Microbiologia Clinica - Biologia Molecolare

LA BIOLOGIA MOLECOLARE: CENNI STORICI

enuncia le “leggi dell’ereditarietà”

Nel 1866 Gegorio Mendel

Nel 1909 William Johannsen introdusse la

distinzione fondamentale tra genotipo e fenotipo

• Nel 1944 Oswald Avery effettua il primo esperimento di

trasformazione batterica, dimostrando in modo convincente che i geni

sono formati da DNA

Nel 1953 Jim Watson e Francis Crick descrivono la

struttura della molecola del DNA

Le caratteristiche morfologiche e funzionali delle cellule sono

determinate dalle proteine (strutturali, di membrana, enzimatiche…).

La biologia molecolare

è studio dei fenomeni biologici in termini di strutture e interazioni tra gli

acidi nucleici e le proteine.

e l’RNA

il concetto che il DNA sono macromolecole informazionali è alla

base della biologia molecolare

il DNA contiene tutte le informazioni necessarie a specificare le sequenze

primarie di tutte le proteine di un organismo.

DNA mantiene le informazioni necessarie per la conservazione degli

organismi e per il trasferimento delle informazioni alle generazioni

successive

Nessuna cellula è in grado di produrre una proteina per la quale non ci

sia un’informazione precodificata nel DNA

RNA trasporta le informazioni al citoplasma di una cellula e dirige la sintesi

delle proteine necessarie per le funzioni dell’organismo.

Lo stato di salute di una cellula dipende dalla stabilità del DNA e da una

adeguata replicazione e traduzione in proteine.

La moderna biologia cellulare cerca di determinare i meccanismi di base della

struttura e della funzionalità cellulare

Gli studi sono sempre più incentrati a livello del gene.

Nucleo Citoplasma

Proteina Fenotipo

DNA RNA Regolazione

Regolazione Regolazione post-traduzionale

trascrizionale post-trascrizionale Modulazione

Stabilità Trasporto Traduzione funzionale

Maturazione Modificazione

Biochimica e biologia degli acidi nucleici

Composizione e struttura molecolare

Struttura primaria degli acidi nucleici

Struttura secondaria degli acidi

nucleici

è nata negli anni ’70 e si basa sulla

La biologia molecolare

disponibilità di enzimi capaci di tagliare, unire e replicare il

DNA in maniera specifica e trascrivere l’RNA in DNA.

Obbiettivo

Fornire la struttura concettuale per le applicazioni diagnostiche

della analisi degli acidi nucleici.

Enzimi usati in biologia molecolare

• Endonucleasi di restrizione

Enzimi di restrizione•

Estremità piatte (Blunt end)

Estremità appiccicose (Sticky end)

• DNA ligasi

• DNA polimerasi

• Frammento Klenow

• Taq polimerasi (PCR)

• Polinucleotide fosforilasi

• Polinucleotide fosfatasi

LE MALATTIE EREDITARIE

IL MATERIALE BIOLOGICO PER LA BIOLOGIA MOLECOLARE:

IL DNA

• Ogni cellula nucleata racchiude del DNA

• Solitamente per lo studio di routine in medicina si

parte dal sangue totale

• Le tecniche di estrazione del DNA sono

relativamente semplici e riassumibili come segue

ESTRAZIONE DI DNA

1. Lisi delle cellule mediante detergenti (SDS)

2. Liberazione del DNA dalle proteine legate

mediante un enzima (Proteinasi K)

3. Il DNA viene liberato in soluzione ed

estratto con diverse sostanze tipo il

cloroformio

4. PRECIPITAZIONE con Alcol Etilico

5. Il DNA precipita forma di filamenti

sotto

visibili ad occhio nudo

6. Infine viene disciolto in acqua distillata

spin column-based purification method.

L’ANALISI DEL DNA

Identificare nuovi geni

Evidenziare particolari frammenti di interesse

Determinare la sequenza di un determinato

gene

Verificare la presenza di mutazioni o alterazioni

della sequenza

Analisi degli acidi nucleici

• Separazione in elettroforesi

• Dosaggi in ibridazione

• Tecniche di amplificazione

• Polimorfismo della lunghezza del frammento di

restrizione

STRUMENTI PER L’ANALISI DEL DNA

Gli enzimi di restrizione

Sono enzimi di origine batterica in grado di tagliare il DNA a doppia

elica in punti specifici, dove riconoscono una precisa sequenza di basi

Riconoscono generalmente tratti di DNA di lunghezza compresa tra 4

e 6 bp (paia di basi)

Le sequenze riconosciute sono caratterizzate da una simmetria

(palindromi), per cui la sequenza 5’ 3’di un filamento è identica a

quella del complementare

Alcuni enzimi tagliano lungo l’asse di simmetria generando blunt

cioè estremità pari, mentre altri tagliano lasciando estremità 5’ o

ends,

3’ sporgenti (sticky ends)

Solitamente un enzima riconosce una sola sequenza e dal taglio si

ottengono frammenti di diversa lunghezza

Una volta tagliati, i frammenti vanno separati solitamente mediante

gel elettroforesi

Enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione

Enzima: Sma I 3’

5’ G G T C G A A C C C G G G C C A A T T G

C C A G C T T G G G C C C G G T T A A C

3’ 5’ Blunt ends

5’ 3’

G G G C C A A T T G

G G T C G A A C C C C C C G G T T A A C

C C A G C T T G G G 5’

3’ Enzima: EcoR I 3’

5’

T C C A T T C G T G A A T T C T T G C G T

A G G T A A G C A C T T A A G A A C G C A

3’ 5’ Sticky ends

3’

5’ A A T T C T T G C G T

T C C A T T C G T G G A A C G C A

A G G T A A G C A C T T A A 5’

3’

Analisi di un gene con tecnica

del blotting

GEL ELETTROFORESI

L’elettroforesi è una tecnica di separazione che sfrutta

la proprietà delle molecole cariche (DNA, RNA,

Proteine) di migrare quando sono sottoposte ad un

campo elettrico

La separazione avviene su un supporto inerte

all’interno

gelificato (agarosio, poliacrillamide) del

quale si separano i diversi frammenti

I gel per elettroforesi sono immersi in una soluzione

(tampone di corsa) salina che permette il passaggio di

corrente

Le molecole si separano in base al loro peso

molecolare e alla loro carica

l’RNA

Il DNA e migrano verso il polo Positivo grazie

alle carica negativa conferitegli dai gruppi fosfato

GEL ELETTROFORESI

GEL ELETTROFORESI

Gli acidi nucleici vengono generalmente separati su gel di

agarosio

Nell’agarosio viene disciolto ETIDIO BROMURO, una

dell’

sostanza che si intercala tra i filamenti acido nucleico ed

emette una luce rosa-arancione fluorescente se esposta raggi

UV

Il gel si pone sotto una lampada a raggi UV e lo si osserva

Si osservano diverse bande separate lungo la

dall’origine

corsia, di deposizione fino al margine

opposto

Ogni banda rappresenta un insieme di

frammenti di DNA della stessa lunghezza

Analisi del DNA genomico

Rivelazione con Bromuro di Etidio

IL TRASFERIMENTO SU FILTRO: IL “SOUTHERN BLOTTING”

Lo svantaggio dei gel di elettroforesi è la loro fragilità

Tecnica del BLOTTING

I frammenti di DNA vengono generati solitamente con enzimi di

restrizione

“Southern Blotting”

Il rappresenta uno strumento analitico

ampiamente utilizzato in biologia molecolare.

Tecnica ideata da Ed Southern, da cui prende il nome

Consiste nel trasferimento di singoli frammenti di DNA da gel a filtri

di Nylon o Nitrocellulosa

I filtri sono supporti più resistenti e maneggevoli nelle operazioni

successive alla corsa elettroforetica

Uso di sonde molecolari

Southern Blotting

IL PRINCIPIO DEL SOUTHERN

BLOTTING

Il trasferimento del DNA dal gel al filtro avviene per capillarità.

Una soluzione salina, salendo attraverso il gel perché richiamata da carta

assorbente, trascina con se il DNA facendolo legare elettrostaticamente alla

membrana.

Il DNA prima di essere trasferito viene denaturato con una soluzione di

)

idrossido di sodio (NaOH 1 Kg Peso Lastra di vetro

Carta da filtro

3 fogli di carta 3MM

Filtro

Vassoio con soluzione

di trasferimento Gel Carta 3MM imbevuta

Supporto

Analisi del DNA genomico

Rivelazione con Bromuro di Etidio o con Sonda di DNA

Tratto da Thompson & Thompson Genetica Bromuro di Etidio Sonda di DNA

in Medicina - Idelson-Gnocchi

Ma come identifichiamo il frammento di

nostro interesse?

il Concetto di Sonde e di Ibridazione

LE SONDE (O PROBE) E L’IBRIDAZIONE MOLECOLARE

all’interno di una miscela

Per identificare un frammento specifico,

di frammenti di DNA o anche su una membrana dobbiamo metterlo

in evidenza

Possiamo definire SONDA una specie chimica in grado di

riconoscere e segnalare, con assoluta specificità e sensibilità,

mediante un’interazione molecolare, un’altra specie chimica

Nel caso del Southern, il bersaglio molecolare della sonda è la

sequenza a