Biologia molecolare - parte 2

La proteina TBP e il suo ruolo nell'inizio della trascrizione

TAT. Una volta legato TFIID, seguono nell'ordine TFIIA e TFIIB. La proteina TBP è uno dei componenti più importanti dell'apparato di inizio della trascrizione. TBP (TATA Binding Protein, 30kD) è in grado di legare il DNA in corrispondenza della sequenza TATA. A differenza della maggior parte delle proteine, si va a legare al DNA in corrispondenza del solco minore.

La proteina TBP ha questa struttura tridimensionale, è rappresentata da un foglietto due α – eliche nella porzione superiore. Il foglietto beta è dominio della proteina che va a legare il DNA in corrispondenza della sequenza TATA. Le α – eliche, invece, rappresentano i siti attraverso i quali la proteina riconosce e lega le TAF.

TBP si lega alla sequenza TATA interagendo con il solco minore dell'elica. L'interazione è mediata inizialmente da due regioni della proteina, si trovano ai limiti del foglietto β che contengono due fenilalanine.

fenilalanine vanno stabilire delle interazioni con le basi, questo legame fa sì che il trattodi DNA venga distorto e si pieghi circa 80°. La specificità del legame di questa proteina con quella regione di DNA è mediata dal fatto che la sequenza ricca di T e A, ha una particolare propensione a piegarsi e quindi piegandosi, la curvatura ha come conseguenza l'appiattimento del solco minore. Questa è una distorsione che permette poi la formazione di tutta una serie di legami idrogeno tra aminoacidi che si trovano nel foglietto beta e le basi della sequenza TATA. Questa curvatura è particolarmente importante, perché nelle fasi successive permetterà proprio al DNA di avvolgersi intorno all'RNA polimerasi quando si legherà al complesso. Per la polimerasi I e per la polimerasi III, la proteina di TBP partecipa all'interazione con la polimerasi. Soltanto nel caso del TFIID, TBP riconosce la sequenza e promuovere la formazione di

Una curva nel DNA, che sarà poi indispensabile per il legame della polimerasi II. Quindi, nei primi due casi, nelle prime due polimerasi uno e tre, non c'è un elemento TATA di sequenza al quale la proteina si possa andare a legare e, diciamo, quindi la sua attività è mediata da interazioni proteina-proteina. Solo dopo il legame di TFIID, TFIIB si lega alla sequenza BRE. TFIIB si può legare solo sul DNA che è stato piegato dall'azione della TBP, questo va a costituire un legame asimmetrico della proteina TFIIB e l'RNA polimerasi che si legherà successivamente, andrà a riconoscere proprio questo complesso asimmetrico, questo sarà importante per garantire la direzionalità della trascrizione. Quindi, l'RNA polimerasi sarà in grado di riconoscere su quale dei due filamenti può iniziare la trascrizione. TFIIA ha la funzione di stabilizzare il complesso.

può andare a legare la polimerasi. La polimerasi arriva sul complesso insieme a TFIIF. Non è del tutto chiaro se si legano separatamente o se formano già un complesso. In ogni caso si vanno a legare riconoscendo TFIIB, quindi la struttura ripiegata del DNA e una volta associata, si va a disporre in modo corretto rispetto al nucleotide +1. Successivamente entrano gli altri due fattori, cioè TFIIE e TFIIH. TFIIH ha alcune attività enzimatiche che sono importanti per garantire poi il passaggio dalla fase di inizio alla fase di allungamento. TFIIH è costituita da diverse subunità che hanno attività enzimatiche diverse, c'è una subunità della proteina che ha un'attività ATPasica ed elicasica; quindi, è promuovere l'apertura grazie all'attività ATPasicadipendente, del doppio filamento e quindi la formazione della bolla di trascrizione, mentre un'altra subunità ha un'attività.

chinasica, cioè in grado di trasferire dei gruppi fosfato a particolari aminoacidi. L'RNA polimerasi II è l'unica che presenta sulla subunità RBPI presenta una coda carbossi terminale della quale sono presenti una serie di ripetizioni di una stessa sequenza di amminoacidi, e alcuni di questi amminoacidi sono dei bersagli di fosforilazione. La fosforilazione di questi aminoacidi è uno degli eventi essenziali, perché permette di passare dalla fase di inizio alla fase di allungamento della trascrizione. Dall'analisi in microscopia elettronica e dall'analisi del complesso formato tra il fattore TFIIB e la polimerasi stessa, che è proprio il TFIIB, attraverso una sua regione che si trova nel dominio N-terminale, prende contatto diretto con il sito attivo dell'enzima, è un loop che viene nominato dito B, che si estende all'interno del sito catalitico andandosi a trovare proprio nella regione dove

siviene a formare l'ibrido dell'ibrido tra RNA e DNA, quindi durante la trascrizione, la sintesi della RNA inizia e man mano che procede deve spostare questa regione del TFIIB dal sito catalitico. Quindi diciamo che avvengono una serie di tentativi di sintesi, delle sintesi abortive e soltanto quando il filamento di DNA si allunga di più di alcuni nucleotidi, quindi, può avvenire il cambiamento conformazionale che sposta il dito B dal sito dell'enzima, si passa poi alla trascrizione vera e propria. 235 Il sito attivo del RNA polimerasi. Azzurro abbiamo il DNA stampo, in rosso il filamento di DNA in via di sintesi, in arancione e in blu sono la molecola del nucleotide entrante che può occupare due siti diversi: il sito E che corrisponde alla struttura in blu del nucleotide entrante, rappresenta la posizione del nucleotide nel momento in cui si avvicina al sito catalitico, è necessario poi lo spostamento che lo porta appunto ad assumere la posizione cheevidenziata invece con la struttura arancione, in cui si vengono a formare dei legami soprattutto con alcuni siti dell'enzima che permettono il posizionamento corretto perché possa venire la formazione del legame. Particolarmente importante nella struttura è l'alfa elica in verde, che fa da ponte appunto tra le due subunità del sito catalitico dell'RNA polimerasi. Qui si vedono ingrandite le interazioni che permettono il legame del nucleotide corretto all'interno del sito catalitico dell'enzima. È stata identificata appunto una in un'alfa elica dell'enzima una regione che viene definita trigger loop, in cui è fondamentale la presenza di un residuo di istidina e di un residuo di lisina, insieme anche ad altri residui. In questo caso il nucleotide si è già spostato dal sito A il nucleotide si è già spostato nel sito A può formare i legami complementari con il stampo, quindi soltanto quando il nucleotide,

quello corretto allo stampo, sono possibili una serie di interazioni, si formano delle interazioni di impilamento con i nucleotidi il nucleotide precedente; quindi, con la base del del nucleotide già inserito nella catena di RNA. Le interazioni porteranno il nucleotide entrante ad avvicinarsi alla giusta distanza rispetto al 3' - OH del nucleotide già inserito e che dovrà andare a formare il legame fosfodiesterico, il legame con questa con questi aminoacidi mette il nucleotide nella posizione corretta in modo da promuovere l'attacco nucleofilo da parte del 3' - OH nucleotide precedente già inserito e poi il rilascio del pirofosfato. Sono importanti anche questi due residui di arginina che fanno parte del sito catalitico dell'enzima e due atomi di magnesio. 236 I fattori di trascrizione che formano l'apparato basale sono sufficienti per garantire l'inizio della trascrizione in vitro. In realtà in vivo sono necessarie

Il testo parla delle proteine regolatrici, in particolare di un complesso molto grande chiamato complesso mediatore. Questo complesso si lega all'RNA polimerasi e facilita il contatto con altre proteine che si legano ad altre regioni e influenzano l'interazione con l'RNA polimerasi. Il complesso mediatore sembra essere necessario per la maggior parte dei promotori studiati finora e viene considerato parte dell'apparato basale. È costituito da più di 20 subunità. Alcune delle subunità sono simili tra il mediatore del lievito e quello umano, ma è possibile che la composizione del complesso vari per promotori diversi, quindi potrebbe non essere sempre costituito dalle stesse proteine, ma potrebbe variare a seconda del tipo di promotore che riconosce. Tornando all'RNA polimerasi, quindi alla fase di passaggio dalla formazione del complesso all'allungamento,

La coda del C-terminale dellasubunità I dell'RNA polimerasi subisce la fosforilazione di alcuni deiresidui presenti sulle ripetizioni eptameriche, ciascun enzima è in grado di fosforilare uno specifico residuosu tutte le ripetizioni.

La fosforilazione di questi residui contribuiscono a dare l'avvio all'allungamento e permettono ilreclutamento dei fattori di allungamento, quindi avviene uno scambio tra i fattori di inizio che erano legatie che si dissociano, e dei fattori di allungamento che si associano all'RNA polimerasi in movimento.

Tra questi TFIIS è un'importante fattore di allungamento che è in grado di favorire proprio l'allungamentoimpedendo l'RNA polimerasi di rallentare in corrispondenza di particolari sequenze, inoltre contribuisceanche l'attività di correzione nel caso in cui venissero incorporati dei nucleotidi errati da parte dell'RNApolimerasi.

quindi è in grado di stimolare un'attività RNAsica che permette all'RNA polimerasi di tornare indietro e tagliare l'ultimo nucleotide inserito se questo non è corretto.
Queste ripetizioni di 7 amminoacidi che possono essere fosforilati, subiscono, durante la fase di allungamento, una serie di fosforilazioni e defosforilazioni; quindi, è un continuo cambiamento del pattern di fosforilazione.
Il cambiamento dello stato di fosforilazione della coda è particolarmente importante, perché di volta in volta permette il reclutamento di proteine che devono intervenire nei processi di maturazione dell'mRNA.
LA MATURAZIONE DE