Biologia molecolare - parte 2

Il legame del DNA e la replicazione cellulare

La DNA per legarsi ai suoi siti di legame sull'origine deve essere associata all'ATP; quindi, anche se la quantità totale di DNA all'interno della cellula è costante, quello che varia è la quantità di DNA associata all'ATP. Quindi quello che si è visto è che prima dell'inizio della replicazione la quantità di ATP è molto elevata e questa è la forma di DNA attiva per l'inizio della replicazione, subito dopo l'inizio l'ATP viene idrolizzato; quindi, si accumula nella cellula una forma di DNA legata all'ADP, che in questo stato è in una forma inattiva.

La proteina DNA rimane in questa sua forma attiva fino a quando non è avvenuta la divisione cellulare, questo perché lo scambio dell'nucleotide ADP con una nuova molecola di ATP dipende da un fattore ADP-releasing factor, cioè un fattore che promuove il rilascio dell'ADP la cui attività è direttamente dipendente dal passaggio attraverso la divisione cellulare. La proteina DnaA rimane inattiva durante questo periodo, che viene detto periodo di eclisse, durante il quale quindi non si possono verificare dei nuovi eventi di inizio della replicazione.

Meccanismi di regolazione

Questo periodo di eclisse in realtà viene mantenuto anche da altri meccanismi. Questo perché la quantità di proteina DnaA presente all'interno della cellula è maggiore rispetto alla quantità che si può legare in corrispondenza del sito di origine, di conseguenza anche se le copie di DNA che sono state occupate ad innescare un evento di inizio sono momentaneamente inattivate, ce ne potrebbero essere altre all'interno della cellula disponibili ad andarsi a legare. Quindi il periodo di eclissi deve essere regolato anche in altro modo.

Uno dei modi che è stato scoperto si basa sul fatto che oltre alle sequenze presenti all'interno oriC, sequenze in grado di legare la proteina di DnaA, ne esistono altre per le quali la proteina ha un'affinità minore; quindi, normalmente che si va a legare a oriC, ma le copie in più di DNA possono anche andarsi a legare a questi siti. La posizione di queste sequenze sul cromosoma si trova vicina a oriC, questo vuol dire che una volta che si è formata la forca di replicazione, duplicano proprio queste regioni e dopo breve tempo dall'inizio della duplicazione si trovano ad essere raddoppiati; quindi, aumenta il numero di siti che sono in grado di legare DnaA.

Il ruolo delle sequenze GATC

Il secondo meccanismo è legato alla presenza delle sequenze GATC, erano presenti circa 14 copie nelle 245 coppie di basi che compongono oriC. Nel DNA possono essere presenti alcuni nucleotidi modificati. Quelli più abbondanti sono dei nucleotidi metilati, cioè l'adenina metilata sull'azoto legato alla posizione 6, quindi si parla di 6-metiladenina, e la citosina metilata alla posizione 5 del carbonio dell'anello pirimidinico, quindi 5-metilcitosina.

Sono presenti all'interno del DNA e sono delle modificazioni post sintetiche, queste basi vengono metilate e si trovano già all'interno del DNA, quindi non vengono incorporati dalla polimerasi. Questa metilazione non avviene a caso, ma avviene quando le due basi si trovano all'interno di particolari sequenze che vengono riconosciute da enzimi specifici e questi enzimi sono in grado di aggiungere il gruppo metilico.

Il processo di metilazione

Per quello che riguarda la replicazione concentriamoci sulla metilazione dell'adenina. La metilazione dell'adenina può avvenire all'interno di diversi tipi di sequenza, una di queste sequenze è proprio la sequenza GATC. Le sequenze GATC all'interno del cromosoma vengono riconosciute dall'enzima Dam metilasi, che è in grado di metilare il residuo di adenina.

Immaginiamo di trovarci nella situazione indicata nel rettangolo a sinistra, in cui abbiamo il DNA metilato, questa è una modifica post sintetica, quindi avviene dopo che gli è stato sintetizzato, questo vuol dire che se quella sequenza metilata viene replicata, si troverà per un certo lasso di tempo in uno stato emimetilato, perché la DNA polimerasi non è in grado di incorporare nucleotidi che siano già metilati. La DNA polimerasi copia il filamento complementare e in un momento successivo interverrà la Dam metilasi per rimetilare questi siti che sono emimetilati.

Il ritardo nella metilazione di oriC

In corrispondenza di oriC, ci sono 14 sequenze GATC, quindi queste sequenze una volta iniziato il ciclo di replicazione diventano tutte emimetilate. Quello che si è notato con degli esperimenti è che mentre tutte le sequenze GATC presenti nel resto del cromosoma vengono rimetilate nel giro di poco tempo, le sequenze che sono in corrispondenza di oriC vengono metilate con ritardo rispetto a tutte le altre, cioè dopo 10 minuti. Si è arrivati a scoprire che oriC rimane emimetilato per circa 10 minuti, quando si trova nello stato emimetilato non è attivo per l'inizio della replicazione.

L'oriC emimetilato è stato ritrovato associato alla membrana, in particolare si è visto che una proteina di membrana, che è stata chiamata SeqA, è in grado proprio di legare i siti emimetilati, di conseguenza non sono disponibili per un nuovo evento di inizio della replicazione. Questo spiega anche perché non vengono metilati, perché associati a questa proteina SeqA e quindi alla membrana, quindi non sono disponibili né per un eventuale nuovo inizio, né per la metilasi che dovrebbe metilare il nuovo filamento. Solo un certo punto c'è un segnale che permette la dissociazione di questa regione del DNA dalla proteina SeqA, quindi quando si dissocia da SeqA la metilasi può intervenire per rimetilare l'altro filamento e la DnaA può andarsi a legare per innescare un nuovo inizio di replicazione.

Scambio di ADP con ATP

Vediamo due immagini tratte da un articolo molto recente, in cui invece viene spiegato come avviene questo scambio dell'ADP con l'ATP che sarà il segnale definitivo per un nuovo inizio di replicazione. Sono immagini tratte da un articolo del 2019, pubblicato sulla rivista nucleic acid Research, danno una visione un po' più aggiornata, dove abbiamo la rappresentazione di oriC, dove abbiamo sempre le tre sequenze L, M e R, che sono definite DUE, duplex unwinding element, cioè sono delle regioni ricche di A-T.

L'altra regione è denominata DnaA Oligomerization Region, DOR; nell'altra immagine i siti di legame erano riportati in 5 copie, qui invece vedete che sono di più, perché alcune di queste si discostano dalla sequenza di prima, si discostano anche per la differenza di un solo nucleotide. Tuttavia, la proteina riesce a legarsi lo stesso anche se con un'affinità leggermente minore. La direzione delle frecce indica la direzione della sequenza sul filamento di DNA, che determina in quale direzione si legherà la proteina.

Nell'immagine si vede un modello di come la proteina si leghi su tutte queste regioni e porti quindi alla formazione dell'apertura del doppio filamento. Interviene anche un'altra proteina che si chiama IHF, che vedete che si lega alla sequenza su oriC ed è una proteina che è in grado di piegare il DNA che fa sì che le proteine DnaA che si sono legate alle sequenze possano contemporaneamente anche legarsi al DNA che si sta separando.

Il sistema ADP-releasing factor

Le sequenze riconosciute da DnaA possono essere divise in due blocchi a seconda della direzione della freccia; quindi, della direzione in cui viene è disposta la sequenza sul DNA. Prima abbiamo parlato di un sistema chiamato ADP-releasing factor, la maggior parte dei casi le proteine che legano l'ATP, poi l'ATP viene idrolizzato, necessitano di fattori che nella maggior parte dei casi sono dei fattori proteici che permettono il rilascio dell'ADP e nuovamente il legame dell'ATP. Nel caso del DNA si è scoperto che non è così.

Si è scoperto che esistono delle sequenze che sono definite DARS: DnaA Reactivating Sequences, ne esistono due sono dette DARS I e DARS II. Queste sequenze DARS sono costituite da tre ripetizioni delle stesse sequenze di 9 nucleotidi che si trovano in oriC. Mentre nel caso precedente i due blocchi permettevano alla proteina DnaA di legarsi andando sempre nella stessa direzione, in questo caso la proteina si lega in modo diverso, con due facce che si fronteggiano. Proprio questo legame delle prime due coppie, questa diciamo conformazione che viene chiamata head to head che fa sì che le due proteine subiscano un cambiamento conformazionale che porta al rilascio dell'ADP. Una volta rilasciato l'ADP, siccome l'ATP è molto più abbondante all'interno della cellula, l'ATP si va a legare alla proteina.

Proteine regolatrici

Questo è un caso in cui lo scambio tra ADP e ATP non è mediato da un'altra proteina, ma è immediato dal legame ad una sequenza di DNA. Ci sono comunque altre proteine che intervengono, sono due proteine che si chiamano IHF e Fis che vanno a regolare questo meccanismo temporalmente, quindi determinano il momento esatto in cui DnaA può andare a legarsi a quelle sequenze perché si associano anch'essi a queste sequenze, quindi lo fanno solo in un determinato momento del ciclo cellulare.

Le forche di replicazione

In corrispondenza dell'origine i filamenti si aprono, si assemblano con tutti gli enzimi che partecipano alla replicazione, le forche di replicazione si muovono bidirezionalmente, sono due forche una direzione e nell'altra. Queste due forche si incontreranno esattamente nella posizione opposta rispetto all'origine sul cromosoma di Escherichia coli e lì si verificherà la terminazione della replicazione. Sono state studiate le regioni corrispondenti a questo punto e sono state individuate anche delle sequenze che sono importanti per la terminazione, c'è la forca di replicazione 1 che va a fermarsi in corrispondenza delle tre sequenze dette terE, D, A, che si trovano oltre il punto centrale dove le due forche si potrebbero incontrare, quindi quelle sequenze determinano la terminazione della forca numero 1, mentre la forca numero 2 termina in corrispondenza delle sequenze terC, B.

A queste sequenze si vanno a legare alcune proteine, una delle proteine che vanno a partecipare alla terminazione è una proteina che si chiama Tus, che si va a legare a queste sequenze ter. Ha una struttura concava, per cui si lega in modo asimmetrico e riesce in questo modo a bloccare la replicazione che proviene da una direzione, quindi blocca l'avanzamento dell'elicasi quindi blocca la replicazione.

Questo processo di terminazione non è stato ancora del tutto chiarito. Un aspetto che invece è noto è il fatto che alla fine di tutto il processo della duplicazione i due cromosomi si trovano tra loro concatenati, quindi è necessario l'intervento di una topoisomerasi di tipo II, la topoisomerasi IV, che interverrà tagliando uno dei due cromosomi, e lasciando passare un cromosoma attraverso l'interruzione prodotta nell'altro e quindi così si la separazione tra i due cromosomi.

Relazione tra replicazione e ciclo cellulare

Vediamo che relazione c'è tra la replicazione e il ciclo cellulare dei batteri. La velocità a cui viaggiano le forche di replicazione è circa 50.000 paia di basi al minuto. Data la lunghezza del cromosoma il tempo per la replicazione è circa 40 minuti. Terminata la replicazione, la divisione cellulare si conclude 20 minuti dopo. Il tempo completo che dall'inizio della replicazione fino alla fine della divisione cellulare sarebbe di 60 minuti.

In realtà i batteri possono dividersi più velocemente, possiamo avere un tempo di raddoppio diciamo di circa 20 minuti. Questo significa che è possibile che inizi il secondo ciclo di duplicazione quando ancora il primo non è terminato, quindi portando alla formazione di quelli che sono stati definiti come cromosomi multiforche. La duplicazione del primo ciclo di duplicazione, il colore rosso più chiaro non ha ancora completato l'intera duplicazione dell'intero cromosoma, iniziano nuovamente il riconoscimento delle forche e quindi la formazione di una nuova bolla di replicazione in corrispondenza dell'origine.

Tutto questo sembra essere regolato dalla massa cellulare, è stato osservato che il rapporto tra la massa e il numero di origini rimane costante; quindi, quando la massa cellulare raggiunge un certo valore può iniziare la nuova divisione e questo è anche regolato dall'accumulo della proteina di DnaA attiva, che è in grado di andare a riconoscere nuovamente l'origine e iniziare un nuovo ciclo in un determinato momento, anche se il ciclo precedente di replicazione non si è completato.

La replicazione degli eucarioti

Abbiamo visto che nei cromosomi dei procarioti è sufficiente un'unica origine di replicazione per garantire la replicazione dell'intero genoma nel tempo della divisione cellulare, anche se si possono formare in alcuni casi I cromosomi multiforca. Nel caso dei cromosomi eucariotici abbiamo genomi di ben altre dimensioni, di conseguenza, devono esistere più origini di replicazione. I numeri di origine sono diversi a seconda degli organismi e delle dimensioni dei relativi genomi, quindi nel lievito per esempio abbiamo circa 350 origini, quindi sono distanziate di una origine ogni 40 chilo paia di basi, mentre nell'uomo ne esistono circa 20.000.

L'origine è il punto da cui inizia la separazione tra i filamenti e quindi inizia la sintesi dei nuovi filamenti, si viene quindi a formare una bolla di replicazione con due forche che procedono bidirezionalmente. In questa immagine è rappresentato un tratto di un cromosoma in cui sono presenti due origini. Non tutte le origini vengono attivate contemporaneamente, ma ci possono essere delle origini precoci e delle origini tardive. È stato visto che in realtà vengono attivati in gruppi ogni gruppo di origine di circa 20 - 80 e tutte le origini che iniziano allo stesso momento vanno a costituire un'unità di replicazione.

Una volta che si sono formate, le forche di replicazione avanzano e delle bolle originati dalle due origini convergono l'una nell'altra. Quello che può accadere è che alcune origini vengano replicate passivamente, cioè non vengano riconosciute come origini. Le prime origini che sono attivate sono la numero 3 la numero 5, quindi con l'avanzamento delle forche di replicazione si vede appunto che sia la numero 2 e la numero 4 vengono replicate passivamente.

Questa è la dimostrazione che una volta che si è formata una bolla, si formano due forche che avanzano bidirezionalmente lungo il cromosoma ed è un esperimento simile a quello che era già stato fatto con il cromosoma batterico. In questo caso le cellule in coltura viene fornito come precursore della sintesi del DNA della timidina marcata con il trizio, in modo che questa timidina possa essere incorporata nel DNA in via di sintesi e possa successivamente essere resa visibile con l'autoradiografia.

Quindi in questo caso è stata prima incorporata la timidina per 10 minuti e quindi si vede a destra l'immagine al microscopio con le linee di un nere spesse che indicano i punti in cui è stata incorporata la timidina e successivamente quello che viene fatto è prendere le cellule, rimuovere il terreno di coltura ed aggiungere un nuovo terreno di coltura che contiene invece la timidina non radioattiva, poi lasciarla crescere per un altro po'. Quello che si andrà a osservare che nella direzione di crescita dei filamenti si osserverà via via una diminuzione della radioattività.

Con l'esperimento precedente veniva dimostrato il fatto che le forche di replicazione avanzano bidirezionalmente. Adesso vediamo come vengono riconosciute le regioni che corrispondono all'origine di replicazione. Per quanto riguarda gli eucarioti dobbiamo fare una distinzione tra le origini che sono state identificate riscontrate in un organismo semplice come il lievito, e quelle di organismi più complessi. Le origini di replicazione del lievito sono state identificate utilizzando una serie di esperimenti del tutto simili a quelli utilizzati per identificare oriC di escherichia coli. Le origini di replicazione del lievito sono molto simili a quelle batteriche.

ARS Consensus Sequence

All'interno delle regioni quindi delle origini è stata identificata una sequenza che è stata detta ARS Consensus Sequence, Ars significa autonomous replicated sequence; quindi, è una sequenza che da sola è in grado di conferire al DNA in cui si trova la capacità di replicarsi. La ARS Consensus Sequence è una sequenza di 11 paia di basi che è conservata in tutte le ARS del lievito. È essenziale che quella regione di DNA venga riconosciuta come origine e venga attivata per dare inizio alla formazione delle forche di replicazione. Accanto alla sequenza ACS è localizzata una sequenza che prende il nome di DUE, è una regione ricca di A-T quindi facilmente denaturabile, di conseguenza rappresenta il punto in cui il DNA si denaturerà. Questo replicatore si andrà a legare una proteina che è in grado di riconoscere la sequenza ACS e legandocisi.