Microbiologia Clinica - Biologia Molecolare

Analisi di un gene con tecnica del blotting

A G G T A A G C A C T T A A 5’3’

L'elettroforesi è una tecnica di separazione che sfrutta la proprietà delle molecole cariche (DNA, RNA, Proteine) di migrare quando sono sottoposte ad un campo elettrico.

La separazione avviene su un supporto inerte all'interno gelificato (agarosio, poliacrillamide) del quale si separano i diversi frammenti.

I gel per elettroforesi sono immersi in una soluzione (tampone di corsa) salina che permette il passaggio di corrente.

Le molecole si separano in base al loro peso molecolare e alla loro carica.

L'RNA e migrano verso il polo Positivo grazie alle carica negativa conferitegli dai gruppi fosfato.

Gli acidi nucleici vengono generalmente separati su gel di agarosio.

Nell'agarosio viene disciolto ETIDIO BROMURO, una dell'sostanza che si intercala tra i filamenti acido nucleico ed emette una luce rosa-arancione fluorescente se

esposta raggiUV

Il gel si pone sotto una lampada a raggi UV e lo si osserva

Si osservano diverse bande separate lungo la

dall'originecorsia, di deposizione fino al margine

opposto

Ogni banda rappresenta un insieme di

frammenti di DNA della stessa lunghezza

Analisi del DNA genomico

Rivelazione con Bromuro di Etidio

IL TRASFERIMENTO SU FILTRO: IL "SOUTHERN BLOTTING"

Lo svantaggio dei gel di elettroforesi è la loro fragilità

Tecnica del BLOTTING

I frammenti di DNA vengono generati solitamente con enzimi di

restrizione

"Southern Blotting"

Il rappresenta uno strumento analitico

ampiamente utilizzato in biologia molecolare.

Tecnica ideata da Ed Southern, da cui prende il nome

Consiste nel trasferimento di singoli frammenti di DNA da gel a filtro

di Nylon o Nitrocellulosa

I filtri sono supporti più resistenti e maneggevoli nelle operazioni

successive alla corsa elettroforetica

Uso di sonde molecolari

Southern Blotting

IL PRINCIPIO DEL SOUTHERN

BLOTTING

Il trasferimento del DNA dal gel al filtro avviene per capillarità. Una soluzione salina, salendo attraverso il gel perché richiamata da carta assorbente, trascina con sé il DNA facendolo legare elettrostaticamente alla membrana. Il DNA, prima di essere trasferito, viene denaturato con una soluzione di idrossido di sodio (NaOH).

Materiali necessari:

• 1 Kg di peso lastra di vetro
• Carta da filtro
• 3 fogli di carta 3MM
• Filtro
• Vassoio con soluzione di trasferimento
• Gel
• Carta 3MM imbevuta
• Supporto

Per l'analisi del DNA genomico, è possibile utilizzare la rivelazione con bromuro di etidio o con una sonda di DNA.

Ma come identifichiamo il frammento di nostro interesse? Il concetto di sonde e di ibridazione.

Le sonde (o probe) e l'ibridazione molecolare all'interno di una miscela.

Per identificare un frammento specifico di DNA o anche su una membrana, dobbiamo metterlo in evidenza. Possiamo definire SONDA una specie chimica in grado di riconoscere.

E segnalare, con assoluta specificità e sensibilità, mediante un'interazione molecolare, un'altra specie chimica.

Nel caso del Southern, il bersaglio molecolare della sonda è la sequenza ad essa complementare.

La reazione di riconoscimento e legame tra due sequenze complementari viene definita "ibridazione".

Una molecola è definita SONDA se è associata a una fonte di segnale che riveli l'avvenuta ibridazione.

Uso di sonde molecolari

Ibridizzazione

Uso di sonde molecolari

Ibridizzazione

LA MARCATURA DELLE SONDE

Per la marcatura degli acidi nucleici si usa prevalentemente un isotopo radioattivo (32P) come fonte di segnale.

I metodi di marcatura possono essere diversi:

Nick Translation: è basato sull'incorporazione enzimatica di nucleotidi liberi, marcati con un radioisotopo.

Random Priming: utilizza brevi sequenze di DNA per innescare la reazione di marcatura con sostanze radioattive.

La reazione di ibridazione viene rivelata mediante

una lastra autoradiografica impressionata dal radioisotopo nella posizione in cui è avvenuta l'ibridazione tra sonda e frammento ricercato

SOUTHERN BLOTTING

Analisi del DNA genomico

Rivelazione con Bromuro di Etidio o con Sonda di DNA

Tratto da Thompson & Thompson Genetica Bromuro di Etidio Sonda di DNA in Medicina - Idelson-Gnocchi

Analisi di un gene con tecnica del blotting

Ma la quantità di DNA che si ottiene da un'estrazione è esigua per poter effettuare molti studi. Inoltre, se si vuole studiare un segmento di DNA specifico questo non è presente in numerose copie!!!

Quindi.....

Metodi di amplificazione

PCR

DNA polimerasi: enzima capace di produrre una catena di DNA complementare ad una catena a singolo filamento. Necessita di uno stampo e di un innesco con un 3'-OH libero.

La PCR (reazione a catena della polimerasi) consente l'amplificazione di un frammento di DNA specifico a partire da una minima quantità di DNA stampo. La reazione

filamento di DNA nelle regioni adiacenti alle estremità della sequenza da amplificare.

Elongazione (72°C)

Un enzima, la Taq polimerasi aggiunto alla miscela di reazione, è in grado di sintetizzare il segmento di DNA compreso tra i due primer, in maniera perfettamente complementare ai due filamenti stampo….

LA PCR….….MA COSA SERVE PER UNA REAZIONE DI PCR….

Vengono usati due primer, in modo da chiudere tra di loro la sequenza da amplificare. Devono essere specifici, cioè devono legarsi solo in una determinata posizione. La loro composizione in basi (A,T,C,G) determina la temperatura di annealing.

2. Nucleotidi: Vengono aggiunti i quattro nucleotidi per la formazione dei nuovi filamenti di DNA. La reazione a catena è catalizzata da una DNA polimerasi termostabile.

3. Taq Polimerasi: isolata dal batterio Thermus acquaticus, che è in grado di sintetizzare il segmento di DNA compreso tra i due primer, in maniera perfettamente complementare.

Il magnesio cloruro è indispensabile per il funzionamento della Taq polimerasi. In assenza di questo l'enzima non è attivo.

Viene aggiunta una soluzione di sali che crea le condizioni ideali per la buona riuscita della reazione.

CONTROLLO

Al termine della reazione di PCR avremo ottenuto milioni di copie del frammento di nostro interesse, ma non siamo in grado di osservarli direttamente.

Dunque….

Marker

Il nostro prodotto di PCR viene controllato su un gel di agarosio mediante elettroforesi. Il nostro DNA amplificato apparirà come una singola banda fluorescente quando osservata al transilluminatore (raggi UV).

Sullo stesso gel viene caricato un Marker di lunghezze, cioè una miscela di frammenti di DNA a lunghezza conosciuta, che ci permette di verificare se il frammento amplificato è quello da noi ricercato in funzione della sua lunghezza.

IN CONCLUSIONE

La reazione di PCR avviene in provette, all'interno di...

Un apparecchio chiamato Termociclatore (Thermal Cycler), in grado di variare le diverse temperature per ogni ciclo.

I prodotti ottenuti dalla PCR possono essere utilizzati per le diverse analisi di laboratorio, come per esempio diagnosticare la presenza di una mutazione e quindi di una malattia genetica.

Sequenziamento automatico

Si utilizzano dei nucleotidi di terminazione che contengono un tracciante fluorescente diverso per ciascuno dei 4 dideossinucleotidi e dotato di proprietà spettrali differenti.

I traccianti fluorescenti vengono incorporati dalla polimerasi nella molecola nascente del DNA: si termina la catena e si attacca il fluoroforo alla fine della molecola interrotta.

Le bande, separate in capillari riempiti di polimero, vengono individuate grazie alla fluorescenza che emettono quando passano davanti ad un apposito rilevatore.

Vantaggi: rispetto alle sequenze manuali c'è maggiore affidabilità (si minimizza l'errore dell'operatore).

esordio tardivo.

Un risultato patologico dell'analisi indica che quella persona è destinata a sviluppare la malattia ad un certo momento della sua vita, ammesso che viva sufficientemente a lungo. Questo consente di attivare interventi preventivi.

I familiari che invece non hanno la mutazione