNA il Q e R si allontanano e viene emessa fluorescenza. La sonda si attacca al frammento di DNA

complementare ed emette fluorescenza.

o Ad ogni ciclo viene calcolate la fluorescenza emessa (per questo è una real time).

L’aumento della fluorescenza man mano che la reazione procede è un indice del n°

crescente di molecole amplificate.

QUANTIFICAZIONE:

Assoluta: i campioni sono quantificati in modo assoluto. Necessitano di standard di cui si conosce la

concentrazione assoluta (utilizzo standard curve).

Relativa: la quantificazione viene effettuata paragonando il ∆C ( variazione dei cicli in cui raggiungo la fase

T

esponenziale) con quello di controllo interno.

REAL TIME APPLICAZIONI

 Quantificazione dell’espressione genica

 Quantificazione virale

 Quantificazione di agenti patogeni

 Controllo della qualità del campione

 Controllo degli OGM

SEQUENZIAMENTO DIRETTO DEL DNA MEDIANTE L’USO DI TERMINATORI FLIORESCENTI



Il metodo più famoso è usato è quello di Sanger 1958 (Nobel)

Il principio di tale metodo si fonde sull’uso della PCR a cui vengono aggiunti anche dei dideossi nucleotidi

che fungono da determinatori

 Privi del gruppo ossidrilico in 3’dello zucchero

 Incorporati con la stessa efficienza dei deossi nucleotidi

 Bloccano la fine del fluoro foro per la mancanza di 3’OH

Ciascun dideossi è marcato con un fluoroforo diverso.

  dda  ddT(rosso)

FAM ddC (blu); JOE (verde); TAMRA ddG(giallo); ROX

Seqeunziamento:

 

DNA stampo denaturazione del DNA viene usato un unico primer, (a differenza della solita



amplificazione da PCR), che si appaia alla squenza complementare = anealing la polimerasi si attacca al

primer di innesco e polimerizza

 Nella reazione di sequenziamento uso oltre ai nt anche i dideossi coniugati con i fluoro fori

Si forma una popolazione di nucleotidi che differiscono l’uno dall’altro per un dideossinucleotide associato

al proprio fluoro foro.

In seguito viene denaturato il campione/i ottenuti i quali vengono posti su un gel di acrilamide dove è

possibile riconoscere/ricostruire la sequenza basandosi sulla fluorescenza emessa da ciascun frammento. I

frammenti separati in acrilamide differiscono, come detto sopra, per una sola base determinata dall’attacco

del dideossi terminale. 

Elettroferogramma = Mostra i picchi per ogni fluoroforo di ogni frammento permette di leggere il

frammento e quindi la sequenza formata. L’elettroferogramma può anche essere visto come il risultato

finale del sequenziamento prodotto dal sequenziatore automatico.



Sequenziatore automatico = 3100 o 3700 due modelli nei quali varia il n° massimo di campioni

diversi che possono analizzare in 24h

DIFFERENZE TRA PCR E SEQUENZIAMENTO DEL DNA

 La reazione di sequenziamento è unidirezionale in quanto alla miscela viene aggiunto un solo

primer. Non c’è “amplificazione” vera e propria ma solo copiatura del filamento di DNA stampo.

 Nel sequenziamento viene usata una DNA –polimerasi particolare: la sequenasi = alta processività,



assenza di attività esonucleasica 5’-3’ per non rimuovere il ddNTP.

Il sequenziamento del DNA è molto importante, ad esempio, per rintracciare cambiamenti di una sola base

in eterozigosi (mediante sequenziamento diretto). In questo caso nell’elettroferogramma si osserveranno

due picchi (anche non perfettamente sovrapposti) che indicano la presenza di due basi diverse.

Il sequenziamento permette anche di osservare inserzioni e/o delezioni di un numero limitato/piccolo di

basi. In questo caso nell’elettroferogramma, datone uno di riferimento iniziale, si può osservare lo

sfasamento dei picchi, (corrispettivi a determinate basi), che permette di individuare variazioni nella

sequenza di DNA.

CLONAGGIO DEI GENI

Come già visto ,considerando il DNA, il clonaggio può avvenire:

 A livello di sistema cellulare

 Direttamente in vitro

Clonaggio di un frammento in un sistema cellulare:

 Generata una molecola di DNA ricombinante costituita da un vettore (unità di DNA capace di

ricombinarsi) e il frammento di DNA da clonare (es; gene).

 Questa molecola di DNA ricombinante viene introdotta in un sistema cellulare appropriato

 Il vettore si moltiplica nella cellula

 Tutti i discendenti di questa singola cellula produrranno una colonia o un clone le cui cellule

conterranno la medesima molecola di DNA ricombinante.

ENZIMI PER LA MANIPOLAZIONE DEL DNA

Nucleasi: tagliano, accorciano e degradano molecole di acidi nucleici

Polimerasi: producono coppie di molecole di acidi nucleici

Enzimi di modificazione: rimuovono e aggiungono gruppi chimici

Ligasi: uniscono molecole di acidi nucleici

LE NUCLEASI

Eso-nucleasi = accorciano il frammento stesso. Sono in grado di rimuovere un solo nt alla vaolta dalle

stremità

Endo-nuclasi = sono in grado di tagliare i legami fosfodiesterici interni del DNA. Tagliano il frammento

iniziale in pezzi più piccoli

Vi sono diversi tipi di nucleasi:

 Nucleasi S1 = taglia singoli filamenti

 DNAsi 1 = taglia singoli e doppi filamenti

 Endonucleasi di restrizione = tagliano DNA a doppio filamento ma da siti di riconoscimento specifici

o I° enzima isolato da H.O Smith nel 1968

o Enzima di origine batterica. È in grado di tagliare il DNA in maniera precisa e riproducibile a

livello di siti specifici

È molto importante la specificità del taglio, nella clonazione dei geni, per quanto riguarda gli enzimi di

restrizione. Il taglio deve essere specifico dia per il vettore (unico sito di taglio) che per la molecola di DNA

(due siti di taglio)

 Gli enzimi di restrizione nei batteri svolgono un ruolo di difesa contro infezioni virali (restrizione

controllata)

 Il DNA batterico viene protetto attraverso la metilazione delle sequenze di riconoscimento.

Le endonuclaesi di restrizione e le metiltrasnferasi formano il sistema di restrizione e modificazione dei

batteri

SISTEMA DI MODFICAZIONE E RESTRIZIONE DEI BATTERI

Esistono 3 gruppi principali di enzimi di restrizione in base a:

 Organizzazione delle sub dell’enzima

 Richiesta di cofattori

 Sito di riconoscimento o di taglio

1) 3 subunità: R = endonuclesi; M = metilasi; S = specificità di sito

a. Riconoscono una sequenza di DNA bipartito e simmetrico (es: TGAN8TGCT)

b. Tagliano a distanze estremamente variabili (da 400 a 7000 basi)

c. Richiedono ATP per funzionare

2) 2 subunità: MS = metilasi e specificità di sito; R = endonucleasi

a. Riconoscono una sequenza asimmetrica di 5-7 bp

b. Tagliano 24-26 bp a valle del sito di riconoscimento

c. Richiedono ATP per funzionare

d. Endonucleasi e metilasi sono simultanee

In biologia molecolare vengono spesso usate quelle di terzo tipo

3) Terzo tipo

a. Attività metila sica e endonucleasica separate

b. Riconoscono sequenze palindrome di 4-8 bp

c. Tagliano all’interno di sequenze conosciute o a distanza definita

d. Non richiedono ATP per funzionare

Gli enzimi di primo tipo sono poco utili in quanto tagliano il DNA in modo imprevedibile. Gli enzimi di tipo

secondo difficilmente controllabili in quanto tagliano e metilano il DNA contemporaneamente. Gli enzimi di



terzo tipo invece tagliano il DNA in modo specifico e riproducibile per questo sono i più usati.

NOMENCLATURA DEGLI ENZIMI DI RESTRIZIONE

1. Le prime tre lettere, in corsivo, sono prese dalla nomenclatura del batterio d’origine

2. Tipi diversi dello stesso organismo sono identificati da una quarta lettera in maiuscolo (es: Hino,

Hinf ...)

3. Dove necessario, segue una lettera maiuscola a un n° che identi