Biologia molecolare - prima parte

Biologia molecolare

La biologia molecolare parte dalle molecole di base e ne studia la correlazione, fino a chiarire gli eventi molecolari che si verificano nelle cellule e negli stessi virus: i meccanismi molecolari possono essere delucidati grazie alle nozioni della Biologia Molecolare, ma anche della Biochimica.

Concentrazione delle macromolecole nelle cellule

La materia vivente è frutto dell’incontro di una serie di atomi che, in condizioni speciali, si organizzano a formare molecole semplici di base, che via via diventano più complesse: senza tali molecole la vita non potrebbe esistere, in quanto hanno originato:

• L’acqua - costituisce il 70% degli organismi viventi
• Le sostanze chimiche - costituiscono il 30% della materia vivente

Le macromolecole hanno in comune il fatto che derivano tutte dall’associazione di molecole più piccole con legami covalenti forti: il termine "macromolecola" è infatti associato alla dimensione della molecola, quindi un sistema estremamente “grande” nel suo piccolo.

Le cellule contengono 4 principali famiglie di piccole molecole organiche:

• Polisaccaridi composti da zuccheri
• Lipidi, Grassi e Membrane composti da acidi grassi
• Proteine composte da amminoacidi
• Acidi Nucleici composti da nucleotidi

Le macromolecole sono quindi formate a partire da una sequenza specifica di molecole di base (monomeri), che si ripetono a formare polimeri grazie alla presenza di legami covalenti, i quali si ottengono, nella maggior parte dei casi, mediante reazione di condensazione tra due monomeri, con liberazione di una molecola di acqua, e sono principalmente:

• Legame glicosidico - più zuccheri si uniscono a formare un polisaccaride
• Legame peptidico - più aminoacidi si uniscono a formare una proteina
• Legame nucleotidico - più nucleotidi si uniscono a formare un acido nucleico

La struttura di base deve assumere la corretta forma tridimensionale che le consente di poter svolgere la sua funzione specifica: le componenti di base si dispongono nello spazio in modo da garantire alla macromolecola una struttura che le consente di svolgere poi la sua funzione.

Funzioni delle subunità

1. Gli zuccheri sono le subunità (monomeri) dei polisaccaridi e rappresentano la principale fonte di energia per le cellule.
2. Gli acidi grassi sono i componenti fondamentali delle membrane cellulari.
3. Gli aminoacidi sono le subunità (monomeri) delle proteine.
4. I nucleotidi sono le subunità (monomeri) degli acidi nucleici (DNA e RNA).

I legami non covalenti sono invece responsabili della forma della macromolecola: se i legami interni alla molecola sono legami covalenti forti, la molecola deve essere necessariamente “solida”, forte nella sua struttura e quindi non facilmente degradabile. Nel caso in cui la molecola si viene a degradare, viene a mancare la sua funzione e, di conseguenza, anche tutti i parametri chimico-fisici che ne garantiscono la funzione.

La chimica degli organismi viventi

La chimica degli organismi viventi è organizzata attorno all’atomo di carbonio (C), che rappresenta oltre la metà del peso secco delle cellule. Una volta formata, la molecola di per sé non può essere funzionale, ma deve interagire con altre molecole: l’interazione molecolare è fondamentale per formare nuove molecole, le quali di conseguenza sono in grado di interagire con altre. È tutto estremamente organizzato, come in una catena di reazioni!

Se la struttura è solida, le interazioni sono dinamiche: possono innescarsi, producendo un risultato, e possono terminare; in alcuni casi, la durata di una interazione è più o meno lunga. Le interazioni deboli sono fondamentali per il funzionamento delle macromolecole biologiche:

• Nelle proteine, negli acidi nucleici e nei polisaccaridi, i monomeri sono legati tra loro tramite legami covalenti;
• Le strutture tridimensionali e i complessi sopramolecolari sono tenuti assieme da interazioni non covalenti, deboli se considerate singolarmente.

Le interazioni molecolari sono infatti garantite soprattutto dai legami deboli, i quali garantiscono proprio il modo in cui una molecola si rapporta con le altre, come ad esempio:

• Legame idrogeno - L’attrazione tra le due cariche elettriche parziali è massima quando i 3 atomi coinvolti sono allineati. Legami idrogeno importanti si formano soprattutto tra le basi azotate dei nucleotidi, a consentire l’assunzione della forma corretta tra le basi azotate del DNA. È un legame altamente dinamico, perché richiede poca energia per essere formato e per essere rotto, e consente le interazioni molecolari.
• Forze di Van der Waals - Quando due atomi non caricati vengono a trovarsi molto vicini, le loro nuvole elettroniche si influenzano a vicenda. Le variazioni casuali della posizione degli elettroni attorno al nucleo possono generare dipoli elettrici transitori che inducono dipoli elettrici transitori ed opposti nell’atomo vicino. I due dipoli si attraggono portando i due atomi ancora più vicini. Man mano che i nuclei si avvicinano, le due nubi elettroniche cominciano a respingersi fino a che si arriverà ad un punto in cui attrazione e repulsione sono esattamente bilanciate.

I legami deboli consentono le interazioni dinamiche, mentre i legami forti determinano una struttura solida e funzionante della molecola. Le interazioni non covalenti tra le biomolecole sono influenzate dalle proprietà del solvente: l’acqua esiste sia in forma polare sia in forma apolare, in base alle regioni in cui si trova, e non tutte le molecole possono interagire con essa, perché dipende dalle caratteristiche chimico-fisiche di ogni singola molecola: l’acqua crea dei compartimenti idrofili e dei compartimenti idrofobi, in modo da formare strutture in cui si dispongono molecole che possono stare a contatto con essa o meno.

Nel ghiaccio, ogni molecola di acqua forma un massimo di 4 legami H, generando un reticolo cristallino regolare (la struttura del ghiaccio è rigida proprio grazie a tale regolarità). Allo stato liquido e a temperatura ambiente, ogni molecola di acqua forma in media 3,4 legami H con altre molecole di acqua. Infatti, allo stato liquido le molecole sono in continuo movimento e quindi i legami H si formano e si rompono continuamente.

Tutto ciò genera interazioni molecolari specifiche che fanno sì che alcune funzioni avverranno sempre in ambienti idrofilici (interazioni polari) e, al contrario, altre in ambienti idrofobici (interazioni apolari).

L’acqua interagisce con tutte le macromolecole, formando legami H con i soluti carichi, in maniera elettrostatica:

• Diretta, se le molecole sono polari (composti idrofili)
• Indiretta, se le molecole sono apolari (composti idrofobici)

(tutto ciò genera 2 modi differenti ma uniti!). L’acqua scioglie i sali come il cloruro di sodio, idratando e stabilizzando gli ioni Na⁺ e Cl^-: le cariche ioniche vengono parzialmente annullate e il reticolo si indebolisce. In termini di entropia, aumenta il disordine e si ha una variazione di energia libera favorevole (ΔG = ΔH - TΔS).

I composti non polari determinano variazioni energetiche non favorevoli alla struttura dell’acqua: gli acidi grassi a lunga catena hanno catene alchiliche idrofobiche che vengono circondate da uno strato altamente ordinato di acqua. Raggruppandosi in micelle, i fosfolipidi espongono una minore superficie, per cui lo strato ordinato di acqua diminuisce.

Le macromolecole

Proteine

In natura esistono 20 aminoacidi (aa) legati tra loro in modo covalente e in sequenze lineari, a costituire le proteine. Tutti i 20 aa presenti nelle proteine hanno:

• Un gruppo carbossilico (-COOH)
• Un gruppo amminico (-NH₂)

Legati allo stesso atomo di carbonio, il carbonio α, sono denominati α-aminoacidi. A tale carbonio è poi legato un gruppo radicale R, che definisce la vera “identità” dell’aminoacido, e distingue tutti gli amminoacidi in base a struttura, dimensioni e carica.

Nella molecola dell’aminoacido sono presenti delle cariche, dal momento che è uno zwitterione: a seconda del pH della soluzione in cui si trova, si può comportare da acido e/o da base.

• Positiva (+), sul gruppo amminico
• Negativa (-), sul gruppo carbossilico

L’unico caso in cui a livello del gruppo R si trova un altro carbonio è quello della glicina, l’aminoacido più semplice. Gli aminoacidi influenzano quella che sarà la struttura e la funzione della proteina che si forma: la proteina che si ottiene è frutto della sequenza degli aminoacidi che la compongono.

I 20 aminoacidi delle proteine vengono chiamati aminoacidi “canonici”: ad ognuno è assegnata una abbreviazione a 3 lettere ed un simbolo ad 1 lettera; questi acronimi sono utilizzati nella sequenza amminoacidica della proteina (nello specifico, del DNA).

Proprietà ottiche degli aminoacidi α

Tutti gli aminoacidi hanno l’atomo di carbonio asimmetrico, legato cioè a 4 gruppi sostituenti diversi (eccetto la glicina, dove R = H, quindi ha due atomi di H uguali!). Gli aminoacidi presenti nelle proteine sono tutti L-aminoacidi (= levogiri). Nelle soluzioni acquose, gli aminoacidi sono ionizzati: quelli che hanno un solo gruppo aminico ed un solo gruppo carbossilico, sono presenti a pH fisiologico (pH 7.4) come specie completamente ionizzate, dette “zwitterioni”, e hanno carica netta pari a 0. Gli aminoacidi possono agire da acidi o da basi: quando un aminoacido (come la glicina) viene sciolto in acqua e diventa uno ione dipolare o zwitterione, può agire:

• Sia come acido donatore di protoni
• Sia come base accettore di protoni

Durante il comportamento acido-basico degli aminoacidi, se i gruppi R si dissociano in ambiente acquoso, contribuiscono alla dissociazione dell’aminoacido stesso. Le molecole che presentano questa “doppia natura” sono molecole anfotere, e sono chiamate “anfoliti”.

Classificazione degli aminoacidi

I 20 aminoacidi sono suddivisi in base alla proprietà dei gruppi R in 5 classi principali:

1. Gruppi R alifatici non polari:
   • Glicina - è l’aminoacido con la struttura più semplice e, in una proteina, lo scarso ingombro della sua catena laterale permette una grande flessibilità.
   • Alanina
   • Valina
   • Leucina
   • Isoleucina
   • Metionina - contiene nella sua catena laterale un atomo di S. Sono importanti nel promuovere interazioni idrofobiche all’interno delle proteine.
2. Gruppi R aromatici (non polari):
   • Fenilalanina
   • Tirosina - ha un gruppo ossidrilico (-OH) che può formare legami H ed agisce come gruppo funzionale importante nell’attività di alcuni enzimi.
   • Triptofano

Hanno una catena laterale aromatica, e partecipano ad interazioni idrofobiche che diventano particolarmente forti quando gli anelli aromatici sono impilati l’uno sull’altro. Tripttofano e tirosina, e in minore quantità anche la fenilalanina, assorbono la luce ultravioletta ad una specifica lunghezza d’onda: conferiscono alle proteine un caratteristico assorbimento della lunghezza d’onda di luce ad una 280 nm, una proprietà utilizzata per identificarle e quantificarle.

Legge di Lambert-Beer

Relazione empirica che correla la quantità di luce assorbita da un materiale, alla concentrazione e allo spessore del materiale stesso attraversato. Quando un fascio di luce (monocromatica) di intensità I₀ attraversa uno strato di spessore l di un mezzo, una parte di esso viene assorbita dal mezzo stesso e una parte ne viene trasmessa con intensità residua I₁. Il rapporto tra le intensità della luce trasmessa e incidente sul mezzo attraversato è espresso dalla seguente relazione:

Definita quindi la trasmittanza (T) come il rapporto I₁/I₀ e come assorbanza (A) l'opposto del logaritmo naturale della trasmittanza, la legge assume una forma ancora più semplificata:

A = ελcl

dove ελ è il coefficiente di assorbimento molare, M è la molarità della soluzione e l è il cammino geometrico. Il valore di ελ è considerato costante per una data sostanza a una data lunghezza d'onda, benché possa subire lievi variazioni con la temperatura. Inoltre, la sua costanza è garantita solo all'interno di un dato intervallo di concentrazioni, al di sopra delle quali la linearità tra assorbanza e concentrazione può essere inficiata da fenomeni chimico-fisici (ad esempio la precipitazione della specie chimica colorata).

La misura dell'assorbanza di soluzioni chimiche a lunghezze d'onda tipiche è il principio su cui si basa l'analisi per spettrofotometria, ossia una tecnica analitica, qualitativa e quantitativa che permette il riconoscimento e la quantizzazione di una sostanza in base al suo spettro di assorbimento della luce, mediante uno strumento che prende il nome di “spettrofotometro”.

Spettrofotometro

Lo spettrofotometro è uno strumento in grado di effettuare analisi quali-quantitative utilizzando una sorgente luminosa. Le onde elettromagnetiche, a seconda della frequenza e relativa lunghezza d'onda, vengono suddivise secondo il cosiddetto spettro elettromagnetico. Di queste radiazioni siamo in grado di vederne coi nostri occhi solo un ristretto campo, all'incirca tra 750 nm e 400 nm, il cosiddetto 'spettro visibile'. La luce proveniente dal sole contiene non solo frequenze del visibile ma anche altre, per esempio UV e raggi infrarossi. Quando la luce colpisce un oggetto, lo possiamo vedere di un certo colore: questo è dovuto al fatto che le componenti di quell'oggetto, o i pigmenti che lo ricoprono, sono in grado di assorbire determinate frequenze, mentre altre vengono respinte (riflesse) e giungono ai nostri occhi. Un oggetto rosso assorbirà quindi le frequenze del blu/viola e rifletterà quelle del giallo/rosso, un oggetto nero è in grado di assorbire tutte le radiazioni dello spettro visibile mentre uno bianco le riflette tutte.

Lo spettrofotometro utilizza proprio questa capacità della luce di essere assorbita, a diverse frequenze, dalle sostanze chimiche o biologiche. Lo strumento è costituito da diverse parti:

• Una sorgente di luce, generalmente nell'UV/visibile, genera la luce che viene filtrata da un monocromatore in grado di lasciar passare una singola lunghezza d'onda. Nello strumento l'impostazione della lunghezza d'onda di utilizzo viene effettuata generalmente in via digitale tramite un pannello elettronico dello strumento. Questa radiazione passa attraverso l'alloggiamento dello strumento in cui viene posto il campione, all'interno di una provetta particolare chiamata cuvetta. Le cuvette possono essere prodotte con plastiche particolari in grado di lasciar passare le radiazioni tra 300 e 1000 nm, oppure anche più costose in quarzo, che risulta trasparente alla radiazione anche nell'intervallo 200-300 nm.
• Il raggio luminoso, se di lunghezza d'onda opportuna, passando attraverso il campione sarà in parte assorbito, pertanto il raggio incidente e raggio trasmesso avranno intensità luminose differenti (ma stessa frequenza e lunghezza d'onda). Il raggio termina il suo percorso in un detector in grado di valutare l'intensità della radiazione che vi arriva. Lo strumento è in grado di determinare un parametro, l'Assorbanza, definita come: A = log (I₀/I₁) essendo I₁ e I₀ le intensità di luce trasmessa e iniziale. L'assorbanza è un numero senza unità di misura, che dunque avrà valore 0 quando I₁=I₀, avrà valore 2 quando la luce trasmessa è un centesimo della luce incidente (log[100/1]) e così via. Generalmente gli spettrofotometri più comuni riescono a leggere nel campo di assorbanze tra 0 e 2, mentre per riuscire a determinare valori maggiori di assorbanza servono strumenti molto più sensibili.

L'assorbanza segue la legge principe della spettrofotometria, la legge di Lambert e Beer secondo la quale Assorbanza e concentrazione del campione in cuvetta sono linearmente dipendenti.

A = εc l

dove c è la concentrazione molare (M) della sostanza nella cuvetta, l la lunghezza della cuvetta in cm, e ε il coefficiente di estinzione molare (espresso quindi in M^-1 cm^-1), una costante caratteristica per ogni sostanza (varia a seconda della lunghezza d'onda incidente e indica la capacità di quella sostanza di assorbire quella radiazione) e l il cammino ottico, cioè la lunghezza della cuvetta in cm. Generalmente questa è standardizzata in 1 cm per lato, pertanto può essere trascurata nella formula. Parte della componente luminosa potrebbe essere bloccata o dispersa in ogni caso anche dalla cuvetta vuota o dal solvente utilizzato, pertanto lo strumento viene in genere tarato a zero di assorbanza (questo è chiamato 'fare il bianco') mediante un apposito pulsante lasciando all'interno dello strumento la cuvetta vuota o la cuvetta con il solo solvente.

Molti spettrofotometri sono impostabili su una lunghezza d'onda per volta ed effettuano letture singole di assorbanza.