Biotecnologia delle fermentazioni alimentari

BIOTECNOLOGIE DELLE FERMENTAZIONI

La microbiologia alimentare può essere considerata una branca dell’ecologia microbica. Al fine di gestire al meglio

le condizioni di crescita e le attività metaboliche dei microrganismi per l’ottenimento di alimenti sono necessarie una

serie di informazioni inerenti a:

• l’identità tassonomica, cioè il numero delle specie e il grado di diversità biologica dei ceppi che colonizzano

l’alimento in ogni stadio del processo produttivo, dalla materia prima al prodotto finito;

• dati quantitativi che descrivono l’andamento delle popolazioni di specie e ceppi microbici durante le diverse

fasi del processo produttivo (es. fermentativo): ad esempio durante il processo per ottenere il formaggio, in

funzione dei cambiamenti delle condizioni ambientali si hanno popolazioni microbiche differenti e quindi

possono portare a caratteristiche diverse del prodotto finito;

• distribuzione spaziale delle specie microbiche nel prodotto; non si avranno le stesse specie microbiche sulla

superficie (crosta) piuttosto che all’interno (pasta) di un prodotto come il formaggio perché parametri come

umidità, ossigeno, pressione selettiva ecc. selezionano mo differenti. Si parla di popolazione quando si intende

agli individui che appartengono ad una determinata specie ad esempio una popolazione di S. thermophilus,

mentre per comunità si intende l’insieme complessivo di specie e generi diversi in un certo ambiente.

• effetto dei fattori intrinseci e di processo-conservazione che possono influenzare la crescita, la sopravvivenza

e le attività metaboliche microbiche; nella preparazione di un formaggio come l’emmental, la tecnologia di

produzione ha degli effetti rilevanti sulla formazione del prodotto, ad esempio il cambio di temperatura durante

la stagionatura interrompe lo sviluppo di batteri lattici e può portare allo sviluppo dei propionibatteri che sono

responsabili della produzione di CO e delle occhiature. Un altro esempio è la temperatura della caldaia usata

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per produrre la cagliata che può selezionare i microrganismi che si sviluppano.

La valutazione del grado di diversità biologica rimane sempre una stima della reale diversità microbica esistente

sia per la difficoltà di recuperare le specie presenti a bassa concentrazione nel campione, sia per il problema delle

specie non coltivabili.

Caratterizzazione genetica e fenotipica di microrganismi di interesse lattiero-caseario

• l’identità tassonomica e il grado di diversità biologica: l’identità tassonomica consiste nell’identificazione a

livello di genere e specie, secondo un approccio polifasico ovvero di un approccio basato su valutazioni

fenotipiche e genotipiche. La diversità biologica deve essere valutata come variabilità fenotipica tra ceppi che

appartengono alla stessa specie.

Ciò che conta non è la caratterizzazione molecolare del mo, ma ciò che esso è in grado di fare in un alimento.

Ad esempio la selezione di mo impiegati nella produzione di latti fermentati (yogurt) è fatta sulla capacità di

acidificazione in latte e di sviluppare aromi tipici del prodotto come acetaldeide.

La selezione fatta in base alla velocità di acidificazione è una selezione fenotipica, ovvero si prende il ceppo di

S. thermophilus, si inocula nel latte e si misura il pH e si quantifica, attraverso una misura continua del pH nel

tempo, la velocità di acidificazione. Mettere in correlazione le caratteristiche genetiche con il profilo fenotipico

(velocità) non è semplice, ma bisogna fare fisicamente l’analisi fenotipica. Le analisi fenotipiche sono gli studi

più complessi perché vi sono molte variabili che possono interferire sul risultato finale, mentre l’analisi di

sequenza del genoma non ha possibilità di errore sul risultato finale.

Vi è l’analisi del genotipo per identificare la specie e questa si basa su un’analisi filogenetica basata sulla

sequenza del gene 16s rRNA del ceppo isolato. È possibile individuare il genere e con un buon grado di

approssimazione la specie. Valore soglia di omologia di sequenza del gene 16s rRNA per l’attribuzione della

specie è 97%. Nel caso in cui non ci siano geni ribosomali, bisognerà utilizzare geni proteine che sono in grado

di distinguere le specie. Ma esistono delle eccezioni:

- specie diverse con elevati valori di omologia del 16s rRNA (98,3% tra S. salivarius e thermophilus): queste sono

evolutivamente troppo vicine e quindi non vi è differenza per quanto riguarda l’omologia del 16s

- le subspecie (Lactococcus lactis, subs. lactis subsp. cremoris)

- specie/genere nuovo

Sapere gestire queste informazioni significa conoscere la tassonomia delle specie che si stanno studiando. à

Per identificare i microrganismi è possibile utilizzare analisi PCR specie-specifiche disponibili in letteratura

reazione positiva alla PCR specie-specifica (identificazione) oppure assenza di segnale.

Un’altra tecnica era quella di utilizzare la valutazione del grado di omologia DNA/DNA, la quale non si utilizza più

perché è una tecnica vecchia. Questa permetteva l’identificazione a livello di specie, vi era un valore soglia per

definire due ceppi batterici come appartenenti alla stessa specie 70%. Ma potevano esserci delle eccezioni: ceppi

con caratteristiche fenotipiche uguali mostrano valori di omologia genetica. Oggi si utilizza tutto in silico, ovvero si

sequenzia il DNA dei due mo e si confrontano i DNA con un approccio bio-informatico.

Come procedere quando devo identificare un numero elevato di ceppi isolati da un determinato prodotto

lattiero-caseario?

Si possono impiegare delle tecniche molecolari basate sulla reazione a catena delle polimerasi (PCR) o su NGS come

ITS (analisi degli spaziatori ribosomali), RAPD (tecniche di finger printing che danno dei profili caratteristici del ceppo

della specie, Rep-PCR, AFLP (altre tecniche di finger printing), oppure si possono utilizzare delle tecniche come 16s

rRNA gene profiling che è un metodo tassonomico, ovvero dal DNA totale estratto dall’alimento viene trattato e si

effettua un amplificazione dei geni 16s che possono essere amplificati con un unico set di primer e questi ampliconi

vengono sequenziati, separati e questo ci da una fotografia di quante specie diverse sono presenti e in quale

abbondanze relative sono tra loro. Questo è l’approccio classico che è stato utilizzato per studiare il microbiota

commensale dell’uomo (intestinale, pelle, bocca ecc.). Un altro sviluppo di questo approccio basato sulla non

coltivabilità è quello metagenomico dove in questo caso non si passa più da uno step di amplificazione mediata

dalla PCR ma il DNA estratto viene sottoposto ad un sequenziamento totale, quindi si avrà una miscela di tutti i

genomi di tutti i mo presenti in un determinato ambiente. Questo approccio mi da delle informazioni maggiori

perché mi dice che mo è presente ed anche cosa potrebbe fare. Questi sono gli approcci che permettono di arrivare

alla caratterizzazione completa del campione alimentare. Queste sono tecniche complesse.

Spesso si procede isolando ceppi in coltura pura e quello che bisogna scoprire è quante specie sono presenti (ci

sono colori diversi che devono essere rilevati e distinti).

Si possono utilizzare approcci basati sulla PCR che Ceppi

consentono di raggruppare ceppi tra loro che Isolati

appartengono alla stessa specie. Si potrebbero in coltura

pura

avere delle situazioni in cui tutti i ceppi della

specie A vengono raggruppati e distinti dagli altri

in maniera opportuna, mentre le specie B e C 16S rRNA

rimangono in un unico gruppo quindi non si Specie D e E Specie A

Specie B e C

differenziano anche se sono distinti dagli altri e le

specie D ed E rimangono in un gruppo distinto Potere ITS (16S-23S rRNA)

di

dagli altri ma non si distinguono tra loro. Quindi si risoluzione

ha bisogno di un ulteriore approccio. Specie B Specie C Specie A

Specie D e E

Aumentando il potere di risoluzione con altri

approcci si riescono a distinguere maggiormente RAPD, rep-PCR, etc.

le specie tra di loro ed anche distinguere individui

diversi all’interno di un’unica popolazione. Specie D Specie E Specie B Specie C Specie A Specie A

La caratterizzazione genotipica ottenuta a livello di ceppo mette in evidenza una variabilità genotipica non

necessariamente corrispondente alla variabilità fisiologica e alle caratteristiche tecnologiche del ceppo.

Quindi è indispensabile una caratterizzazione fenotipica. Anche se ho associato la presenza di alcuni geni ad

alcune caratteristiche fenotipiche, ad esempio la presenza di geni che codificano per le proteasi è associata alla

capacità del mo di recuperare amminoacidi in ambienti dove sono disponibili le proteine, ma la verifica fenotipica

deve essere sempre effettuata perché non è detto che le proteasi siano presenti come geni ma non siano espresse

oppure che siano espresse ma a livelli modesti, quindi l’attività proteolitica non si vede.

L’informazione che si ottiene sempre quando si identifica un ceppo di una certa specie è il suo metabolismo

energetico primario (fermentazione omo-eterolattica). Questa informazione si può considerare acquisita

contemporaneamente all’identificazione molecolare a livello di specie. Si tratta di una caratteristica fenotipica che

ha valore tassonomico.

Inoltre si ha la caratterizzazione delle attività metaboliche di interesse tecnologico. Spesso si tratta di

caratteristiche dei singoli ceppi piuttosto che della specie. Ci sono delle caratteristiche fenotipiche che sono comuni

a tutti gli individui che appartengono ad una determinata specie.

Ad esempio tutti i ceppi di S. thermophilus fanno una fermentazione omolattica producendo acido-L-lattico ed

inoltre hanno un enzima che è l’ureasi.

Le caratteristiche fondamentali ceppo-specifiche per distinguere i ceppi in funzione delle attività metaboliche di

interesse tecnologico sono:

- metabolismo del lattosio/galattosio

- sistema proteolitico

- autolisi: capacità della cellula di lisare la parete cellulare, liberare i contenuti citoplasmatici e garantire una certa

velocità nei processi di maturazione dei prodotti lattiero-caseari (formaggi)

- produzione di aromi

- sintesi di esopolisaccaridi

- produzione di molecola ad attività antibatterica

- resistenza ai batteriofagi: ci possono essere infezioni virali, ovvero virus che infettano batteri

Metabolismo del lattosio/galattosio: bisogna misurare la velocità con cui avviene la fermentazione omolattica. Se

è una fermentazione omolattica sono coinvolti tre processi: il trasporto dello zucchero, la glicolisi e la fermentazione,

cioè il passaggio da piruvato ad acido lattico. Il lattosio è un disaccaride e quindi se si utilizza S. thermophilus o L.

delbrueckii solo una componente viene metabolizzata che è il lattosio, mentre il galattosio rimane nella matrice e

quindi bisogna selezionare dei ceppi che possono utilizzare il galattosio ed eliminarlo. In alcuni casi si preferisce

selezionare ceppi incapaci di utilizzare il lattosio come L. delbrueckii per la produzione di yogurt.

Sistema proteolitico: il microrganismo che cresce non ha bisogno solo di una fonte di C, ma necessita anche di

fonti di azoto, quindi il sistema proteolitico supporta la crescita e la divisione cellulare di questi mo, quindi questo

può interferire anche sulla velocità di acidificazione in latte. Tutto ciò che deriva dalla proteolisi e dal catabolismo

degli amminoacidi è coinvolto nella maturazione dei formaggi per opera di enzimi microbici intracellulari

(endopeptidasi). Si hanno anche degli effetti sullo sviluppo di sapori amari dovuti alla formazione di peptidi

contenenti amminoacidi idrofobici (leucina, fenilalanina e prolina).

Infine può anche determinare la formazione di peptidi bioattivi (mimano altri peptidi che hanno un’attività biologica

nel nostro organismo) a partire dall’idrolisi delle proteine del latte. Ad esempio vi sono i peptidi inibitori dell’ACE

(angiotensin converting enzyme) che è l’enzima che produce l’angiotensinogeno II che è un potente vasocostrittore

e quindi il peptide bioattivo interferisce con il controllo della pressione sanguigna dell’individuo che si alimenta con

quel tipo di prodotto fermentato.

Autolisi: ha un effetto diretti sulla maturazione dei formaggi e questa rappresenta la rottura della parete cellulare

con la liberazione delle endopeptidasi che continuano a svolgere la loro funzione anche quando il mo è morto e la

loro funzione è fondamentale per portare alla produzione degli aromi desiderati.

Produzione di aromi: dipende da quali enzimi sono contenuti in un determinato ceppo; ci sono alcuni enzimi

identificati come marker di selezione come la glutammato-deidrogenasi, transaminasi, idrossimetil-transferasi ecc.

Aromi tipici sono diacetile ed acetaldeide.

Sintesi di esopolisaccaridi: vengono prodotti da alcuni ceppi e questi aiutano a garantire dei livelli di viscosità e

cremosità anche in quei prodotti che sono stati studiati per essere privi di sostanza grassa come i prodotti light.

Hanno quindi degli effetti sulla texture dei prodotti fermentati come lo yogurt. Ad esempio si selezionano ceppi di

S. thermophilus che sono in grado di produrre esopolisaccaridi, i quali trattengono acqua e questo facilita la

formazione di una certa consistenza. Inoltre questi esopolisaccaridi non danno un apporto calorico perché non

vengono digeriti dagli enzimi dell’uomo.

Molecole con attività antibatterica: si riesce a creare un alimento che si autoprotegge dallo sviluppo di

microrganismi indesiderati come quelli alterativi o patogeni. Si tratta di molecole di sintesi proteica (batteriocine)

direttamente coinvolti nel processo di fermentazione. Rappresentano un valore aggiunto nelle caratteristiche di una

coltura starter. Questo comparto della ricerca si definisce biopreservation, il quale consiste nel selezionare qualcosa

di vivo che preserva l’alimento da contaminazioni future. Questo è un aspetto molto attuale nelle industrie,

soprattutto per quanto riguarda i prodotti freschi (non rispetto della catena del freddo ecc.). Vengono selezionate

colture di protezione che vengono aggiunte perché producono queste molecole (batteriocine) che prevengono lo

sviluppo di muffe, lieviti ecc. Importante sia in fase

produttiva di biomasse da

utilizzare come starter che in

fase di caseificazione

Resistenza dei batteriofagi: questa è la principale causa del fallimento di una produzione di biomasse. Questa è

La RESISTENZA AI

BATTERIOFAGI

importante sia in fase produttiva di biomasse da utilizzare come starter che in fase di caseificazione. In alcuni casi

In alcuni casi l’induzione di un

ciclo litico viene sfruttato per

l’induzione di un ciclo litico viene sfruttato per accelerare il processo di maturazione dei formaggi. Quindi la

accelerare il processo di

selezione sulla capacità di sensibilità e resistenza ai batteriofagi è un aspetto fondamentale per la selezione.

maturazione dei formaggi

Meccanismi di trasporto dei nutrienti

I microrganismi per poter utilizzare i nutrienti e poterli ottenere dal mezzo di coltura (ambiente) in cui si trovano,

necessitano di sistemi di trasporto in quanto le membrane cellulari sono molto selettive, a causa del doppio strato

fosfolipidico (es. zuccheri, aa o peptidi non riescono ad entrare liberamente).

Quando si parla di ingresso di zuccheri, questi sistemi di trasporto hanno un ruolo importante nei microrganismi

chemiotrotrofi che vengono impiegati nelle produzioni alimentari. Questi sono importanti perché rappresentano la

loro fonte di energia e di conseguenza l’ingresso di questi zuccheri deve essere regolato. La cellula regola i suoi

dispendi e guadagni energetici in modo molto fine. Le molecole che hanno dimensioni elevate non possono essere

trasportate, ma devono essere ridotte di dimensioni come le proteine che devono essere ridotte a peptidi o singoli

aminoacidi grazie ad enzimi proteolitici che sono a livello extracellulare e permettono di ottenere direttamente

amminoacidi se sono molto efficienti oppure peptidi che possono avere un massimo di 30-40 aminoacidi e vengono

trasportati tramite trasportatori specifici. Anche i trigliceridi devono essere idrolizzati da enzimi con attività lipolitica.

Questi sistemi di trasporto sono altamente specifici in base alla classe di composto (aa, peptidi, acidi grassi) e questi

sistemi richiedono un consumo di energia.

Uno dei sistemi più diffusi è il fosfoenolpiruvato fosfotransferasi (PEP-PTS), il quale è un sistema di trasporto dello

zucchero complesso perché coinvolge un elevato numero di attori che partecipano al trasferimento dello zucchero

dall’esterno verso l’interno della cellula.

Il lattosio entra e si lega ad un enzima (EIIBC) che lo fosforila. L’ingresso nella cellula dello zucchero tramite questo

sistema PEP-PTS rende lo zucchero immediatamente attivo ad un livello energetico alto pronto per il passaggio

all’interno della cellula. Il fosfato deriva da cessioni successive attraverso delle fosfotransferasi (EIIA-P ecc.) che

raccolgono il fosfato dal fosfoenolpiruvato, il quale è la penultima molecola della glicolisi. Questo sistema di

trasporto sacrifica quindi una molecola di fosfoenolpiruvato per utilizzare il fosfato che attraverso le 3 fosfotransferasi

viene ceduto da un enzima all’altro fino ad avere il trasferimento alla molecola di lattosio.

La molecola che da la specificità per lo zucchero trasportato è quella che si trova a livello trans-membrana e che ha

una componente che sporge dalla cellula ed è quella che interagisce con il glucosio, lattosio o altri zuccheri.

Il metabolismo energetico quindi è in qualche modo legato al sistema che trasporta lo zucchero all’interno della

cellula come si può notare nell’immagine seguente. Qui viene rappresenta la glicolisi, quindi un monosaccaride

fosforilato viene convertito in fruttosio-6-fosfato, in fruttosio-1,6-bifosfato e questo