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La sintesi del DNA tramite PCR
OH libero e procederà nella sintesi. Poiché anche in questo caso si lavora su un DNA a doppio filamento, entrambi i filamenti fungono da stampo e quindi i due primer sono uno su un filamento e uno su quello opposto per creare gli estremi della regione e un legame con il filamento corretto per avere la direzione idonea 5'3'. Poi sono necessari anche i nucleotidi trifosfato per far sì che la DNA polimerasi copi il filamento stampo e in più si aggiungono ioni magnesio perché stabilizzano l'azione. Tutti questi componenti vengono aggiunti contemporaneamente alla miscela di reazione di PCR e poi si impostano dei cicli termici ricordando che il DNA può associarsi o riassociarsi in modo reversibile in funzione della temperatura: la miscela di reazione viene portata a 100-95°C per far sì che avvenga la denaturazione, ovvero l'apertura dei due filamenti perché entrambi devono fungere da stampo; successivamente, si ha lo
Il secondo step che deve essere impostato è la temperatura che deve permettere la riassociazione tra il primer e il corrispondente filamento di DNA stampo. I primer sono complementari alle sequenze delle regioni e se non si abbassa la temperatura sotto la Tm la riassociazione non avviene in modo ideale.
Il secondo step è la fase di appaiamento dei primer che avviene calcolando la temperatura di melting del primer che è data da una formula e si fa la media della Tm dei due primer e a questa temperatura si tolgono 3°C per essere al di sotto del valore calcolato e si favorisce l'appaiamento dei primer ai giusti filamenti.
Il primer è una sequenza nucleotidica ed essendo complementare al filamento a cui deve legarsi la reazione sarà antiparallela. Non c'è bisogno di scendere sotto i 25°C, ma soltanto sotto il Tm calcolato perché i primer sono dei frammenti molto corti rispetto a quando si devono riassociare frammenti eterologhi.
Sono costruiti in modo da essere complementari alle regioni a cui si devono appaiare, perciò non è necessario uno sbalzo termico tra denaturazione e appaiamento. La temperatura dipende dall'appaiamento e dalla tipologia di primer e bisogna fare in modo che i due primer siano omologhi almeno al 3' OH del primer perché è in quella regione che la DNA polimerasi deve trovare il doppio filamento per partire con la sua azione. Dopo che i primer si sono legati e appaiati in modo corretto, avviene l'ultimo step termico che corrisponde all'azione della DNA polimerasi e a seconda del tipo si lavora alla temperatura ottimale dell'enzima per far sì che sia il più veloce possibile; ad esempio, la Taq polimerasi ha una temperatura ideale di 72-75°C, quindi si usa questa temperatura. Si usano quindi cicli termici con tre step: denaturazione, appaiamento e allungamento o sintesi. La denaturazione e la sintesi rimangono uguali se si usa la
stessa DNApolimerasi, mentre la fase di appaiamento è in funzione della sequenza della coppia di primer. È necessaria una temperatura di denaturazione per consentire separazione dei filamenti e fungere da stampo, mentre la temperatura di riassociazione si calcola con Tm dei primer togliendo 3°C favorendo l'accoppiamento di questi ai relativi filamenti stampo facendo in modo che il primo 3'OH sia libero per avere l'azione della DNApolimerasi nella direzione esatta; l'ultima temperatura è quella di azione della DNA polimerasi. I cicli termici vengono operati in un termociclatore dove si ha una posizione per inserire il vassoio con le provette in cui è stata messa la miscela di reazione; si utilizzano volumi piccoli quindi si usano provette da 200 μlitri di volume totale e sul display si impostano i tre step di temperatura per il tempo desiderato. Il termociclatore viene fatto partire e in poche ore si ottengono 10^6-10^7 copie dellaOgni esperimento prevede che ci sia sempre un controllo negativo di amplificazione. I componenti della reazione di PCR sono presenti in quantità diversa: il DNA che può essere totale viene aggiunto per μL che corrisponde circa a q μg e in teoria basta una molecola di DNA per compiere l'amplificazione perché è esponenziale; è necessaria la coppia di primer per 0,1 μL, delle dNTP per 2 μL, quindi la miscela di reazione ha un volume totale non più di 20-25 μL. È necessario però predisporre un controllo negativo perché qualsiasi DNA estraneo potrebbe amplificarsi se i primer trovano complementarità, quindi tutte le operazioni di preparazione della miscela vengono fatte sotto cappa con flusso laminare con del materiale sterile per evitare la contaminazione con il DNA estraneo. Anche i vari reagenti vengono utilizzati sterili però può capitare di usare reagenti che si sono contaminati.
con il DNA utilizzato con l'esperimento precedente; il controllo negativo è una miscela direazione contenente tutti i componenti tranne il DNA stampo: se non c'è DNA il controllo negativo nella gel-elettroforesi non dà una banda visibile, mentre se ci sono bande anche di minore intensità la reazione deve essere rifatta per evitare di avere un DNA non desiderato nella miscela. Un ciclo termico dura molto poco e quindi la velocità con cui si ottengono 10^6-10^7 copie di un determinato amplicone è molto alta. Alcune analisi prevedono che ci sia più di una banda, quindi bisogna sapere quante bande bisogna ottenere e il relativo peso molecolare; dipende dalla regione target che si vuole studiare. L'amplificazione permette di ottenere in modo esponenziale copie dell'amplicone; se si segue l'ottenimento esiste una fase esponenziale ma poi si arriva a un platò dove qualche componente è finito perché.non richiede un DNA altamente purificato. Inoltre, la PCR consente di amplificare specificamente il DNA di interesse, evitando la necessità di clonare l'intero genoma. Questo rende la PCR un metodo molto efficiente ed economico per ottenere grandi quantità di DNA specifico.èaltamente specifica e molto sensibile e riproducibile; rispetto a tante altre metodologie risulta essere anchepoco costosa e per questo è molto diffusa. Il limite è che bisogna conoscere a priori almeno gli estremi dellaregione da amplificare per la costruzione dei primer, quindi bisogna avere la sequenza iniziale e finale dellaregione per costruire gli idonei primer che permettono la replicazione della regione interna; questo in alcunicasi è un limite perché non sono note tante sequenze di geni che si vorrebbero studiare. Si hanno adisposizione banche dati genomiche che contengono sequenze di molti geni e genomi ma la condizione èche bisogna conoscere la sequenza del ceppo; a volte si fa riferimento a sequenze simili presenti in altri ceppidella specie o geni di specie affini e per questo i primer non sono omologhi al 100%. A volte si parla di primerdegenerati dove è possibile avere delle variazioni nella sequenza del primer
purché non siano presenti al3’OH del primer perché ci deve essere complementarità per far sì che la DNA polimerasi riconosca la regioneper legarsi e iniziare la sintesi. I primer vengono costruiti da ditte specializzate ma bisogna dare la sequenzae la giusta direzione; quando si ricerca la sequenza in una banca dati per amplificarla solitamente nonvengono date le sequenze dei due filamenti ma l’indicazione di uno dei due in direzione 5’3’ e l’altro si puòestrapolare. Se ad esempio si vogliono i primer per amplificare laregione da TAATACTTTTT e GAGATGTT: il primo primerforward si costruisce copiando la sequenza delle prime20-25 basi nucleotidiche presenti sulla sequenza 5’3’costruendo quindi il primer in questa sequenza e nelladirezione 5’3’. Questo primer non si lega al filamentoindicato ma a quello complementare nella direzioneantiparallela, quindi 3’5’ dove trova
La complementarità delle basi e la direzione corretta per la sintesi. L'altro primer che delimita la fine della regione è invece detto reverse e si costruisce considerando le ultime 20-25 basi presenti sulla
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