Biotecnologie genetico-molecolari

DNA.

Il tempo di contatto è infatti molto basso, e permette il passaggio di solo una piccola porzione di DNA

cromosomale della cellula donatrice, originando una cellula HFR+ (alta frequenza di ricombinazione).

Tale porzione di DNA può portare a vantaggi specifici.

La cellula ricevente è comunque in situazione di svantaggio, di difficoltà, quando inizia questo processo.

Quello appena descritto è il trasferimento genico orizzontale.

Quando il plasmide F è inserito come episoma, si può inserire:

Con oriT nel punto di inserimento;

o Con oriT diverso dal punto di inserimento: in questo caso il plasmide inizia ad aprirsi sempre da oriT,

o la cellula ricevente però non acquisisce tutto il plasmide poiché altrimenti dovrebbe acquisire tutto il

DNA cromosomale. Tali cellule sono comunque HFR, ma rimangono HFR-, poiché non hanno

acquisito l’intero plasmide.

Nei Gram+ è raro trovare i plasmidi coniugativi come episomi, è invece più frequente avere un plasmide

coniugativo più grande e non inserito: tale plasmide viene trasferito e porta una maggiore quantità di

informazioni.

Le informazioni mediate dai plasmidi sono la resistenza ad antibiotici, la produzione di molecole

particolari;

Trasduzione, se mediata da un fago, ovvero un virus che attacca specificamente i batteri. I fagi sono ad

- alta specificità, e possono originare il ciclo litico o lisogenico.

Una volta che il fago ha individuato la cellula batterica esso vi aderisce e ripiega la coda.

Per iniettare il DNA fagico c’è la secrezione di lisozima che lede la parete cellulare, poi vi è l’iniezione di

DNA fagico. Il DNA fagico si comporta da episoma e può avere due destini:

Diretta replicazione del DNA fagico (ciclo litico). Se nella testa del fago entra una porzione di DNA

o cromosomale in fase di degradazione della cellula ospite, allora vi è la fuoriuscita di una particella virale

con diverso DNA. Tale fago potrà infettare un'altra cellula, e in quel caso la cellula infettata avrà acquisito

del materiale genetico proveniente da una altra cellula che potrebbe migliorare le prestazioni della

cellula “infettata”.

Questo processo vede la ricezione casuale del DNA, perché non è indotta dalla cellula, ed è detta

trasduzione generalizzata (nel ciclo litico), poiché ciò che entra nella cellula ospite è una regione di

DNA qualsiasi, non è particolare. La trasduzione generalizzata è legata al ciclo litico;

Integrazione nel DNA batterico, poi la cellula batterica riconosce che si tratta di DNA esogeno, lo blocca

o e il fago non si replica (ciclo lisogenico).

Uno stimolo esterno può poi liberare il DNA fagico, ed inizia il ciclo litico, che comporta la replicazione

del DNA virale dagli enzimi cellulari in modo tale da ottenere tante molecole di DNA virale, il quale

induce poi la cellula a produrre tutte le proteine virali (capsomero, coda ecc…). La cellula lavora solo

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per la costruzione di particelle fagiche, quindi le sue molecole proprie si degradano. Il fago interno al

batterio si assembla: si inizia con l’incapsulamento del genoma nella testa, poi vi è la coda.

Alla fine avviene la lisi della parete cellulare e si liberano le particelle fagiche neogenerate.

La trasduzione legata al ciclo lisogenico, quindi che ha luogo in seguito all’inglobamento e successivo rilascio

del genoma fagico dal genoma batterico, è detta trasduzione specializzata (nel ciclo lisogenico), poiché si

conosce la porzione di DNA che viene trasferita. Nella fase di escissione anziché staccarsi dal DNA

cromosomale solo il genoma fagico si stacca anche una porzione di DNA cromosomale presente a monte o a

valle del genoma fagico. Questa escissione non impedisce il successivo ciclo litico, e tutte le particelle virali

avranno anche il DNA cromosomale.

Nel successivo ciclo lisogenico si infetta una cellula e si inserisce nel DNA cromosomale della cellula ospite

del DNA fagico + parte del DNA cromosomale della cellula precedente. La cellula riconosce e blocca solo i

geni virali, mentre la frazione batterica non è bloccata. La cellula infettata potrà quindi esprimere i geni

derivanti dalla cellula precedente, fin tanto che il genoma resta inglobato in quello della cellula.

Tale processo è mediato del fago λ, ed è detto trasduzione specializzata poiché il DNA fagico si inserisce

sempre in un determinato punto specifico, quindi i geni trasferiti saranno sempre quelli a monte o a valle del

DNA fagico.

L’inserimento di tali frazioni geniche fagiche nel DNA cromosomale della cellula ospite è più difficoltoso

poiché un’estremità terminale del DNA fagico non combacia (del tutto o completamente) con l’estremità di

inserzione classica sul DNA cromosomale della cellula ospite. In tal caso inizia il ciclo litico.

1.2 Il DNA

Il DNA è composto da due filamenti antiparalleli. Si compone di desossiribosio, gruppi fosfato e 4 basi azotate,

divise in purine (Guanina e Adenina) e pirimidine (Citosina e Timina, sostituita dall’Uracile nell’RNA).

L’insieme di desossiribosio, gruppo fosfato e base azotata forma il nucleotide (base nucleotidica). In quanto le

purine sono più grandi delle pirimidine, ad ogni purina su di un filamento è accoppiata una pirimidina

sull’altro filamento.

La struttura del DNA possiede una carica netta negativa a causa dei gruppi fosfato, che provoca una

repulsione elettrostatica che tende a far allontanare i due filamenti. La stabilità dei due filamenti è garantita

dai legami idrogeno.

I due filamenti sono tenuti insieme da legami idrogeno che si formano tra le basi complementari. L’adenina

trova complementarietà con la timina, e si legano con due legami idrogeno, mentre citosina e guanina si

uniscono con tre legami idrogeno.

Aumentando la T i legami H si rompono e il DNA si denatura, ovvero la catena si apre. All’aumentare di

coppie GC aumenta la T di denaturazione poiché ci sono più legami.

Per convenzione una sequenza di DNA a doppio filamento si rappresenta solo scrivendo la sequenza di uno

dei due filamenti in direzione 5’→3’, questo perché i due filamenti sono complementari e quindi

l’informazione contenuta in un filamento può essere dedotta dal filamento complementare.

1.3 L’RNA

RNA è presente nella cellula in tre forme: mRNA (messaggero), rRNA (ribosomiale), tRNA (transfer). L’RNA

possiede il ribosio, l’uracile (al posto della timina) ed è sempre a singolo filamento.

mRNA copia l’informazione dal DNA e la trasferisce ai ribosomi, dove avviene la traduzione.

rRNA forma i ribosomi, organelli indispensabili per la cellula poiché a livello di essi avviene la sintesi proteica.

I ribosomi sono composti da due subunità, l’rRNA è presente in entrambe. Nella subunità piccola 30S c’è rRNA

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16S, nella subunità grande 50S ci sono rRNA 23s e rRNA 5s. Il ribosoma totale è 70S, ed è formato dall’unione

di entrambe le due subunità.

RNA ha il compito di trasportare uno specifico aminoacido a livello dei ribosomi; ha la tipica forma a trifoglio

(è sempre a singolo filamento, però le basi nucleotidiche si ripiegano e uniscono a formare questa specifica

forma).

1.4 Il codice genetico e degenerazione del codice

Le 4 basi nucleotidiche del DNA sono disposte in modo tale da

fornire particolari informazioni. Il codice genetico si legge a

triplette (codoni), ovvero tre basi nucleotidiche disposte in una

specifica sequenza codificano per un determinato aminoacido.

Una tripletta che codifica per un solo determinato aminoacido, ma

lo stesso aminoacido può essere codificato da diverse triplette,

diverse anche per solo una base azotata, e questo porta alla

degenerazione del codice genetico. Il cambio di base avviene a

livello dell’ultima base nucleotidica della tripletta (questo

fenomeno è chiamato vacillamento della terza base). Quindi più

codoni possono specificare lo stesso aminoacido, purché il cambio

avvenga a livello dell’ultima base azotata.

Si contano circa 61 codoni “di senso” a cui si aggiungono 3 codoni di stop (TAA, TAG, TGA) e altrettanti di

inizio (ATG, cui corrisponde un N-formil-metionina, aminoacido modificato che serve per indicare l’inizio

della traduzione sul ribosoma, caratteristica del dominio dei batteri. Tale aminoacido viene rimosso quando

la proteina è matura), a fronte di 20 aminoacidi.

1.5 Il gene e l’Open Reading Frame

Un gene è una sequenza nucleotidica costituita da diversi codoni alla cui estremità iniziale c’è un codone di

inizio e alla fine un codone di stop. Tra queste due sezioni sono presenti dei codoni codificanti per gli

aminoacidi. Ogni gene codifica per un determinato prodotto del genotipo.

Spesso si parla di ORF, ovvero Open Reading Frame, cioè sequenza nucleotidica all’interno della quale si

ipotizza di trovare un gene poiché delimitata da un codone di inizio e uno di stop; tuttavia un gene può essere

definito tale solo se si conosce il carattere per cui codifica. Si può trovare una regione “potenziale gene”, detta

appunto ORF, di cui ancora non si conosce il carattere per la quale codifica. ORF è una definizione preliminare

a quella del gene.

1.6 La replicazione del DNA

Quando la cellula compie il ciclo vitale, deve assicurare che le cellule figlie acquisiscano lo stesso materiale

genetico della cellula madre, quindi attua la replicazione del DNA.

Il DNA è superavvolto ed è molto lungo, quindi si apre in un punto detto oriT, che apre solo la forcella

replicativa. Questo consente alla DNA polimerasi di copiare entrambi i filamenti, utilizzandone uno come

stampo e originando quello ad esso complementare.

Si parla di una replicazione semiconservativa, poiché le cellule figlie che originano avranno ciascuna un

filamento originario e uno di nuova sintesi.

La replicazione, che inizia nell’oriT avviene grazie a:

Elicasi, enzima che apre il doppio filamento per creare la forcella replicativa;

- Single-stranded binding protein, che mantengono i due filamenti aperti a livello dell’elicasi (essi

- tenderebbero a riassociarsi poiché complementari);

DNA polimerasi 3, responsabile della effettiva sintesi del neofilamento. Essa richiede due particolari

- requisiti, ovvero legge il DNA stampo solo in direzione 3’→5’ (quindi sintetizza il filamento

complementare allo stampo in direzione 5’→3’), inoltre necessita di legarsi ad un doppio filamento di

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DNA, e poiché il DNA &egr