Biologia molecolare - corso parte 2

Il core promoter

La trascrizione di un gene richiede la presenza di complessi multi-proteici. Nella seguente immagine si osserva un tipico complesso trascrizionale con un solo core promoter, a cui si legano l’RNA polimerasi, tutti i fattori generali della trascrizione e il mediatore, che contatta fattori trascrizionali legati a una sequenza molto distante rispetto al core promoter. Si osserva come gli elementi regolativi del promotore di classe II possano essere molto più lontani rispetto a quelli del core promoter attivo, in un range compreso tra -50 e +50 bp circa.

L’oloenzima è la forma di RNA polimerasi II eucariotica che viene reclutata sui promotori dei geni codificanti per proteine nelle cellule. Si tratta di un complesso composto da circa 70 polipeptidi (RNA polimerasi II, fattori generali della trascrizione e mediatore) e contiene l’intero set di fattori necessari per un efficiente inizio di trascrizione in risposta agli attivatori.

L’oloenzima ha le dimensioni di un ribosoma e, quindi, non può diffondere liberamente: per tale motivo possiamo ipotizzare che sia il DNA ad essere portato verso il complesso oppure che il complesso non si assembli interamente sul promotore, ma ci siano degli elementi precostituiti.

Elementi del promotore

A questo punto, è necessario trattare gli altri costituenti del promotore non descritti nelle lezioni precedenti (in cui ci siamo concentrati sul core promoter, la cui funzione è di collocare nel posto giusto il complesso di inizio, stabilendo il punto di +1 e la direzione della trascrizione, e di rispondere agli attivatori trascrizionali).

Il core promoter media la trascrizione basale che, di fatto, non richiede l’aiuto di attivatori trascrizionali oltre ai fattori generali della trascrizione. In vivo, la trascrizione basale (almeno per quanto riguarda gli eucarioti), sostanzialmente non esiste. Infatti, negli eucarioti si realizza un tale impacchettamento della struttura della cromatina che l’apparato trascrizionale non riesce a legarsi se non viene assistito ed aiutato da una serie di altri fattori trascrizionali.

Tipi di elementi del promotore

Possiamo generalmente dividere il promotore in 3 diversi tipi di elementi:

• Core promoter
• Regione regolativa a monte del core promoter
• Enhancer

Regione regolativa a monte del core promoter

Si estende approssimativamente da -50 a -600 bp. Contiene il sito di legame per diversi fattori trascrizionali. Nell’immagine ne vengono indicati 4: in verde è indicato il sito di legame per il fattore Sp1, in rosa quello per la sequenza CCAAT (non è necessario conoscere il nome di queste proteine).

Queste proteine sono attivatori trascrizionali sempre presenti nelle cellule, ma ciò non significa che il gene corrispondente sia sempre espresso, in quanto la struttura della cromatina è talmente inaccessibile che, per superarla, sono necessari diversi fattori trascrizionali.

Così come l’espressione di un gene può essere regolata (aumentata o diminuita) in funzione del tipo cellulare, delle condizioni fisiologiche, del momento di sviluppo ecc., ci sono anche elementi regolativi legati da fattori trascrizionali presenti in un certo momento, ma non in un altro.

Nella regione regolativa a monte del promotore ci sono, molto spesso, uno o più elementi regolativi per fattori trascrizionali che sono espressi costitutivamente (cioè sempre) e che, dunque, servono per aiutare la trascrizione del promotore. Poi, se il promotore è regolato, ci sono siti di legame per fattori trascrizionali presenti o attivi solo in particolari momenti.

Nell’immagine precedente è rappresentato in viola il sito di legame per un fattore trascrizionale attivo solo in presenza di vitamina D (VDRE sta per “Vitamin D Responsive Element”); in azzurro è rappresentato il sito di legame per un fattore attivo solo in presenza di vitamina A, cioè l’acido retinoico (RARE sta per “Retinoic Acid Responsive Element”).

In un promotore come quello raffigurato nell’immagine, gli elementi costitutivi (CCAAT e Sp1 nell’esempio considerato) non sono sufficienti ad attivare il promotore: è necessaria la presenza di vitamina D o di acido retinoico.

Enhancers

Può trovarsi a monte e grande distanza dal core promoter, ma potrebbe trovarsi anche a valle. Le sequenze enhancer sono sequenze regolative che aumentano di molto la trascrizione. Nel pannello b dell’immagine, in alto, è rappresentato un silencer, con azione inibitoria.

Come si dimostra il ruolo regolativo di un elemento in cis?

Considerando la regione regolativa a monte del core promoter, ci chiediamo in che modo è possibile verificare l’importanza di un certo elemento (ad esempio il VDRE nell’immagine precedente) per provocare l’attivazione del promotore in presenza di una determinata molecola (vitamina D nell’esempio considerato).

Consideriamo un ipotetico promotore in vitro: in assenza di vitamina D si riscontra attività di trascrizione (in quanto viene condotta in vitro), ma, in presenza di vitamina D, la trascrizione aumenta notevolmente; ciò significa che una regione del promotore risponde alla vitamina D e il nostro obiettivo è quello di individuarla.

Una volta individuato il core promoter dalla sequenza consensus, si riduce la lunghezza del promotore eliminandone un frammento e si verifica, in vitro, se la trascrizione è ugualmente presente nella misura precedentemente riscontrata: se l’esito è positivo, significa che la regione responsiva alla vitamina D non è stata tagliata ed è ancora presente.

A questo punto, si riduce ulteriormente la lunghezza del core promoter, finché si osserva la trascrizione basale (il core promoter è stato preservato), ma non più la risposta alla vitamina D: ciò significa che nell’ultima regione eliminata è contenuto l’elemento responsivo alla vitamina D.

Questo esperimento permette di individuare la regione necessaria per rispondere alla vitamina D, ma non ci permette di comprendere se essa è sufficiente: in questo caso bisogna effettuare un altro esperimento. Nell’immagine a sinistra, la regione contenente l’elemento responsivo alla vitamina D è approssimativamente compresa tra le due freccette racchiuse nel cerchio rosso.

Per la comprensione delle seguenti immagini in basso si consiglia di sostituire HSE (heat shock element) con un elemento responsivo alla vitamina D, in modo da mantenere una certa coerenza con gli esempi descritti precedentemente.

Consideriamo un gene che normalmente non risponde alla vitamina D, ad esempio il gene della timidina chinasi, su un promotore qualunque di un virus in cui c’è solo il core promoter (a destra nell’immagine, indicato in verde). Ora invece consideriamo la regione bluette del primo promotore (a sinistra nell’immagine), contenente tutto ciò che serve ed è sufficiente per rispondere alla vitamina D. Tagliamo l’elemento responsivo e inseriamolo nel promotore della timidina chinasi, realizzando un cosiddetto gene chimerico.

Adesso si deve verificare se il gene chimerico ottenuto è in grado di rispondere alla vitamina D: se la risposta è affermativa, significa che è stata trovata la regione necessaria e sufficiente (la minima possibile) per rispondere alla vitamina D.

La maggior parte dei geni richiede un enhancer per essere attivamente trascritta. Gli enhancers possono essere:

• Costitutivi: aumentano sempre l’espressione di un gene.
• Temporali: determinano un’intensificazione dell’espressione di un gene nel tempo.
• Spaziali: sono enhancers tessuto-specifici.

La sequenza degli enhancers non è il sito di legame per un solo fattore trascrizionale, ma per più attivatori trascrizionali, che intensificano notevolmente la trascrizione.

NOTA: quest’ultima caratteristica viene riassunta graficamente dalla seguente immagine, ma si tenga presente che generalmente gli enhancers sono molto più lontani dal core promoter rispetto a quanto è rappresentato.

Immaginiamo di effettuare nuovamente un esperimento in cui si riduce la lunghezza di un promotore, tagliandone alcune sequenze. Ipotizziamo che la sequenza sia lunga 4.000 nucleotidi, con una trascrizione uguale a 500 (Unità) a monte del sito di inizio; a -600 bp la trascrizione si riduce a 50 unità. A questo punto, ci chiediamo se la riduzione dell’attività trascrizionale sia dovuta all’eliminazione di una sequenza enhancer o di un elemento che lega un attivatore trascrizionale molto forte. Per rispondere a questa domanda si procede operativamente.

Immaginiamo un promotore con il suo core promoter e il mediatore. A monte del core promoter c’è il sito di legame per un fattore trascrizionale (ad esempio Sp1):

La superficie di Sp1 è complementare a quella del mediatore; aiuta l’RNA polimerasi a collocarsi nel posto giusto. A questo punto, ci chiediamo se, ruotando il sito di Sp1 nella direzione opposta, esso continuerà ugualmente a funzionare: La risposta è negativa: la porzione di Sp1 che si deve legare al complesso trascrizionale è orientata nella direzione sbagliata, dunque il legame non può realizzarsi e si avrà solo una trascrizione basale di fondo.

Stavolta ci chiediamo che cosa accadrebbe allontanando considerevolmente il sito di legame di Sp1 dal core promoter: anche in questo caso il legame non potrà instaurarsi, e dunque il sito di legame per il fattore trascrizionale non sarà funzionante.

Riassumendo, il sito di legame per un fattore trascrizionale non può essere ruotato né allontanato eccessivamente rispetto al core promoter.

Ciò non è valido invece per le sequenze enhancers che, per definizione, sono delle regioni di DNA che intensificano notevolmente la trascrizione e sono distanza-indipendenti, cosicché possono essere allontanate o avvicinate, mantenendo il proprio funzionamento entro certi limiti (ci sono enhancers che funzionano anche a 10.000 bp). Gli enhancers sono anche orientamento-indipendenti, funzionando all’estremità 5’ o 3’ del promotore oppure anche all’interno di sequenze introniche. Gli enhancers funzionano bene anche a distanza in quanto, come è stato anticipato precedentemente, sono siti di legame per più fattori trascrizionali:

Nell’immagine si notano un core promoter, un sito di legame per un fattore trascrizionale prossimale (tra -50 e -600 ) e una sequenza enhancer molto lontana con due siti di legame uguali al precedente (non ci sono fattori trascrizionali enhancer-specifici e altri che agiscono esclusivamente negli elementi regolativi del promotore). Girando la sequenza enhancer in una certa direzione, i fattori trascrizionali di un certo tipo non riescono più ad interagire con il mediatore, ma diventano compatibili altri fattori che fino a quel momento non stavano interagendo. A seconda dell’orientamento, ci saranno interazioni produttive per certi fattori trascrizionali e non altri. Tanti più siti di legame sono presenti sulla sequenza enhancer, tanto maggiore sarà la probabilità di ottenere interazioni produttive.

Queste interazioni sono stabili e permettono al DNA di estroflettersi, formando un’ansa che non è energeticamente favorita: per mantenerla è necessario un certo numero di interazioni, garantito proprio dall’enhancer.

X: “La sequenza di un enhancer potrebbe essere potenzialmente uguale a quella di un fattore trascrizionale?”

Prof: “Sì, ma nell’enhancer non ci sarà solo una sequenza. Nella regione regolativa magari si riscontra 1-2 volte il sito di legame per un fattore trascrizionale; in un enhancer si riscontra probabilmente un tot. volte quello stesso sito di legame, ma ci saranno anche siti di legame per altri fattori trascrizionali.”

La terminazione della trascrizione negli eucarioti

All’inizio della trascrizione, descritto nei paragrafi precedenti, segue la fase di allungamento (la coda dell’RNA polimerasi viene fosforilata e si distacca dal mediatore, perdendo l’affinità per il promotore, con conseguente rilascio e allungamento) e poi la terminazione della trascrizione.

La terminazione della trascrizione negli eucarioti è meno conosciuta: l’RNA polimerasi II non ha vere e proprie sequenze terminatrici. Infatti, la terminazione dipende dai cosiddetti processi di maturazione dell’RNA. Tutti i trascritti di classe II hanno una coda poli(A), che viene inserita nel trascritto da un enzima detto poli(A) polimerasi dopo aver incontrato una particolare sequenza di poliadenilazione sul trascritto primario: AAUAA (non è necessario memorizzarla); dopo la trascrizione di tale sequenza, l’RNA polimerasi rallenta decisamente. La sequenza di poliadenilazione viene riconosciuta da fattori associati all’RNA polimerasi che tagliano il trascritto a valle della coda di poliadenilazione: questo taglio viene effettuato da un’endonucleasi.

L’RNA polimerasi ha rallentato, ma continua a trascrivere; nel frattempo il trascritto viene degradato dall’esonucleasi finché la trascrizione si blocca. Il meccanismo di poliadenilazione è funzionale alla terminazione della trascrizione. Riassumendo: l’RNA polimerasi procede lungo il DNA e trascrive, portandosi dietro una proteina, attaccata alla sua coda, importante per riconoscere la sequenza di poliadenilazione; una volta riconosciuta questa sequenza (rappresentata in rosa nella parte inferiore dell’immagine), la proteina si sposta dall’RNA polimerasi sul trascritto a livello della sequenza di poliadenilazione. A questo punto, l’RNA polimerasi cambia conformazione e rallenta: la terminazione è ora favorita rispetto all’allungamento. Il trascritto è stato tutto sintetizzato, l’endonucleasi taglia a valle del sito di poliadenilazione e inizia la poliadenilazione (aggiunta di poli A). L’RNA polimerasi continua a trascrivere, ma un’endonucleasi inizia a degradare il trascritto fino alla terminazione della trascrizione.

NOTA: la proteina legata all’RNA polimerasi è la proteina CPSF, ma non è necessario memorizzarne il nome. Il sito di poliadenilazione non è solamente la sequenza AAUAA, ma comprende anche molte sequenze accessorie, e poco caratterizzate, che fanno sì che alcuni siti siano più efficienti di altri nel terminare la trascrizione. Da sola, la sequenza AAUAA non è sufficiente per determinare la poliadenilazione, perché ci sarebbe un’alta probabilità di trovare una sequenza di questo tipo ovunque nel genoma e quindi, di avere una terminazione dei trascritti anche dove non dovrebbe avvenire.

NOTA: non è necessario memorizzare le sequenze accessorie. Dal punto di vista scientifico, la situazione è ben più complessa di quanto rappresentato didatticamente.

I fattori trascrizionali

I fattori trascrizionali, che possono essere attivatori o repressori, hanno due caratteristiche:

• Legano il DNA in maniera sequenza-specifica.
• Regolano la trascrizione: possono attivarla o reprimerla, o fare entrambe le cose in particolari condizioni.

Ci chiediamo com’è strutturata la regione della proteina importante per legare il DNA, com’è fatta la regione della proteina importante per regolare la trascrizione e se queste regioni siano indipendenti tra loro o no. Abbiamo già la risposta al terzo interrogativo: i fattori trascrizioni sono separabili, si definiscono come proteine a domini o moduli indipendenti; ogni fattore trascrizionale ha almeno due domini, cioè due regioni necessarie e sufficienti rispettivamente per legare il DNA e per regolare la trascrizione.

I domini sono intercambiabili, possono essere paragonati ai componenti di un computer fisso: ciascuno è in grado di operare anche fuori dal proprio contesto. Ad esempio, rimuovendo il dominio di binding (legame con il DNA) da una proteina e inserendolo in un’altra proteina, quest’ultima acquisirà la capacità di legare una sequenza in funzione di quel dominio acquisito.

Consideriamo la seguente immagine: sono rappresentati 4 fattori trascrizionali diversi, ognuno dei quali ha una regione deputata al dominio di binding al DNA (in arancione), che può trovarsi in qualsiasi posizione. C’è poi un dominio di attivazione, ovvero il dominio di regolazione della trascrizione: anch’esso può trovarsi in qualunque posizione. Infine, queste regioni sono legate tra loro attraverso una proteina flessibile che realizza una connessione.

Per dimostrare che questi domini sono indipendenti tra loro si deve eseguire un esperimento. Consideriamo due proteine: una è il recettore dei glucocorticoidi, l’altra un fattore trascrizionale. Nel primo pannello dell’immagine, in posizione 421-480 c’è il dominio di binding al DNA, mentre il dominio carbossi-terminale contiene i siti di legame per il glucocorticoide. La molecola del glucocorticoide rappresenta l’effettore e pertanto, quando esso stabilisce il legame con il dominio carbossi-terminale, il dominio di binding al DNA diventa capace di legare il DNA e in questo modo si attiva il processo di trascrizione.

Il recettore del glucocorticoide è naturalmente in grado di legare tale ormone, ma come si evince dall’immagine, non può legare altri ormoni come gli estrogeni. In seguito al legame con il glucocorticoide, vengono attivati i geni contenenti un elemento responsivo ai glucocorticoidi. Analogamente, si può considerare un recettore per gli estrogeni (secondo pannello dell’immagine), che avrà, appunto, un sito di legame per gli estrogeni. Il legame con gli estrogeni attiverà naturalmente i geni contenenti un elemento responsivo per questi ormoni e non per i glucocortic...