Biologia molecolare - corso parte 2

Approccio per letalità sintetica

Come uccidere selettivamente le cellule tumorali? Con l'approccio per letalità sintetica, l'idea fu di un genetista del lievito (lo stesso che vinse il Nobel per l'identificazione del Cdk), Leland Hartwell.

Per spiegare l'approccio utilizzato è utile fare il seguente esempio. Prendiamo una sedia: una sedia normale ha 4 gambe e sta in piedi, mentre una tumorale ha 3 gambe (1 gamba = 1 processo biochimico di riparazione).

Una cellula normale ha il NER, il mismatch repair, il proof reading e la ricombinazione, mentre quella tumorale a causa di mutazioni non ha la ricombinazione funzionante (l'enzima fa la ricombinazione ma la fa male). Le tre gambe della cellula tumorale le consentono di continuare a mutare anche se non sta benissimo.

L'ipotesi iniziale era curare la quarta gamba o farmacologicamente o ripristinando i geni malati, ma è impossibile.

La cellula tumorale con le sue tre gambe continua a evolversi.

quindi a qualcun altro è venuta un'altra idea: se uso un farmaco che bersaglia una delle altre tre gambe della cellula tumorale, per cui alla cellula manca la gambaricombinativa e inibisco anche la gamba del NER, non sta più in piede e muore. Il problema è che lo stesso farmaco che inibisce il NER in una cellula normale fa poco perché l'inibizione è transiente e la cellula normale ha comunque le altre tre gambe. [Spiegazione dello stesso concetto in un altro modo.] Poniamo di fare un viaggio e dobbiamo andare da Milano a Roma prendendo l'autostrada e in 5 ore di macchina ci siamo. Questa è la strada preferenziale, quello che succede in una cellula normale. Poi ci sono vie alternative: passare per Genova e Viareggio, ci si mette 7 ore ma a Roma ci si arriva lo stesso. Quindi ci sono diversi modi per arrivare a Roma. Queste vie rappresentano i pathways, i processi biochimici, della riparazione del DNA. Magari la cellula tumorale ha un

problema nella via principale e ci arriva per la via alternativa, per Viareggio; noi possiamo uccidere la cellula tumorale, la cui sopravvivenza dipende da arrivare a Roma, bombardando la via laterale, Viareggio, e così la cellula tumorale muore perché a Roma non ci arriva più. Alla cellula normale la bomba a Viareggio non interessa perché tanto prende l'autostrada. Quindi questa è l'idea, sviluppata grazie alla genetica del lievito. Prendiamo il caso di pazienti con tumore al seno, con una certa frequenza (non bassa: ci sono pazienti che sviluppano tumore al seno in età precoce). Essi hanno mutazioni nel sangue (ereditate) e dei geni BRCA1 e BRCA2. Angelina Jolie ha avuto un tumore dovuto alla mutazione del gene BRCA1 (BRCA=breast cancer). Queste pazienti sviluppano uno dei peggior tipi di tumori: triple negative. È un tumore per molto tempo considerato incurabile perché aggredendolo con chemioterapici la recidiva era

continua. BRCA è un fattore della ricombinazione omologa, quindi se non funziona si sviluppa un'instabilità genomica e eventi di ricombinazione frequenti anomali che causano continui riarrangiamenti, per cui le cellule prima o poi diventano tumorali. Si è scoperto un farmaco, che adesso si usa solo quando la paziente ha mutazioni nel gene BRCA, che si chiama inibitore PARP, o PARP inhibitors. PARP è un enzima che nell'uomo funziona in un processo di riparazione secondario, base-excision repair, simile al NER e al mismatch repair; è un processo secondario, ma la cellula che non può fare riparazione forzatamente deve usare questo altro sistema di riparazione che dipende da PARP, che è come la via di Viareggio. A queste donne si dà l'inibitore PARP e gli effetti sono strabilianti: le cellule tumorali che hanno l'inibitore PARP muoiono perché hanno già la mutazione BRCA e quindi non sono in grado di

arrivare aRoma.Le cellule che non hanno sviluppato tumori non hanno alcun problema perché l'inibitore PARP dà un effetto transientee non hanno il problema ricombinativo.Questo approccio si chiama di letalità sintetica: prevede che prima del trattamento la paziente abbia una consulenzagenetica, per vedere se donne nella stessa famiglia hanno avuto episodi di questo tipo in età precoce (di solito ilsegnale è l'età precoce, dopo i 50 anni sfugge un po'); se il genetista sospetta qualcosa di ereditario manda la biopsiadel tumore (e il sangue) a un centro che va a sequenziare il genoma per vedere se c'è la mutazione del gene BRCA. Se c'è la mutazione è una buona notizia perché si può usare quell'inibitore particolare, cosa che prima non si poteva fare.Dunque stiamo introducendo la nuova frontiera della farmacologia del tumore, che prevede l'uso di farmaci in combinazione con

mutazioni particolari. Ecco perché adesso l'idea, che per ora è troppo costosa, è di sequenziare il tumore e il sangue per cercare mutazioni e abbinarle a un certo farmaco: vi sono altri farmaci che funzionano con altre mutazioni. Quando abbiamo parlato della sindrome HNPCC, che causa colon cancer, è trattabile con un farmaco particolare in base al fatto che non funziona il mismatch repair. Quindi tutto questo assume una logica pensata e si cercano farmaci efficaci con una certa mutazione. Bisogna profilare geneticamente il paziente sia a livello somatico per vedere le mutazioni del tumore sia a livello genetico per vedere se la mutazione è stata ereditata. Ad esempio, nell'ovaio, uno dei tumori peggiori se non presi in tempi, ci sono frequentemente mutazioni a livello somatico del gene del BRCA, per cui le pazienti non hanno ereditato una mutazione come quelle di prima, ma la mutazione subentra a livello tumorale; anche qui si può usare ilPARC inhibitor, ed è efficace. Quindi è importante conoscere questi processi riparativi e paradossalmente quelli secondari, poco utilizzati, sono quelli da "targettare" farmacologicamente perché diventano importanti per la cellula tumorale. X: Cosa vuol dire profilare il paziente a livello genetico? R: Se fossi un oncologo con una paziente con tumore al seno in età precoce, hai due opzioni: o conosci il patrimonio della paziente o non lo conosci. Se non lo conosci classifiche il tumore come triple negative classico, si usano soliti farmaci e spesso il tumore regredisce e poi si ripresenta più aggressivo. Se invece sapesse che la paziente ha una mutazione BRCA, automaticamente farebbe una scelta terapeutica diversa usando il PARC inhibitor. Saperlo o non saperlo dipende da quanti soldi ha l'ospedale e quanto la Regione rimborsa per fare l'analisi genetica. Profilare il tumore vuol dire sequenziarne il DNA: il sequenziamento del DNA ha

dei costi, bassi in un centro no profit, ma fino a 3000 euro in un centro privato. Non tutti gli ospedali possono permetterselo e spesso il genetista non capisce che c'è ereditarietà. L'idea di profilare è di in futuro farlo per tutti i pazienti oncologici, sia per il tumore sia per il sangue, per capire se c'è una certa mutazione.

X: Va fatto sia per le cellule germinali che per quelle somatiche?

R: Se la paziente ha sviluppato un tumore in età precoce e c'è ereditarietà il sangue già dice che c'è quel problema. Idealmente bisognerebbe fare sempre entrambe le cose. Sequenziare il DNA del sangue è semplice, è più difficile per il tumore perché è eterogeneo e bisogna trovare le mutazioni comuni a tutte le cellule. Però quelli che hanno queste sindromi genetiche sono facilitati perché il sangue già lo dice.

X: I batteri estremofili resistono nelle

acque radioattive perché a differenza di noi hanno gli stessi processi riparativi del DNA ma migliori processi riparativi delle proteine?

R: Non tanto i processi riparativi ma proteggono meglio le proteine rispetto a noi.

LA METILAZIONE DEL DNA E ALTRI MECCANISMI EPIGENETICI

Il DNA

Riguardo la metilazione del DNA si era visto che essa avviene nelle nostre cellule sulle citosine in posizione 5 e, per la maggior parte dei casi, sulle citosine seguite da guanina; anche se ci sono alcune condizioni particolari in cui vi è una discreta quantità di metilazione di citosine seguite da adenine, in particolar modo nelle cellule staminali e nelle cellule neuronali.

In seguito si era trattata la sua distribuzione nel genoma. Infatti, pur essendo stata studiata prevalentemente per il suo ruolo nella regolazione dell'espressione genica – quindi sui promotori, sugli elementi regolativi, sugli enhancer ecc. – una visione più moderna, grazie alle

tecniche di sequenziamento disponibile, hapermesso di capire che la maggior parte della metilazione avviene sulle sequenze altamente ripetute, sullesequenze parassitiche, sui virus che ci hanno infettato ecc. Rimane da affrontare il meccanismo che si verifica quando il genoma viene metilato e come questa metilazione viene mantenuta durante lo sviluppo, se viene mantenuta. In genere le cellule dello stesso tipo hanno un pattern molto simile di metilazione, ad esempio gli epatociti avranno un pattern più simile tra di loro, piuttosto che essere simile a quello che hanno i neuroni. Quando viene dunque stabilito questo pattern? Nell'immagine si possono vedere una cellula uovo e una cellula spermatica; queste due cellule hanno un profilo di metilazione differente, infatti la cellula uovo è colorata pallidamente indicando che è poco metilata, mentre la cellula spermatica è molto metilata. Le due cellule si incontrano al momento della fecondazione dando origine ad unozigote che ha un contenuto di metilazione intermedio, in quanto frutto dell'unione di una cellula molto metilata come lo spermatozoo e di una cellula sostanzialmente poco metilata come l'ovocita. Dopodiché iniziano le prime divisioni durante le quali il nostro genoma va incontro ad un'onda di demetilazione, quindi una perdita di metilazione del DNA: virtualmente tutta la metilazione del genoma scompare. Quindi, durante lo sviluppo precoce le nostre cellule perdono di metilazione del DNA. Rimangono dei nuclei di metilazione, tuttavia se si usano dei metodi non troppo sensibili per vedere se il genoma è metilato o meno, ci si accorge che, una blastula, ad esempio, non è metilata. Subito dopo lo stadio della blastocisti riparte un'onda di metilazione del DNA, che viene ri-metilato, per arrivare alle nostre cellule somatiche che sono caratterizzate da un alto livello di metilazione del DNA dal momento che dal 60 al 90% - a seconda delle cellule.

– dei dinucleotidi C-G sono metilati. Dall’immagine si vede anche che il pattern di metilazione acquisito dalle cellule sarà diverso a seconda del fatto che le cellule siano destinate alla linea germinale.