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VEICOLAZIONE DEI GENI
Per permettere l'esposizione in membrana del fotorecettore, è necessario introdurre nei neuroni il gene che codifica per esso (per esempio ChR2 - channel rhodopsin). Questo viene associato a un promotore, che ne regola l'espressione in cellule selezionate.
Successivamente, si inserisce il costrutto genetico (gene + promotore) in un virus adeno-associato che viene iniettato in un'area specifica del cervello del topo. Il virus entra nelle cellule mediante il processo di trasduzione e le sfrutta per l'espressione del gene che trasporta.
A questo punto i neuroni si distinguono in trasduced e in non-trasduced. Per facilitare la visualizzazione di quelli trasduced si associa al gene anche la GFP (proteina verde di fluorescenza) che funge da marker fluorescente. Il processo di INFEZIONE è diverso da quello di trasduzione perché determina una reazione immunologica. I vettori virali utilizzati sono i plasmidi.
La specificità
dei fotorecettori è modulata dal sistema Cre/loxP, che è costituito da 2 componenti: la Cre è un enzima di ricombinasi che effettua tagli, mentre il sistema loxP comprende i siti di taglio di Cre. Quando la Cre incontra i siti loxP effettua un taglio di una sequenza genica.
Il promotore specifico che precede il gene di interesse è associato a Cre. Si possono avere 2 topi transgenici, di cui uno contiene il gene per Cre regolato da un promotore specifico (l'enzima viene espresso solo in determinate popolazioni cellulari, dato che ciascun tipo di neuroni esprime marker specifici) e l'altro contiene il gene che codifica per il fotorecettore preceduto dai siti loxP.
I siti loxP sono adiacenti a un codone di stop che inibisce l'espressione del fotorecettore nel cervello. Quando i due topi vengono fatti accoppiare, si può osservare che alcune cellule presentano la Cre guidata dal promotore specifico e il fotorecettore con i siti di taglio.
(cellule Cre-positive), mentre altre cellule presentano solo il fotorecettore associato al sito di stop perché Cre non viene espressa (cellule Cre-negative). Nelle cellule Cre-positive, la Cre taglia a livello dei siti specifici e libera il segnale di stop: in questo modo, il gene che codifica per il fotorecettore viene espresso e si ottiene la proteina.
Inserendo dei siti di taglio per la Cre nel gene di interesse si ottiene lo stesso risultato: la Cre riconosce i siti di taglio e libera l'espressione del fotorecettore.
La trasduzione del virus avviene in una direzione, perciò si possono utilizzare 3 metodiche:
- Trasporto anterogrado: il virus viene iniettato nelle cellule e si inserisce nel corpo cellulare del neurone, dove effettua la trasduzione del materiale genetico. I fotorecettori vengono espressi sulla membrana cellulare a livello del corpo cellulare e vengono trasportati lungo gli assoni fino ai terminali sinaptici;
- Trasporto retrogrado: il virus viene...
iniettato ed effettua la trasduzione. I fotorecettori, però, non vengono espressi nel corpo cellulare del neurone che ha ricevuto il virus, ma vengono trasferiti ai terminali del neurone che prende contatto con il neurone trasdotto;
- Trasporto transinaptico: il neurone viene trasdotto quando viene inserito il virus e i fotorecettori vengono trasportati ai terminali sinaptici ma anche al neurone successivo. Alcuni sistemi virali permettono di effettuare più "salti" quindi di vedere il collegamento tra neuroni.
Affinché i fotorecettori siano completamente espressi servono circa 3-4 settimane.
STIMOLAZIONE LUMINOSA
Viene eseguita inserendo una fibra ottica estremamente sottile nel tessuto, che si collega a un impianto fatto sulla teca cranica del roditore. Questa canula permette l'inserimento della fibra ottica e il suo raggiungimento del punto di interesse nel cervello. La canula può essere bidirezionale per stimolare entrambi gli emisferi.
Che hanno un’attività spontanea molto elevata siccome hanno funzione di controllo della rete neurale. Si osserva che applicando una luce verde in modo continuo per 2 min l’attività neuronale viene inibita. Si usa un sistema Cre ricombinasi in un topo transgenico che esprime la Cre solo nelle cellule che esprimono la parvalbumina (interneuroni). Mediante esperimenti ex vivo si può produrre plasticità sinaptica, che permette il rimodellamento dei contatti tra i neuroni in seguito a stimoli di diversa natura. Il potenziamento della rete di contatti tra i neuroni può essere misurato mediante l’elettrofisiologia. Nell’immagine sotto si osserva una registrazione elettrofisiologica che dimostra che la plasticità sinaptica può essere raggiunta mediante la stimolazione delle cellule con un fascio luminoso che raggiunge i neuroni che esprimono le opsine. La plasticità sinaptica dipende dalla stimolazione dei recettori NMDA: in
Presenza di un antagonista di questi recettori si ottiene una diminuzione del segnale che si ottiene dall'astimolazione con la luce. Per esempio la ChR2 viene ampiamente utilizzata per ottenere delle mappe dei circuiti per osservare l'organizzazione delle cellule all'interno di aree cerebrali specifiche. La corteccia permette questo tipo di studi perché ha una struttura organizzata in layer: si può stimolare una determinata cellula e registrarne la risposta e successivamente registrare le risposte in altri layer per capire se il sito di registrazione è collegato con la cellula stimolata inizialmente. Nell'immagine si vede che stimolando un neurone che possiede il corpo cellulare nel layer 2 si registra attività neuronale anche nel layer 5. Allo stesso modo, si possono studiare anche le proiezioni da un emisfero all'altro.
Nel 2° caso la Cre è espressa solo nelle cellule che esprimono la somatostatina (interneuroni).
Gli esperimenti IN VIVO sono più complicati perché non è possibile raggiungere una sola cellula ma viene registrata l'intera rete neurale. Si inserisce la fibra ottica accoppiata a un elettrodo: la fibra stimola le cellule e l'elettrodo registra l'attività elettrica delle cellule che lo circondano. Prima della stimolazione si osserva l'attività spontanea dei neuroni, che diminuisce quando vengono stimolati e viene indotta l'inibizione. Con esperimenti in vivo si può osservare il comportamento dei modelli animali. Per esempio, stimolando le cellule presenti nella corteccia motoria il topo inizia a muoversi più rapidamente. Permettono anche l'esplorazione sociale del modello animale: si può usare un software che registra la posizione del topo in modo istantaneo e controlla l'attività del laser, perciò si può scegliere di attivare o disattivare il laser a seconda della posizione.
del topo. Se si vuole controllare l'attività di specifiche cellule, si può fare in modo che il software riconosca l'attivazione delle cellule di interesse e che decida se accendere o meno il laser in base al grado di attivazione. Permettono anche di eseguire studi di proiezione che studiano le connessioni tra neuroni più o meno distanti nel cervello tramite l'applicazione flessibile della stimolazione luminosa. Mediante uno stimolo luminoso, è possibile indurre un'eccitazione o un'inibizione delle cellule della popolazione selezionata (che hanno espresso il gene per il fotorecettore). A loro volta, queste cellule possono essere in comunicazione con popolazioni cellulari di altre regioni del cervello. Con lo stesso metodo si può controllare altri nuclei spostando la sorgente luminosa: mettendo la fibra ottica in corrispondenza di un nucleo di neuroni A al posto che del nucleo B (che ha espresso il gene per il fotorecettore), sipossono attivare o inibire esclusivamente le proiezioni che raggiungono la popolazione di neuroni A e che provengono dai neuroni B. Usando il sistema della Cre ricombinasi si può fare uno studio ancora più specifico: se Cre è presente solo in determinati neuroni della popolazione B, è possibile ottenere l'espressione specifica dei fotorecettori in una sottopopolazione. In questo modo, si registra il segnale in corrispondenza del nucleo A che proviene da un solo sottotipo di recettori B. Con tutti questi approcci è possibile descrivere in maniera sempre più specifica le proiezioni delle cellule.
Visualizzazione dei fotorecettori: A livello della corteccia prefrontale sono presenti diverse regioni (di cingolo Cg, prelimbica PL e infralimbica IL). Nell'immagine sotto sono visibili le cellule che esprimono i fotorecettori e che quindi sono fluorescenti perché viene inserito un marker fluorescente. La banda scura nella parte dx è
La congiunzione dei 2 emisferi, la porzione scura in alto a dx è la punta della fibra ottica. In questo modo si possono vedere le cellule trasdotte dal virus.
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