Biotecnologie molecolari

Biotecnologie molecolari

Nuove: anni ’70, tecniche di biologia molecolare.

Tecniche del DNA ricombinante = clonaggio genico.

• Permisero di clonare in vitro molti geni conosciuti.
• Nuove capacità di creazione artificiale di nuove combinazioni geniche e trasferimento artificiale.
• Ingegnerizzare batteri per ottenere organismi con nuove proprietà di interesse farmacologico.

Applicazioni della biotecnologia

Varie applicazioni della biotecnologia, le più interessanti sono:

• Ricerche di base: identificazione, isolamento e studio della funzione genica (mutagenesi).
• Produzione animali transgenici, Knock out genico (può portare alla mancata formazione dell’organismo, molto pericoloso), ecc…
• Ricordiamo che spesso molti geni sequenziali sono tutt’ora sconosciuti.
• Con la mutagenesi si possono ricavare anche le informazioni riguardanti le funzioni associate al gene/i d’interesse.

Medicina e farmacologia: terapia genica, produzione farmaci (DNA ricombinante, “bireattori”), trapianti tra specie diverse.

In genere si hanno avuto diversi risultati.

Agricoltura: piante resistenti a erbicidi e insetti o a malattie infettive e stress ambientali.

Recupero ambientale: potenzialmente dei processi naturali per il trattamento dei rifiuti e residui tossici.

Clonaggio di geni

Analisi successiva genica per funzione e struttura.

• Clonare un organismo = ottenere un individuo o una popolazione geneticamente identici.
• Clonaggio tratto DNA = ottenere una “popolazione” di DNA (insieme di molecole) identiche alla molecola di partenza.
• Sistema cellulare.
• Direttamente in vitro (PCR).

PCR

K. Mullis nel 1987. PCR (Polymerase Chain Reaction).

Necessari per la reazione di amplificazione:

• Primers, deossi nucleotidi trifosfati, DNA polimerasi (resistente ad alte t°).

Fasi della PCR

La PCR consta di 3 fasi:

• Denaturazione del DNA: apertura della doppia elica di DNA stampo.
• Annealing: i primers si appaiano alle sequenze complementari sul DNA stampo.
  • Temperatura compresa tra 37°C e 72°C: la t° deve essere legata in base al tipo di soggetto da analizzare per permettere l’attacco solo di sequenze complementari e non accoppiamenti errati.
• Estensione: la DNA polimerasi allunga gli inneschi e produce 2 nuove catene di DNA.
• Il processo viene ripetuto più volte.

Ad ogni ciclo ho un aumento esponenziale di DNA stampo. Il n° di molecole di DNA raddoppia per ogni ciclo: Y = N2.

• Y = n° molecole di DNA amplificato.
• N = n° molecole di DNA di partenza.
• n = n° cicli PCR.

DNA target

DNA target (stampo): può essere di 2 tipi:

• Omogeneo, es: plasmide purificato clone plasmidico.
• Eterogeneo, es: DNA genomico, sospensione cellulare o materiale biologico.

Utilizzando coppie di primers specifici sono in grado di amplificare una determinata sequenza d’interesse.

Il DNA target deve essere puro, in assenza di elementi che inibiscono la reazione.

La PCR può fallire in presenza di: troppo DNA, troppo RNA, ioni metallici, etanolo, detergente, etc…

Oligonucleotidi e primers

Per una buona riuscita della reazione di amplificazione devo scegliere con cura la regione ottimale per costruire i primers.

Quindi:

• Estrema cura nella scelta della regione da amplificare.
• Evitare sequenze inusuali come sequenze di purine e pirimidine.
• Lunghezza: 20-30 bp (non meno di 16 bp), importante per la specificità dei primers.
• Le estremità 3’ devono essere tra loro complementari: rischio di formazione di dimeri.

Inoltre ci vuole:

• Equilibrato il rapporto AT/GC.
• T° melting comprese tra 45°C-68°C.
• T° melting simili (+/- 2°C).
• Di conseguenza anche le t° di annealing variano.

Diverse coppie di primer possono amplificare una regione genica. Importante è usare i primer più appaiati con giusta lunghezza.

Concentrazioni di MgCl2

• Necessario per l’attività dell’enzima.
• Stabilizza l’annealing tra primer e DNA stampo.

Bisogna usarne una quantità notevole in quanto viene sottratto durante la reazione di PCR da vari fattori, quali: DNA, EDTA, dNTPs.

La concentrazione usata di MgCl2 è: 0.5-5 mM (di norma si usa 1.5 mM).

Nella reazione di PCR si deve usare anche un Buffer di sostanze miste all’interno del quale si può sciogliere una diversa quantità di MgCl2 a seconda della necessità.

L’aggiunta di MgCl2 a parte è ottimale in quanto se ne può mettere quanto serve senza usare un valore standard che potrebbe essere errato per il campione analizzato.

• La concentrazione viene ottimizzata empiricamente.
• Concentrazioni di MgCl2 troppo basse = non si ha una visione delle bande dopo elettroforesi in gel per mancata unione dei primers al DNA stampo.
• Concentrazione di MgCl2 troppo alte = la polimerasi continua a funzionare e polimerizza anche frammenti aspecifici portando alla formazione anche di bande errate dopo la corsa elettroforetica in gel.

Parametri e condizioni della PCR

Annealing

È la parte forse più delicata della PCR.

Il calcolo della T° di annealing (Tm-2°C):

• Con algoritmi sofisticati.
• Messa a punto empiricamente.
• Se la t° è troppo alta i primers restano dissociati.
• Se la t° è troppo bassa i primers si accoppiano anche scorrettamente.

La PCR è estremamente sensibile; questo risulta uno svantaggio e un vantaggio al tempo stesso.

Lo svantaggio principale è la possibile contaminazione del reagente da analizzare.

Per questo motivo devo usare tutte le precauzioni del caso (guanti sterili, strumenti monouso sterili, etc…) e in più devo effettuare dei controlli per evitare l’insorgere di falsi-positivi.

Controlli

Controlli: (positivi o negativi).

Prendo il Buffer, dNTP, la polimerasi senza il DNA stampo da analizzare e lo metto in una provetta di controllo, applico la reazione di PCR e osservo se è positiva.

Se è positiva il mio campione risulta contaminato da un'altra fonte di DNA (non quello stampo in quanto assente), se è negativo allora non è avvenuta nessuna amplificazione e quindi la soluzione non è stata contaminata.

PCR: vantaggi e svantaggi

Visualizzazione di PCR mediante elettroforesi

Vi sono 2 tipi di elettroforesi:

• Elettroforesi orizzontale = carico il DNA o RNA su agarosio.
  • Agarosio = permette di individuare prodotti che differiscono per 10-15 bq.
• Elettroforesi verticale = carico il DNA o RNA o proteine su acrilamide.
  • Acroleina = riesco a individuare prodotti che differiscono anche solo per 1 bq.

Gel = reticolo complesso di pori attraverso i quali le molecole di DNA viaggiano dal catodo (-) all’anodo (+).

Anche la concentrazione di agarosio deve essere giusta, equilibrata in base alla lunghezza dei frammenti che mi aspetto nella PCR.

Le molecole vengono separate in base alle dimensioni (P.M).

• P.M basso = migrano di più verso (+).
• P.M alto = migrano di più verso (-).

Il campione da caricare sul gel deve essere caricato con il loading buffer.

Il loading buffer:

• Aumenta la densità dei campioni (contiene glicerolo) per far depositare di più il campione sul fondo.
• Inibisce l’attività nucleasica.
• Presenta coloranti che migrano nel gel come frammenti di varie dimensioni (es: cronanfenolo e sinancianolo). In questo modo fungono da indicatori di determinate dimensioni di ipotetici frammenti di DNA o RNA con cui confrontare i vari frammenti.

Il DNA viene visualizzato con colorazione con Etidio Bromuro che congiunto al DNA si illumina sottoposto a raggi UV. Dopo la corsa elettroforetica aggiungo Etidio Bromuro e osservo il tutto sotto cappa con raggi UV e osservo le bande. Per definire le dimensioni di un amplificato introduco nel gel dei marcatori con PM di DNA nota (DNA leader).

Non tutte le molecole di DNA sono lineari:

• Es: plasmide batterico = parte rilassata + parte superavvolta.
• Molecole di DNA lineare non migrano diversamente nel gel, mentre molecole di DNA con forma diversa (anche se hanno le stesse dimensioni) migrano in modo diverso sul gel d’agarosio.

Elettroforesi in condizioni denaturanti

Gli acidi nucleici a singolo filamento (come l’RNA), tendono a formare strutture secondarie; pertanto la loro corsa elettroforetica è fortemente influenzata dal modo in cui si ripiegano.

• Per ottenere una buona separazione, l’RNA deve essere prima denaturato, al fine di mantenere le molecole in forma lineare.
• La denaturazione si ottiene portando a 90-95°C il campione e aggiungendo agenti denaturanti, quali: formamide, urea etc… condizioni denaturanti.

Elettroforesi in gel di poliacrilamide (PAGE)

A differenza del gel d’agarosio, la poliacrilamide permette la separazione di frammenti che differiscono anche per poche paia di basi, anche solo di una. Quindi risulta molto utile per la separazione di frammenti minori di 1 Kb.

La preparazione di questi gel di poliacrilamide è più elaborata del gel d’agarosio:

• È usata per elettroforesi verticale.
• Il gel è sottile; 0.4-5 mm.
• Acrilamide + bis acrilamide (rapporto preciso, es: 29:1 o 19:1 etc… il rapporto determina lo spessore dei pori del gel).
• Il voltaggio usato per la corsa elettroforetica è superiore a quello con il gel d’agarosio. Il gel tenderebbe a surriscaldarsi con un voltaggio così alto. Per questo il gel deve essere raffreddato in apposite camere.

RT—PCR

RT (reverse trascriptation) su template di RNA per la produzione di cDNA (DNA complementare ad un mRNA).

A questo scopo si utilizza un enzima “reverse trascriptation” o trascrittasi inversa che deriva dai retrovirus eucaristici, AMV, M-MULV.

• Tale enzima non è termoresistente anche se recentemente sono state isolate e clonate delle forme mutanti capaci di resistere fino a temperature di 60°C.

Prima della retrotrascrizione si tratta l’RNA con DNAsi per eliminare ogni possibile traccia di DNA genomico che potrebbe dare origine a falsi positivi.

L’RNA però è molto instabile, per questo vanno usati degli inibitori di RNAsi, per evitare che si degradi. Il cDNA è molto più stabile e si conserva meglio e più a lungo.

Esempio di RT—PCR

1. Prelevo un campione da un tessuto, es: cervello.
2. Effettuo lisi cellulare e purificazione mRNA.
3. Creo dei primer per esoni specifici del mio RNA, es: primer poli(T) e ibridizzazione con questi.
4. Si fa una coppia del mRNA in cDNA con RT.
5. L’RNA viene degradato e resta solo il cDNA.
6. Viene sintetizzato un filamento di DNA complementare usando la DNA-polimerasi. I frammenti di RNA agiscono come primer.

Alla fine ottengo una doppia elica di DNA complementare all’RNA originale. In questo modo è possibile osservare se un determinato fattore (es: aminoacido) venga espresso nel tessuto analizzato il cui “messaggio” è portato del RNA d’interesse.

Invece delle sequenze Oligo-dT a volte è possibile anche utilizzare sequenze random di 6 bq come innesco.

• Questi primers di basi scelte a caso hanno il vantaggio che se devo trascrivere dei pezzi molto lunghi la RT può staccarsi dallo stampo prima di raggiungere la terminazione 5’. In questo modo (a differenza degli Oligo-dT) può funzionare per trascritti più lunghi.
• L’RT—PCR viene usata per specificare un preciso RNA.

RT—PCR, cDNA, amplificazione della sequenza di interesse con oligonucleotidi di innesco precisi, analisi dei prodotti con elettroforesi.

Questa particolare PCR può essere utilizzata anche per individuare possibili infezioni virali.

Prelevo un campione di sangue (rimozione cell) → centrifugazione → estrazione RNA virale → RT—PCR → amplificazione → gel elettroforetico (uso un controllo per confrontare i dati ottenuti dalla corsa elettroforetica).

PCR in tempo reale

Permette di valutare, mentre avviene la reazione, la quantità di DNA di partenza.

Il processo di amplificazione di DNA, quando faccio una PCR, è limitato da:

• Quantità di primers.
• Attività della Taq polimerasi: anche se resistente a certe temperature la sua attività è limitata ad un tempo preciso.

La curva di amplificazione dopo una prima fase esponenziale, tende ad assumere un andamento di tipo lineare (plateau); con il plateau non vi è più incremento dei prodotti.

Ascissa = n° cicli; ordinata = n° molecole.

La fase/relazione esponenziale viene mantenuta solo in un intervallo di cicli iniziale, di solito i primi 20, dopo di che si passa al plateau.

• Durante questa fase esponenziale il prodotto della PCR è proporzionale al template secondo la formula: Y = N2.

PCR quantitativo in tempo reale (real time):

• Misura l’amplificazione in tempo reale durante la fase di espansione della PCR, cioè quando l’efficienza di amplificazione non è influenzata dalla variabilità di reazione.
• Ciò è possibile mediante il rilevamento di una fluorescenza prodotta da particolari sostanze che legano in modo proporzionale i prodotti della PCR.
• La misurazione dell’accumulo della fluorescenza in tempo reale è proporzionale al n° di molecole amplificate e quindi al n° di molecole presenti in partenza.

Metodiche di quantificazione con PCR real time

• Coloranti fluorescenti (SYBR green).
• Sonde oligonucleotidiche specifiche (sonde Taq man, beacons, etc…).

SYBR green

Molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA a doppio filamento.

Template + primer + Taq polimerasi: a questo mix aggiungo il SYBR green.

• Quando inizia la polimerizzazione, il primer si attacca. Inizia a polimerizzare. La polimerasi si attacca e inizia a polimerizzare il DNA. Allo stesso tempo il colorante si unisce al nuovo DNA formantesi.
• Dopo una prima fase in cui il materiale amplificato non è rilevabile, la PCR entra in una fase esponenziale.
  • Se all’inizio sono disponibili più molecole bersaglio, saranno necessari meno cicli per raggiungere la fase esponenziale.
• Si individua anche un fattore C = n° di cicli necessari per arrivare alla fase esponenziale, sufficiente a capire la quantità iniziale del template – oppure – ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello threshold.

Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui Ct è inversamente proporzionale alla quantità di template utilizzato. Per calcolarmi la curva osservo la fluorescenza del campione.

Ordinata = fluorescenza.

Ascissa = n° cicli di amplificazione.

SYBR green: vantaggi e svantaggi

PCR real time con sonde Taq-man più specifiche del SYBR green

La sonda Taq-man è un oligonucleotide che, come i primer della PCR, viene disegnata per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificare. Quindi questo metodo utilizza oltre ai primers delle sonde.

La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’interno del frammento amplificato nella reazione di PCR.

Questa sonda contiene due fluorocromi:

R (5’) ---------------------------- Q (3’)

• (R) REPORTER = fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza.
• (Q) QUENCHER = fluorocromo a bassa energia che maschera la fluorescenza del reporter.

Se (R) è vicino a (Q), il Q “spegne” l’effetto del R in quanto i fotoni di R vengono assorbiti da Q.

Quando metto nella reazione i primer, la Taq polimerasi e la sonda, quest’ultima si va ad attaccare al filamento complementare nucleotidico, in particolare si attacca ai primer. Durante la fase di amplificazione la Taq-polimerasi amplifica e, con la sua attività endonucleasica, digerisce la sonda/la sposta dal DNA complementare e polimerizza l’amplificato.

• A questo punto la sonda non è più intatta, l’R e Q sono rilasciati e non sono più vicini come nella sonda.
• Il Q non maschera più la fluorescenza del R che a sua volta può emettere fluorescenza.

In conclusione: la fluorescenza viene rilasciata solo quando la sonda è spostata dalla sua posizione iniziale (ossia quando viene digerita); questo avviene solo quando io ottengo un amplificato. Quindi tanti più amplificati ottengo tanta più fluorescenza viene emessa. L’aumento di fluorescenza del R è direttamente proporzionale al n° di ampliconi generati.

Molecular beacon

Simile al metodo precedente con sonde Taq-man. Anche qui sono presenti Q e R.

• La sonda è studiata in modo che, formando un uncino, il fluoroforo e il Q siano vicini.