Appunti Biotecnologia delle fermentazioni alimentari

SDS-page e visualizzazione dell'attività enzimatica

Nell'immagine si ha un gel degli estratti totali di L. lactis trattato con SDS (nasce quindi come SDS-page). Dopodiché l'SDS viene allontanato: rinaturanado le proteine si rimettono in attività degli enzimi che erano stati "sfondati". La loro attività la si visualizza con un gel di acrilamide (perfettamente trasparente). Quando il gel è liquido si può aggiungere altro, come delle cellule e in questo caso (aggiunta di Micrococcus per definire le unità enzimatiche del lisozima) si polimerizza, ottenendo un gel opaco/torbido (in quanto pieno di cellule). A questo gel si aggiunge l'estratto proteico e le proteine si separeranno in funzione del PM. Il gel poi viene posto molte volte in tampone per rinaturare le proteine presenti e, se ci sono enzimi peptidoglicano-idrolasi, essi iniziano a mangiare le cellule, causando illimpidimento (si associa poi ogni banda ad un PM essendo che si separano in funzione di).

Quest'ultimo). Nell'immagine si ha un enzimogramma specifico per la detection del peptidoglicano-idrolasi. Per L. lactis si visualizzano due bande: per studiare il ruolo dell'enzima nella fisiologia si fa un mutante. Torbido e deposito di cellule per sedimentazione: catenelle di cocchi. Se ai ceppi si inattiva il gene che codifica per l'autolisina (nel mutante), succede che le catenelle si allungano tantissimo e la crescita è diversa, ovvero sedimentano tutte per il fatto che le catenelle sono più pesanti. Si ha quindi un effetto della peptidoglicano-idrolasi sulla dimensione delle catenelle del microrganismo. Questo può avere una rilevanza tecnologica, in quanto sedimentare molto vuol dire avere maggiore resistenza e vitalità quando viene esposto all'ossigeno. Grafico di isolazione dell'autolisi: il segnale in alto per dimensione corrisponde alla proteina che ci aspetta codificata dal gene che viene inattivato (questa proteina ha anche

un peptide leader che la veicola che viene liberato).Si ha un tempo molto ampio, ovvero fino a 80 ore (faseesponenziale molto stretta perché cresce moltovelocemente). Si ha poi riduzione della crescita. Lisando lecellule la torbidità diminuisce, quindi, la torbidità risultautile in questo caso per misurare la crescita; torbidità è indice di avvenuta autolisi. Si hanno condizionidiverse in quanto lo stesso ceppo è stato modificato mettendogli dentro geni che codificano proteasidiverse: ciò viene fatto perché la peptidoglicano-idrolasi idrolizza proteine legate alla parete ma ciòdipende dalle proteasi che ci sono appunto sulla parte stessa, ovvero alcune evidentemente fanno fuoril’autolisina (nelle linee in alto si ha elevata densità ottica; in basso invece aumenta il livello di autolisi,ovvero si ha una diminuzione della densità ottica). L’autolisi viene contrastata.Nei processi bisogna essere

Lactis si ha anche unadiversa dimensione delle catenelle, ovvero che quando l'autolisina viene eliminata completamente si hanno dellecatenelle più lunghe \ di grandi dimensioni.

Diversi ceppi di L. lactis: su ciascuna colonnina si ha lacaratterizzazione del sistema proteolitico e sull'asse Y si misural'attività dell'enzima aldolasi (enzima glicolitico). Ogni ceppoanalizzato è caratterizzato anche per la proteasi che contiene:quindi ciò che è stato detto precedentemente è vero ma infunzione del ceppo considerato (in quanto su complessi fenotipicicome l'autolisi, in cui non si ha solo un enzima specifico, non esisteun marker che si possa utilizzare per dare una risposta indiretta;l'unico modo è quello di misurare l'autolisi e, quindi, non sipossono caratterizzare i ceppi da un punto di vista genetico e avereun idea dell'autolisi (in quanto gli enzimi in gioco sono tanti ma si deve solamente

testarli; considerando un intervallo di tempo lungo e vedere cosa succede).

Al posto di misurare l'attività della proteasi misurano l'attività di un enzima glicolitico: dicono che due ceppi possono aver la stessa proteasi ma attività glicolitiche completamente diverse.

Zimogramma che mette in luce l'AcmA in L. lactis: si vede in (a) sia l'AcmA attivata (priva del peptide leader) e si vede bene anche la parte superiore che è la proteina con il suo peptide leader. Ciò è stato rilevato anche con concentrazioni saline più alte, per vedere cosa succede nel formaggio ad esempio. Con maggiore sale, l'attività diminuisce (ma comunque presente); mentre aumentando il calcio il segnale rimane costante e ben visibile, così come anche al variare del pH (con pH 5-8 e 9 l'autolisina funziona). Si tratta quindi di enzimi che mostrano attività in un range di pH e concentrazioni saline molto ampi. Nel