Biologia Molecolare Clinica

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE

Prodotte dai batteri

Riconoscono sequenze di DNA

PALINDROMICHE (CCGG) lunghe 4-6 bp (GGCC)

Tagliano il DNA e producono frammenti

Esempi di sequenze riconosciute da alcuni enzimi di restrizione

TAGLIO DI DNA GENOMICO CON ENZIMI DI RESTRIZIONE

• Produzione di frammenti di dimensioni diverse
• Frammenti estremamente numerosi

PERCHE' TAGLIARE IL DNA CON ENZIMI DI RESTRIZIONE

• Ogni gene può essere presente in uno o più frammenti di DNA
• Mediante l'analisi dei frammenti specifici è possibile identificare alterazioni a carico di DNA cause di malattie genetiche

TIPI DI ALTERAZIONI CHE CAUSANO VARIAZIONI DEI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE

• Assenza di un frammento o Delezioni di un pezzo di DNA
• Aumento delle dimensioni di un frammento o Duplicazioni di un pezzo di DNA
• Comparsa o scomparsa di un nuovo frammento o Traslocazioni, mutazioni che causano la comparsa/scomparsa di un sito di restrizione

Principi Tecnici

Analisi dei...

Polimorfismi di LunghezzaRFLP sonda gene

• I siti di restrizione sono presenti in tutto il genoma (1:1000 bp)
• L'aggiunta o la perdita di un sito di restrizione determina una variazione
• Allele 1: 9kb di lunghezza dei frammenti prodotti (polimorfismo)
• Allele 2: 12kb
• Il polimorfismo è un carattere allelico M F C1 C2 C3 C4 ereditabile
• Molte malattie possono essere identificate correlando il 12 kb polimorfismo con la malattia in esame 9 kb

Studio di una famiglia

POLIMERASE CHAIN REACTION

Amplificazione di specifici frammenti di DNA mediante l'uso di oligonucleotidi primer che definiscono la regione di interesse

LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA (PCR)

1 COPIA 2 COPIE 4 COPIE 8 COPIE 16 COPIE 32 COPIE 64 COPIE

SCHEMA SEMPLIFICATO DI UN CICLO DI PCR

SOUTHERN BLOT

Analisi di delezione

Analisi di una mutazione puntiforme

Anemia falciforme b-globina

• Il gene della umana normale tagliato con Mst-II genera 2 frammenti
• La mutazione del 6° codone b-globina(T>A) della S

producela scomparsa del sito di taglio dando origine ad un solo frammento

• La mutazione della prima base del b-globina 6° codone (A>G) della C non produce la scomparsa del sito di taglio dando origine a 2 frammenti uguali alla globina normale

Diagnosi prenatale mediante RFLP di una malattia autosomica dominante

• Analisi di legame mediante Southern blot

• Il padre è portatore della malattia trasmessa anche al figlio, presentano entrambi una banda allelica malata

• La madre e la figlia hanno entrambe 2 alleli non malati

• Il genotipo del feto presenta la banda legata alla malattia per cui viene considerato affetto

Diagnosi molecolare della Fibrosi cistica DF-508 (delezione del codone)

• DNA del paziente amplificato mediante PCR con innesti che fiancheggiano la regione del codone 508

• Il prodotto normale è rappresentato da un frammento di 160 bp (1, 2, 4, 5, e 6)

• Il prodotto del paziente omozigote per la delezione del codone 508 presenta un frammento di 157

bp(7)• Nei soggetti eterozigoti (3,8,9) sono presenti entrambi i prodotti, in aggiunta è presente anche un artefatto (banda H) Diagnosi molecolare della Distrofia Muscolare di Duchenne

• Analisi mediante PCR multipla

• Il DNA di 5 soggetti viene amplificato con 5 e 9 innesti contemporaneamente

• L'assenza di una banda è indicativa di una delezione

• Il paziente 2 non presenta la I banda nell'amplificato a 5 innesti e la II banda in quello a 9 innesti

• La mancanza di queste 2 bande corrispondono rispettivamente alla delezione degli esoni 50 e 48 del gene della distrofina

ANALISI DI POLIMORFISMI

• Frammenti di DNA che consistono in corte sequenze ripetute in tandem (STR) altamente polimorfiche

Allele 1

Allele 2

DNA SEQUENCING

ALLELE SPECIFICO LIGONUCLEOTIDE DOT-BLOT

A GT CA G

ALLELE SPECIFICO LIGONUCLEOTIDE DOT-BLOT

GA ALLELE SPECIFICO ELISA