Biologia Molecolare Clinica

POLIMERASE CHAIN REACTION

Amplificazione di specifici

frammenti di DNA mediante

l’uso di oligonucleotidi primer

che definiscono la regione di

interesse

LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA (PCR)

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8 COPIE

16 COPIE

32 COPIE

64 COPIE

SCHEMA SEMPLIFICATO DI UN CICLO DI PCR

SOUTHERN BLOT

Analisi di delezione

Analisi di una mutazione puntiforme

Anemia falciforme

b-globina

• Il gene della umana

normale tagliato con Mst-II

genera 2 frammenti

• La mutazione del 6° codone

b-globina

(T>A) della S produce

la scomparsa del sito di taglio

dando origine ad un solo

frammento

• La mutazione della prima base del

b-globina

6° codone (A>G) della

C non produce la scomparsa del

sito di taglio dando origine a 2

frammenti uguali alla globina

normale

Diagnosi prenatale mediante RFLP di una malattia

autosomica dominante

• Analisi di legame mediante

Southern blot

• Il padre è portatore della malattia

trasmessa anche al figlio,

presentano entrambi una banda

allelica malata

• La madre e la figlia hanno

entrambe 2 alleli non malati

• Il genotipo del feto presenta la

banda legata alla malattia per cui

viene considerato affetto

Diagnosi molecolare della Fibrosi cistica

DF-508)

(delezione del codone

• DNA del paziente amplificato

mediante PCR con innesti che

fiancheggiano la regione del

codone 508

• Il prodotto normale è rappresentato

da un frammento di 160 bp

(1,2,4,5, e 6)

• Il prodotto del paziente omozigote

per la delezione del codone 508

presenta un frammento di 157 bp

(7)

• Nei soggetti eterozigoti (3,8,9)

sono presenti entrambi i prodotti,

in aggiunta è presente anche un

artefatto (banda H)

Diagnosi molecolare della Distrofia Muscolare di

Duchenne

• Analisi mediante PCR multipla

• Il DNA di 5 soggetti viene

amplificato con 5 e 9 innesti

contemporaneamente

• L’assenza di una banda è indicativa

di una delezione

• Il paziente 2 non presenta la I

banda nell’amplificato a 5 innesti e

la II banda in quello a 9 innesti

• La mancanza di queste 2 bande

corrispondono rispettivamente alla

delezione degli esoni 50 e 48 del

gene della distrofina

ANALISI DI POLIMORFISMI

• Frammenti di DNA che

consistono in corte sequenze

ripetute in tandem (STR)

altamente polimorfiche

Allele 1

Allele 2

DNA SEQUENCING

ALLELE SPECIFIC

OLIGONUCLEOTIDE DOT-BLOT

A G

T C

A G

ALLELE SPECIFIC

OLIGONUCLEOTIDE DOT-BLOT

G

A