Biotecnologia dei microorganismi - Appunti

La tecnica microscopica: conta delle cellule

La tecnica microscopica consente di effettuare la conta totale delle cellule, senza discriminare tra cellule vive e cellule morte. La determinazione del numero di cellule viene effettuata impiegando camere di conta come quella di Thoma o di Burker, che consistono in un vetrino portaoggetti nel quale è inciso un reticolo. La presenza del vetrino coprioggetto genera, in corrispondenza del reticolo, un volume definito. Il campione è indotto, per capillarità, nella camera di conta e al microscopio a contrasto di fase si effettua la conta delle cellule presenti in ogni riquadro. Dal valore ottenuto si può risalire al numero di cellule presenti nel campione (cellule/mL), moltiplicandolo per un fattore di conversione che tenga conto del volume relativo al campo di conta. Questa tecnica è applicabile alle colture di microorganismi unicellulari. La camera di conta Thoma-Zeiss ha un quadrato dalla grandezza di 0,05 mm e una distanza tra il vetrino di

conta e il vetrino coprioggetto pari 0,1mm. Con i dovuti calcoli arriviamo al volume di ogni quadrato che è pari a 1/4000 mm -> 1/4'000'000 cm. Quindi dopo aver fatto la media delle cellule contate in ogni quadratino, le moltiplichiamo per 4*10^6.

Appunti di Marco Morosetti

La TECNICA ELETTRONICA, è effettuata con l'apparecchio "couler counter", elettronico che consente di ottenere non solo conteggi accumulati in breve tempo, ma anche informazioni sulla distribuzione del volume cellulare. Il si basa sul principio che quando una cellula passa (per effetto del vuoto) attraverso un piccolo orifizio capillare, in presenza di una differenza di potenziale tra due elettrodi, si ha una variazione (incremento) di resistenza, proporzionale al numero e al volume delle cellule. Gli impulsi generati, per effetto della variazione della resistenza, sono visualizzabili in forma di segnali.

sono disponibili diverse tecniche gravimetriche, tra cui la determinazione del peso umido e secco delle cellule. La valutazione del peso umido viene effettuata pesando le cellule in una soluzione contenente acqua, mentre la valutazione del peso secco viene effettuata dopo aver essiccato le cellule per rimuovere l'acqua. Queste tecniche sono utilizzate per determinare la quantità di massa cellulare presente in un campione. La tecnica biologica, invece, viene utilizzata per la valutazione delle sole cellule vive. Questa tecnica prevede il conteggio delle cellule in una piastra di coltura mediante la procedura delle unità formanti colonia. Prima del conteggio, il campione viene diluito in una soluzione fisiologica. Dopo l'inoculo, le piastre vengono incubate a una temperatura adeguata fino alla comparsa delle colonie. È importante notare che le colonie possono originarsi da singole cellule o da più cellule aggregate, quindi lo sviluppo delle colonie viene espresso in UFC (unità formanti colonia). Tuttavia, questa tecnica presenta il vantaggio di avere tempi di risposta lunghi. Inoltre, non può essere impiegata nel caso di un terreno colturale contenente solidi sospesi. In conclusione, per valutare la massa cellulare si possono utilizzare tecniche gravimetriche come la determinazione del peso umido e secco, mentre per valutare il numero di cellule vive si può utilizzare la tecnica biologica del conteggio delle unità formanti colonia.

UMIDO si procede come la procedura• della determinazione del volume umido, in precedenza descritto, stabilendo il peso delle cellule sedimentate e impccate.

Nella valutazione del peso SECCO le cellule o il micelio relativi a• un’aliquota di brodocoltura sono raccolti per centrifugazione oltrazione. Dopo lavaggio, la biomassa è essiccata, sino a pesocostante, a temperatura compresa tra gli 80°C e i 110°C, eventualmente a pressione ridotta. Tale procedura fornisce risultati accurati ma si ha lentezza nella raccolta dei dati.

Metodi indiretti

Quando nel corso di un processo fermentativo non sia possibile determinare lo sviluppo con metodi diretti, generalmente di semplice esecuzione, si può ricorrere ai metodi indiretti, basati su parametri indirettamente correlati alla crescita cellulare.

Turbidimetria e valutazione dell’assorbanza: La valutazione

La valutazione della massa cellulare può essere effettuata tramite valutazione della torbidità. Questa procedura è basata sulla determinazione della densità ottica assorbanza (DO), tramite valutazione dell'assorbimento della coltura, a una lunghezza d'onda di 600 nm. L'assorbimento è strettamente correlato alla quantità di cellule presenti (legge di Lambert-Beer) e ha generalmente un andamento lineare. Nello studio dell'andamento dello sviluppo microbico, nel corso di un processo, può essere utile costruire curve che mettano in relazione i diversi valori di assorbanza con peso secco, a partire da diluizioni dello stesso campione.

Componenti specifiche: In alcuni casi è possibile sfruttare la spettroscopia a fluorescenza in quanto alcuni componenti presenti a livello intracellulare in concentrazione relativamente costante, se investiti da un raggio di luce a una ben determinata lunghezza d'onda, riemettono la luce assorbita a lunghezza d'onda diversa.

Anche la tecnica della fluorescenza segue la legge di Lambert-Beer. Il consumo cellulare di ATP, determinabile tramite bioluminescenza, è indipendente dallo stato di crescita. Appunti di Marco Morosetti Appunti di Marco Morosetti Appunti di Marco Morosetti Consumo di substrato e formazione di prodotto: Lo sviluppo microbico è frequentemente correlabile in modo diretto al substrato, compreso l'ossigeno per i processi aerobi, o in alcuni casi, al prodotto compresa la CO2. Tale approccio può trovare applicazione nei processi relativi alla produzione di biomasse microbiche in cui il substrato consumato viene direttamente convertito in massa cellulare. In altri casi, la formazione di prodotto associato allo sviluppo cellulare, può essere correlata alla massa cellulare. Viscosità: La viscosità può diminuire, come conseguenza della scomparsa, per effetto del metabolismo cellulare, di un ingrediente del terreno colturale. La viscositàpuò aumentare in relazione allo stesso sviluppo microbico o alla sintesi di un metabolita viscoso la cui produzione è direttamente correlata alla crescita cellulare. Altri metodi di valutazione possono essere: - CONTA TRAMITE COLORAZIONE dove il blu di metilene riesce a penetrate solamente nelle cellule non vitali. - CARBOSSIFLUORESCENZA che evidenzia solamente le cellule vitali. Nelle valutazioni della turbidità, trasmittanza e densità ottica possono essere utilizzati: - COLORIMETRO (molto poco preciso). - SPETTROFOTOMETRO (misura una labda precisa su cui valutiamo la densità ottica). - NEFELOMETRO che valuta la luce rifratta a 90° della sospensione (direttamente proporzionale alla popolazione cellulare). Modalità di crescita Parliamo dei principali sistemi di fermentazione utilizzati nei diversi sistemi nella produzione di metaboliti o biomasse. Sonoschematizzati, per facilitare la suddivisione, in due principali sistemi di fermentazione per tipo di substrato e quindi li dividiamo in terreni liquidi e solidi o semi-solidi. I liquidi sono i più di usi, i semi-solidi sono usati in parte per la produzione di enzimi (tecnologia nell'emisfero orientale per la produzione di enzimi), in fase solida invece si vede anche il processo di compostaggio, una trasformazione della sostanza organica che porta ad una stabilizzazione ed una riduzione di volumi. Sistemi di fermentazione liquidi Nella maggior parte dei casi si usano i sistemi liquidi, i quali si dividono in quelli che hanno bisogno di una fase aerobica e una fase anaerobica. In base a questa caratteristica principale possiamo classificare i sistemi di colture in diverse tipologie: - Colture sommerse o superficiali: nelle prime il microorganismo è sommerso nel liquido mentre nelle seconde si fa avvenire la crescita del microorganismo solo sulla superficie.

delbiorettore (sono dei contenitori tipo bacinelle dove la superficie esposta è rilevante rispetto al volume del terreno culturale).

Possiamo parlare di colture agitate o statiche: nelle prime ci sono dei motori che muovono degli agitatori per favorire miscelazione con l'aria e quindi con l'ossigeno, utile ad ossigenare il tutto e rendere disponibile l'ossigeno a tutto il substrato e quindi ai microorganismi che sono aerobi (motori appositi). Nelle seconde non abbiamo la movimentazione e il microorganismo è un anaerobio o se ha ossigeno consuma quello e poi non ne viene rifornito.

Sistema chiuso o sistema aperto: il primo è un processo in cui non si hanno né entrata né uscita di prodotto nel corso della fermentazione (condizione tipica della coltura batch). Nel secondo si può avere un ingresso di substrato o terreno colturale, ma non fuoriuscita di brodo di coltura (oppure sia ingresso che coltura fed-batch).

continua).uscita di substrato che di biomassa (Possiamo parlare della presenza o assenza completa dell'ossigeno in coltura: nel primo caso sarà importante la rifornitura di ossigeno per la produzione di acido acetico o citrico o di ATP con la respirazione per la produzione di biomasse. Nel secondo caso sarà utile non permettere all'ossigeno di intervenire per fermentazioni anaerobie tipici dei batteri lattici (lattica, butirrica ecc) (batteri microaerofili, che volendo metabolizzano l'ossigeno ma non a livello di quello atmosferico (1/20).

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Colture Batch

Le colture batch si dividono in molte tipologie:

Batch -> Sono sistemi di coltivazione che prevedono tutte le fasi di crescita viste precedentemente e solitamente prevedono un processo chiuso, con volume definito e un sistema limitato. Quando terminano i nutrienti, inizia la fase stazionaria con la produzione dei

metabolitisecondari.Extended Batch -> metodologia con cui si prolunga il batch• aggiungendo dei nutrienti speci ci, per esempio fonte di azoto ocarbonio in base a cosa vogliamo che produca il nostromicroorganismo. Il volume varierà perchè ci sono aggiunte di nutrientisuccessive. Si possono anche aggiungere nutrienti per far prolungarela fase stazionaria in cui si produce il nostro metabolita secondario diinteresse. Il volume è variabile ed il tempo limitato (la fase diprolungamento non può durare all’in nito).

Batch con riciclo di biomassa -> In essa il primo ciclo è identico ad un