Biotecnologie genetico-molecolari

Biotecnologie genetico-molecolari

a.a. 2018/2019

a cura di Matteo Corradi

Biotecnologie genetico-molecolari Matteo Corradi

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Biotecnologie genetico-molecolari Matteo Corradi

Sommario

1. Premessa ................................................................................................................................................................... 5

1.1 Ricombinazione genetica ............................................................................................................................... 6

1.2 Il DNA .............................................................................................................................................................. 8

1.3 L’RNA .............................................................................................................................................................. 8

1.4 Il codice genetico e degenerazione del codice ............................................................................................ 9

1.5 Il gene e l’Open Reading Frame ...................................................................................................................... 9

1.6 La replicazione del DNA ............................................................................................................................... 9

1.7 La trascrizione ............................................................................................................................................... 10

1.7.1 Il sito promotore ....................................................................................................................................... 10

1.7.2 Il Ribosomal Binding Site (RBS) ............................................................................................................. 10

1.8 Gli operoni. Esempi di operoni: l’operone ribosomiale e l’operone LAC ............................................ 11

1.9 Strategie per la regolazione della trascrizione .......................................................................................... 11

1.10 La variabilità genetica .................................................................................................................................. 12

1.10.1 La trasposizione: trasposoni semplici e complessi .......................................................................... 13

1.11 Gli enzimi di restrizione .............................................................................................................................. 14

1.12 Breve riassunto di quanto trattato fino a qui ............................................................................................ 14

2. Operare con il DNA .............................................................................................................................................. 15

2.1 Estrarre del DNA .......................................................................................................................................... 15

2.1.2 Quantificare il DNA estratto: assorbanza, effetto ipercromico e ................................................ 16

2.2 Visualizzazione del DNA estratto .............................................................................................................. 17

2.3 Quantificazione del peso molecolare del DNA estratto .......................................................................... 19

2.4 Riassunto del paragrafo precedente .......................................................................................................... 20

2.5 Il DNA plasmidico ....................................................................................................................................... 20

2.4.1 Valutazione della presenza di DNA plasmidico: denaturazione alcalina e ultracentrifugazione in

gradiente di cloruro di cesio ................................................................................................................................ 20

2.4.2 Le conformazioni del DNA plasmidico ................................................................................................ 21

2.5 Riassociazione molecolare DNA-DNA o ibridazione molecolare DNA-DNA ........................................... 29

2.5 La PCR (Polymerase Chain Reaction) ............................................................................................................ 31

2.5.1 I primer ...................................................................................................................................................... 33

2.6 Costruzione dei primer (anche di quelli per l’amplificazione inversa) ................................................ 34

2.7 Il primo impiego della PCR: la costruzione di sonde specie-specifiche ............................................... 38

2.7.1 Applicazione delle sonde specie-specifiche: reattivi e procedimento .............................................. 39

2.7.2 Le sonde specie-specifiche: riassunto di quanto fino ad ora detto e approfondimento ................. 39

2.8 I primer universali: l’identificazione di un microrganismo ed il controllo positivo ........................... 40

2.8.1 Primer universali per la RS (RSA) ......................................................................................................... 41

2.9 Il typing molecolare ...................................................................................................................................... 42

2.9.1 RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) ...................................................................... 42

2.9.2 REP PCR (Repetitive Extragenic Palindromic PCR) ........................................................................... 43

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2.10 PCR multiplex ............................................................................................................................................... 43

2.11 Ibridazione su membrana ........................................................................................................................... 44

2.11.1 Ibridazione su membrana DOT-BLOT ............................................................................................. 44

2.11.2 Ibridazione su membrana southern: localizzazione del gene a livello cromosomale o

plasmidico, determinazione del numero di copie di un gene, ribotyping .................................................... 46

2.12 PCR quantitativa (Real Time PCR -qPCR-) ................................................................................................ 48

2.12.1 Applicazione della qPCR: quantificazione in tempi utili delle cellule totali del batterio M.

morganii 50

2.13 RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) ........................................................................................................... 51

2.13.1 Applicazione della RT-PCR: quantificazione relativa dell’espressione genica del gene HDC in

M. morganii in differenti condizioni di pH ....................................................................................................... 52

3. Ingegneria genetica ............................................................................................................................................... 53

3.1 Il clonaggio molecolare ................................................................................................................................ 53

3.1.1 Componenti necessarie per la tecnica del clonaggio ........................................................................... 53

3.1.2 Tappe del clonaggio ................................................................................................................................. 53

3.1.3 I vettori di clonaggio ................................................................................................................................ 54

3.2 Il sequenziamento ........................................................................................................................................ 56

3.2.1 Il sequenziamento manuale .................................................................................................................... 56

3.2.2 Il sequenziamento automatico ............................................................................................................... 56

4. Esercizi .................................................................................................................................................................... 57

4.1 Identificazione di un gene all’interno di una sequenza .......................................................................... 57

...................................................................................................................................................................................... 58

...................................................................................................................................................................................... 58

4.2 Verifica dell’espressione di un gene .......................................................................................................... 59

4.3 Utilizzo software NCBI................................................................................................................................ 59

4.4 Possibili domande ........................................................................................................................................ 59

4.5 Schematizzazione delle risposte alle domande precedenti .................................................................... 63

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1. Premessa

Il modello per le biotecnologie microbiche è la cellula procariota. La cellula procariota ha alcune caratteristiche

specifiche:

DNA cromosomale a doppio filamento condensato in una unica

- molecola circolare, chiusa, avvolta su se stessa per inserirsi nella

cellula; tant’è che la struttura è detta “CCC”, ovvero circolare

covalentemente chiusa. Tale avvolgimento è specializzato ed è

mediato da appositi enzimi.

Il DNA cromosomale contiene tutte le informazioni necessarie,

fondamentali per la sopravvivenza della cellula;

Assenza di nucleo (il DNA è condensato in una zona nucleare);

- Assenza di tutti gli organelli tipici degli eucarioti (tutte le

- funzioni fondamentali sono svolte dalla membrana cellulare);

Aploidia, infatti è presente una sola copia di ogni filamento di

- DNA (il genoma conta da 2 a 4 milioni di paia di basi -pb-);

Presenza di plasmidi, ovvero molecole di DNA

- extracromosomale di piccole dimensioni. I plasmidi sono sempre

a doppio filamento, condensati in un’unica molecola circolare

chiusa, superavvolti.

I plasmidi presentano però due grandi differenze rispetto al DNA

cromosomale:

Non contengono geni codificanti per funzionalità fondamentali per la cellula, ma permettono lo

o svolgimento di funzioni che conferiscono alla cellula un vantaggio aggiuntivo (eg sintesi di enzimi

detossificanti, resistenza ad antibiotici);

Sono molecole MGE (Mobile Genetic Elements), poiché possono essere acquisiti o persi a seconda delle

o condizioni, questo rappresenta la spiegazione alla presenza di informazioni non fondamentali per la

cellula. Se il gene per la resistenza ad un antibiotico è presente nel DNA cromosomale il problema è

contenuto, poiché questa informazione non viene trasmessa ad altri batteri; al contrario se tale gene

è a livello del plasmide allora questo può essere trasmesso (l’impiego di batteri appartenenti a questa

casistica è bene sia evitato in ambito alimentare).

Il processo appena citato di trasferimento dei plasmidi è chiamato “trasferimento genico

orizzontale”.

I plasmidi grazie alla loro capacità di trasferirsi da una cellula all’altra vengono impiegati nel clonaggio

molecolare, al fine di trasferire determinate informazioni tra cellule.

I plasmidi sono dei repliconi, ovvero porzioni di DNA provviste della funzione genica di iniziare e completare

autonomamente la propria replicazione. I plasmidi possono dare crossing-over (ovvero lo scambio di materiale

genetico) sia tra di loro (plasmidi ricombinanti) che con il genoma della cellula ospite (episomi).

La replicazione del plasmide è indipendente dalla replicazione del DNA cromosomale, ovviamente maggiori

sono le copie di un certo plasmide, maggiore sarà l’espressione del carattere codificato da quel plasmide. La

replicazione plasmidica è comunque mediata dalla cellula poiché richiede specifiche proteine. In particolare

la replicazione del plasmide può essere stringente se è strettamente coordinata con quella del cromosoma,

oppure può essere rilassata se non è coordinata con quella del cromosoma.

Una particolare categoria di plasmidi chiamati episomi è in grado di integrarsi nel cromosoma in regioni

specifiche. Il motivo che induce certi plasmidi a compiere questa azione è sconosciuto.

L’episoma è quindi un frammento di materiale genetico che in un batterio può riprodursi autonomamente o

essere integrato nel cromosoma batterico e replicarsi con esso. Esempi di episomi sono anche il fattore F

(fertilità) di E. coli e il batteriofago λ (in quanto è in grado di replicarsi sia libero nel citoplasma dell’ospite

batterico -ciclo litico- sia inserito in un sito specifico nel cromosoma -ciclo lisogeno-). 5

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È evidente la maggiore semplicità cellulare della cellula procariota; questa caratteristica in generale porta le

cellule ad adattarsi meglio alle diverse condizioni ambientali. Si ritiene che la prima cellula vivente fosse

ancora più semplice rispetto a quella procariota.

I 3 domini cui appartengono tutti gli organismi viventi sono:

Batteri;

- Archebatteri, ovvero batteri estremofili, adattati alla sopravvivenza in ambienti estremi, come ghiacciai,

- fondali oceanici e solfatare, la cui cellula presenta condizioni di adattamento molto particolari;

Eucarioti.

-

Sia i batteri che gli archebatteri vedono una base cellulare procariotica, da questo si evince come i procarioti

siano meno evoluti ma più diffusi degli eucarioti, più evoluti ma meno diffusi.

La teoria della endosimbiosi ipotizza la formazione della cellula eucariotica come inglobamento di una cellula

procariotica in un’altra. I mitocondri sarebbero infatti derivanti da un’altra cellula (tale cellula si suppone sia

di origine batterica poiché i mitocondri presentano mRNA e DNA cromosomale autonomo identico a quello

dei batteri).

Il 16S rRNA (dove l’acronimo S è il coefficiente di sedimentazione, indice legato alla densità) è stato identificato

come orologio molecolare poiché è presente in tutti gli organismi, e il numero di variazioni della sua sequenza

è indice della misura della distanza evolutiva. I ribosomi presentano due subunità: una piccola (30S) e una

grande (50S), e il 16S rRNA è locato nella subunità piccola. Nel caso dei batteri il ribosoma è del tipo 70S,

poiché la densità totale non è data dalla somma delle densità singole delle due subunità. Negli eucarioti i

ribosomi sono del tipo 80S.

Per adattarsi all’ambiente le cellule devono cambiare le informazioni genetiche, questo avviene tramite scambi

di energia e materiale con l’esterno in funzione degli stimoli ambientali.

1.1 Ricombinazione genetica

L’evoluzione è quindi legata ai processi di ricombinazione genetica (tipici solo dei batteri, gli eucarioti

presentano il crossing-over legato alla riproduzione sessuata), che sono poi stati applicati in vitro per

migliorare i ceppi microbici. La ricombinazione è:

Unidirezionale, perché c’è sempre una cellula donatrice e una ricevente;

- Parziale, perché la cellula acquisisce poco materiale genetico;

- Occasionale, perché questi processi di variabilità possono dare sia una cellula migliorata che creare una

- condizione di svantaggio. La frequenza con cui avvengono questi processi in natura è quindi bassa, e viene

svolto solo quando la cellula si trova in condizioni di difficoltà.

I tre processi di ricombinazione genetica noti sono trasformazione, coniugazione e trasduzione:

Trasformazione, ovvero acquisizione di DNA esogeno senza contatto diretto tra cellule. Richiede da parte

- della cellula acquirente una condizione detta “stato di competenza”, consistente nell’attivazione di un

numero elevato di geni in grado di produrre proteine specifiche per l’acquisizione di DNA esogeno,

derivante da cellule lisate. Quando la cellula ricevente è in condizione critiche per la crescita allora entra

in stato di competenza ed attiva delle proteine di legame (DNA binding protein) presenti sulla superficie

cellulare che riconoscono e legano il DNA esogeno. In molti casi è attivata anche una nucleasi specifica

(nuclease), in grado di idrolizzare il doppio filamento di DNA poiché l’entrata di un singolo filamento è

più agevole (così come l’integrazione nel cromosoma). Esistono poi proteine di trasporto specifiche a

livello di membrana che consentono il passaggio dentro la cellula. Altri enzimi stabilizzanti poi

stabilizzano il DNA esogeno, infatti un eccessivo ripiegamento non favorisce un adeguato inserimento nel

DNA batterico. La proteina RecA riconosce sul DNA cromosomale la presenza di possibili zone di

inserzione del DNA esogeno eventualmente anche eliminando parte del DNA cromosomale.

In laboratorio si creano delle condizioni di crescita sfavorevoli per indurre lo stato di competenza, si

mettono poi le cellule a contatto con del DNA esogeno e si valuta se le cellule lo hanno inglobato

efficacemente; 6

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Coniugazione, ovvero trasferimento di DNA tra due cellule, una donatrice e una ricevente. Nei Gram+

- c’è la produzione di feromoni che attirano altre cellule vicine a prendere contatto, e se tale cellula donatrice

possiede un plasmide coniugativo questo genera il contatto.

Nel Gram- c’è la formazione del pilo F che forma un ponte tra le due cellule, mentre nei Gram+ vi è

contatto diretto. Quindi la coniugazione avviene sia in Gram- che in Gram+ ma con meccanismi differenti.

Nei Gram– ciò che induce la formazione del pilo F è un plasmide F che possiede unicamente