Appunti di biotecnologia

Biotecnologie

Le biotecnologie sono fondamentali per l'innovazione nella ricerca farmacologica con modelli cellulari e animali innovativi e per l'identificazione di basi molecolari di patologie e utilizzo di nuovi principi terapeutici.

Definizione di farmaco

Un farmaco è ogni sostanza o composizione con proprietà curative o profilattiche delle malattie umane e animali, oppure ogni sostanza o composizione da somministrare all'uomo o animale allo scopo di ripristinare, correggere o modificare delle funzioni organiche. I farmaci sono suddivisi in:

• Specialità medicinali: farmaci protetti da un nome o da un brevetto di invenzione (possono essere messi in vendita solo dal proprietario);
• Generici: allo scadere del brevetto altre ditte possono mettere in vendita la stessa sostanza (se sono bio-equivalenti);
• Galenici officinali: medicinali preparati in farmacia secondo le prescrizioni della Farmacopea;
• Galenici magistrali: medicinali preparati in farmacia dietro richiesta del medico;
• Medicinali da banco (OTC): per composizione e obiettivo terapeutico sono concepiti per essere utilizzati senza intervento di un medico;
• Biosimilari: macromolecole terapeutiche generate mediante tecniche biotecnologiche che replicano molecole per le quali è scaduto il brevetto.

Molecole terapeutiche

Le molecole terapeutiche possono essere divise in:

• Piccole molecole di sintesi (farmaci convenzionali);
• Farmaci biotecnologici: macromolecole terapeutiche (proteine, acidi nucleici) che possono essere prodotte da organismi geneticamente modificati (chiamati bioreattori) o di origine estrattiva. Sono progettati con la tecnologia del DNA ricombinante;
• Terapie geniche: sfruttano virus per veicolare il materiale genetico all'interno dell'organismo.

Il primo farmaco ottenuto ingegnerizzando un sistema vivente (batterico) è stato l'insulina, approvato dalla FDA nel 1982. Ora è il metodo di sintesi preferito per numerosi farmaci perché ha un costo di produzione relativamente basso. Hanno permesso di accelerare la ricerca e hanno ampliato il numero di molecole sottoposte a screening, permettendo grandi avanzamenti scientifici. Tutto ciò anche grazie allo sviluppo della chimica combinatoriale, al sequenziamento del DNA, alla creazione di banche dati.

I farmaci biotecnologici vengono usati principalmente in endocrinologia e oncologia, ma anche per il trattamento delle infezioni. In campo neurologico sono pochissimi, perché questi farmaci non riescono a oltrepassare la barriera ematoencefalica. Nonostante tutti i progressi, il numero di nuovi farmaci messi in commercio continua a diminuire a causa di:

• Vista la saturazione del mercato, è difficile sviluppare e mettere in commercio farmaci migliori di quelli già presenti;
• Le autorità regolatorie pongono un'attenzione sempre maggiore nell'approvazione di nuovi farmaci, soprattutto se sono già presenti farmaci efficaci per quella patologia. Il rapporto rischio/beneficio viene maggiormente considerato;
• I costi delle biotecnologie sono aumentati perché si cerca di arrivare primi nell'immissione in commercio.

Quindi, per alcune patologie non sono disponibili farmaci anche se sono in corso diversi studi sperimentali (come per il morbo di Alzheimer, nonostante negli ultimi 12 anni ci siano stati più di 400 studi clinici ma solo una molecola è stata approvata).

Differenze con farmaci tradizionali

I farmaci biotecnologici agiscono su target extracellulari perché, a causa della loro struttura e dimensione, non possono attraversare la membrana cellulare. Quindi tutta la loro farmacocinetica è regolata dalle loro dimensioni elevate. Hanno molte difficoltà a uscire dal torrente circolatorio a causa delle dimensioni, quindi gran parte di essi possiede il proprio target all'interno del torrente circolatorio. Vengono metabolizzati da peptidasi e non dagli enzimi microsomiali epatici. La distribuzione a opera del circolo sanguigno e quella ad opera del sistema linfatico dipendono dalla capacità di diffusione attraverso la matrice extracellulare (ECM). Il fattore determinante è il PM: i composti a basso PM (< 1 kDa) sono assorbiti attraverso i capillari sanguigni; con l'aumento del PM il sistema linfatico diventa la principale via di assorbimento; composti ad alto PM (> 16 kDa) sono assorbiti praticamente solo dai vasi linfatici. I capillari del sistema linfatico sono caratterizzati da una maggiore permeabilità nei confronti delle macromolecole ad alto PM a causa dell'assenza di una membrana basale definita e per la presenza di ampie fessure tra le cellule endoteliali. Soprattutto a causa della bassa velocità del flusso linfatico, il processo di assorbimento tramite i vasi linfatici è lento (1-2 giorni).

I principali prodotti terapeutici biotecnologici sono anticorpi monoclonali, ormoni, citochine e fattori di regolazione, prodotti del sangue (anticoagulanti e fattori della coagulazione), vaccini (antigeni), peptidi e terapia genica. Molti agiscono modulando la risposta infiammatoria e/o immunitaria e sono molto utili per il trattamento delle patologie infiammatorie su base autoimmune e in campo oncologico.

Gli anticorpi monoclonali possono agire in due modi:

• Effetto diretto: l'anticorpo lega direttamente il proprio bersaglio (antigene), che spesso è posto sulla superficie di una cellula, e inibisce l'attività della cellula stessa;
• Effetto indiretto: l'anticorpo fa da tramite tra la cellula bersaglio e il sistema immunitario. Quindi, l'anticorpo riconosce l'antigene sulla cellula poi, tramite il frammento cristallizzabile della regione costante, recluta i granulociti, le cellule natural killer o le componenti del complemento.

Vaccini

La risposta immunitaria consiste in due tipi di immunità:

• Innato (naturale o nativo): risposta aspecifica dell'organismo che si sviluppa nei confronti di qualsiasi agente patogeno. Non conferisce un'immunità duratura;
• Acquisita: conferisce una protezione duratura e specifica nei confronti di un patogeno. È specifica perché si avvale di proteine di riconoscimento che riconoscono in maniera specifica gli antigeni. Questo meccanismo di difesa permette la formazione della memoria immunitaria, perciò richiede un maggior tempo per entrare in azione dato che devono essere identificate e prodotte grandi quantità di proteine di riconoscimento per un patogeno.

In seguito al primo contatto con un antigene, si attiva la risposta immunitaria primaria seguita da una fase di latenza durante la quale si attivano i meccanismi di difesa aspecifici. La prima esposizione al patogeno determina la produzione degli anticorpi delle classi IgM per prime poi IgG: quindi determina la formazione della memoria immunitaria e l'espansione clonale dei linfociti permette di ottenere una maggior risposta alla successiva esposizione. Infatti, quando un organismo viene esposto a un antigene verso cui ha già sviluppato degli anticorpi, si attiva la risposta secondaria che è molto più rapida e intensa.

Classi di immunoglobuline

Le classi di immunoglobuline sono:

• IgA: sono gli anticorpi presenti nelle secrezioni (saliva, lacrime...) e costituiscono una barriera che le mucose oppongono a un agente infettivo che vuole introdursi nell'organismo;
• IgG: 70-75% delle immunoglobuline presenti nel sangue e svolgono un ruolo importante nella difesa dalle infezioni;
• IgE: nel sangue sono presenti in esiguo numero, ma sono presenti anche sulla superficie dei mastociti e agiscono come recettori per gli antigeni, inducendo la liberazione di alcune sostanze che provocano reazioni allergiche. Sono quindi responsabili dell'avvio della risposta infiammatoria/allergica;
• IgM: 10% delle immunoglobuline presenti nel sangue. Sono le prime immunoglobuline che vengono prodotte in caso di infezione;
• IgD: si trovano solo sulla superficie dei linfociti B immaturi e attivano i linfociti B promuovendone la maturazione quando vengono a contatto con l'antigene per il quale sono specifiche.

Immunizzazione

L'immunizzazione può essere passiva o attiva. L'immunizzazione passiva naturale avviene mediante il trasferimento di anticorpi materni al figlio via placenta e allattamento, mentre quella artificiale si ottiene mediante somministrazione di immunoglobuline specifiche. Viene definita passiva perché il sistema immunitario non viene stimolato, ma vengono forniti anticorpi dall'esterno che aiutano l'organismo a proteggersi.

L'immunizzazione attiva si ottiene in seguito all'esposizione a un agente patogeno, e quindi a uno specifico antigene. È naturale quando l'organismo è esposto al patogeno e sviluppa un'infezione, mentre quella artificiale si ottiene tramite la somministrazione di un preparato antigenico (vaccino) che stimola la produzione di anticorpi da parte dell'organismo. Quest'ultima può essere utilizzata a scopo profilattico (vaccinazione profilattica) quando l'organismo viene esposto al preparato antigenico prima di essere esposto al patogeno stesso, oppure a scopo terapeutico (vaccinazione terapeutica) quando il preparato antigenico viene somministrato per stimolare la risposta immunitaria nei confronti del paziente che è già stato infettato dal patogeno. Quindi i vaccini stimolano il sistema immunitario a produrre una risposta che conferisce protezione contro una specifica malattia determinata da un agente patogeno. Consistono nella somministrazione di un antigene di un determinato patogeno per conferire immunità protettiva da una malattia, sfruttando la memoria immunologica (capacità del sistema immunitario di riconoscere/ricordare sostanze estranee che hanno precedentemente attaccato l'organismo e contro cui vengono prodotti anticorpi specifici). Vengono usati nelle malattie infettive, ma anche nella prevenzione dell'insorgenza di tumori. Quindi la vaccinazione è il miglior presidio per la protezione della popolazione grazie alla prevenzione dell'infezione, della trasmissione e alla riduzione dei costi. Negli ultimi anni le vaccinazioni hanno permesso la debellazione o l'attenuamento di moltissime patologie: influenza, pneumococco, difterite, tetano, pertosse, polio. Per esempio, aumentare la copertura antinfluenzale con un vaccino dà un impatto importante al numero di: persone infette, persone ospedalizzate, visite al medico generale, morti e anche al costo per la società. I vaccini però rispetto agli altri farmaci sono poco remunerativi dal punto di vista economico: fino a prima del Covid non era un campo in espansione.

Storia dei vaccini

Jenner è un medico inglese che si occupava di vaiolo, una patologia molto grave con un tasso di mortalità del 10-40% e attualmente considerata debellata da 40 anni. Osserva che le donne adibite alla mungitura delle mucche contraggono spesso una forma di vaiolo bovina, che nell'uomo induce una forma molto lieve della patologia, e risultano protette nei confronti del vaiolo umano. Nel 1796 ha quindi l'idea di somministrare all'uomo il virus del vaiolo bovino come profilattico: estrae il contenuto di una pustola di una mungitrice infetta e la inietta in un bambino di 8 anni, che sviluppa sintomi molto lievi. Successivamente, espone lo stesso bambino a un ceppo del virus umano ed esso non sviluppa la malattia. Il primo vaccino prodotto con le tecniche del DNA ricombinante è il vaccino contro l'epatite B del 1986.

Controindicazioni ed effetti collaterali

Possono esserci delle controindicazioni temporanee cioè situazioni transitorie che escludono la vaccinazione solo per il periodo di tempo in cui sono presenti: malattie acute con febbre di grado elevato, vaccini con virus vivi (come morbillo-parotite-rosolia) se nei 30 giorni precedenti è stato somministrato un altro vaccino a virus vivi e terapia in corso con farmaci che agiscono sul sistema immunitario o con cortisonici ad alte dosi.

Oppure possono esserci delle controindicazioni permanenti: in questo caso è opportuno che al soggetto non vengano somministrati vaccini quando ha manifestato gravi reazioni allo stesso vaccino in precedenza o ai suoi componenti, oppure se è affetto da alcune malattie congenite del sistema immunitario.

Possono provocare degli effetti indesiderati che nella maggior parte dei casi sono di lieve entità e durata (arrossamento e dolore al sito di iniezione, malessere generale, febbricola): sono per un certo senso voluti perché la vaccinazione per essere efficace deve indurre un parziale stato infiammatorio locale che mimi l'infezione naturale da patogeno. Solo in rarissimi casi possono essere gravi e rappresentare un pericolo per la vita (convulsioni febbrili e shock anafilattico): hanno un'incidenza di circa 1 caso/milione di dosi. Gli effetti avversi possono esser locali o sistemici, allergici o non allergici e immediati o tardivi.

Sottotipi di vaccini

I vaccini “classici” contengono il patogeno attenuato oppure inattivato, mentre tutti gli altri tipi di vaccini sono più recenti. I vettori sono virus o batteri che veicolano il gene dell'antigene del patogeno contro cui si vuole stimolare la risposta immunitaria. Nel preparato vaccinale sono presenti anche altri componenti diversi tra loro in base alla tipologia di vaccino:

• Principio attivo: antigene immunizzante;
• Liquido di sospensione: nella maggior parte dei casi è una soluzione fisiologica sterile. Può anche essere costituito da residui del sistema in cui è stato prodotto il vaccino;
• Agenti adiuvanti: componenti del preparato vaccinale che migliorano la penetrazione dell'antigene all'interno delle APC e prolungano il tempo in cui l'antigene viene rilasciato dal sito di inoculo (deve avvenire lentamente). Servono a creare uno stato di infiammazione al sito di iniezione in modo da attivare maggiormente l'infiammazione;
• Stabilizzanti;
• Conservanti.

A virus attenuato

Questo tipo di vaccini contiene il virus umano che normalmente determina la patologia, che è stato però attenuato con diversi meccanismi: passaggio in coltura, mutagenesi sito-specifica o ricombinazione. La tecnica più utilizzata prevede la crescita dei virus in colture cellulari che ne riducono la virulenza (capacità di proliferare e indurre la patologia) e che permettono di ottenere virus attenuati capaci di replicarsi, anche se con minor frequenza. Il virus viene amplificato in coltura usando linee cellulari di origine umana, successivamente viene purificato e utilizzato per infettare linee cellulari di origine non umana (generalmente di scimmia). Il virus umano per sopravvivere si deve adeguare alle cellule di scimmia, perciò subisce mutazioni e vengono generate le varianti. Le mutazioni selezionate determinano l'attenuazione del virus, che non è più in grado di infettare ad alta efficienza le cellule umane ma viene riconosciuto come non-self dal sistema immunitario.

I vaccini con virus attenuati sono molto efficienti perché stimolano molto bene la risposta immunitaria (IgG e IgA), richiedono quindi una sola dose ma hanno un certo grado di rischio perché i virus possono riacquistare virulenza. Sono scarsamente stabili a temperatura ambiente. È controindicato il loro utilizzo in pazienti immunodepressi e in gravidanza. Un esempio è il vaccino trivalente morbillo-parotite-rosolia che viene somministrato dopo circa un anno dalla nascita. Un altro esempio sono i vaccini antipolio di Sabin, che sono stati sviluppati a partire da ceppi umani. I virus venivano coltivati in condizioni sub-ottimali e veniva esaminata la virulenza nella scimmia per via intracranica, intraspinale e sottocutanea. Inoltre veniva esaminata anche la stabilità del ceppo virale reinoculandolo in altre scimmie. Il vaccino antipolio orale (OPV) include i tre ceppi attenuati di poliovirus Sabin 1, 2 e 3 (vaccino trivalente). La poliomielite post-vaccinale è causata nel 10% dei casi dal sierotipo 1, nel 45% dei casi dal sierotipo 2 e 3.

A virus inattivato

Il preparato viene biologicamente inattivato cercando di conservare al meglio il potere antigenico, quindi il virus non è in grado di replicarsi nell'uomo: è più sicuro del vaccino attenuato. La presenza di antigeni sulla superficie del virus permette comunque l'attivazione del sistema immunitario ma l'antigenicità e l'efficacia sono inferiori e spesso sono necessarie più dosi. Il virus viene inattivato con processi chimico-fisici: calore, trattamento con formaldeide, -propionolattone. Possono essere somministrati anche a pazienti immunodepressi e soggetti in gravidanza. Se l'inattivazione funziona bene non c'è alcun rischio che il virus riacquisisca virulenza. Richiedono l'uso di un adiuvante e stimolano la risposta del sistema immunitario che produce IgG.

Un esempio sono i vaccini antinfluenzali e l'antiepatite A. Il virus dell'epatite A viene inattivato mediante trattamento con formalina e richiede 2 somministrazioni a distanza di 6-12 mesi. Il virus dell'influenza viene invece coltivato su uova embrionate di pollo e vengono utilizzati i virioni per il vaccino. È consigliato per persone con più di 65 anni, per i pazienti cardiopatici e per gli immunodepressi.

A subunità

Non contengono l'intero microrganismo ma solo alcuni antigeni di superficie, quindi sono più sicuri. Gli antigeni vengono purificati a partire da colture di microrganismi oppure prodotti in ospiti eterologhi con le tecniche del DNA ricombinato. Sono meno immunogenici quindi si utilizzano gli adiuvanti per stimolare una risposta antigenica efficace.

Il primo vaccino molecolare è stato il vaccino per l'epatite B prodotto nel 1984. La sequenza genica che produce l'antigene di superficie HBsAg caratteristico dell'HBV viene introdotta in un plasmide, che a sua volta viene inserito in cellule di lievito. Queste vengono fatte crescere in bioreattori che permettono la proliferazione delle cellule e quindi l'amplificazione dell'antigene.