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L’ANALISI DEL DNA

Identificare nuovi geni

Evidenziare particolari frammenti di interesse

Determinare la sequenza di un determinato

gene

Verificare la presenza di mutazioni o alterazioni

della sequenza

Analisi degli acidi nucleici

• Separazione in elettroforesi

• Dosaggi in ibridazione

• Tecniche di amplificazione

• Polimorfismo della lunghezza del frammento di

restrizione

STRUMENTI PER L’ANALISI DEL DNA

Gli enzimi di restrizione

Sono enzimi di origine batterica in grado di tagliare il DNA a doppia

elica in punti specifici, dove riconoscono una precisa sequenza di basi

Riconoscono generalmente tratti di DNA di lunghezza compresa tra 4

e 6 bp (paia di basi)

Le sequenze riconosciute sono caratterizzate da una simmetria

(palindromi), per cui la sequenza 5’ 3’di un filamento è identica a

quella del complementare

Alcuni enzimi tagliano lungo l’asse di simmetria generando blunt

cioè estremità pari, mentre altri tagliano lasciando estremità 5’ o

ends,

3’ sporgenti (sticky ends)

Solitamente un enzima riconosce una sola sequenza e dal taglio si

ottengono frammenti di diversa lunghezza

Una volta tagliati, i frammenti vanno separati solitamente mediante

gel elettroforesi

Enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione

Enzima: Sma I 3’

5’ G G T C G A A C C C G G G C C A A T T G

C C A G C T T G G G C C C G G T T A A C

3’ 5’ Blunt ends

5’ 3’

G G G C C A A T T G

G G T C G A A C C C C C C G G T T A A C

C C A G C T T G G G 5’

3’ Enzima: EcoR I 3’

5’

T C C A T T C G T G A A T T C T T G C G T

A G G T A A G C A C T T A A G A A C G C A

3’ 5’ Sticky ends

3’

5’ A A T T C T T G C G T

T C C A T T C G T G G A A C G C A

A G G T A A G C A C T T A A 5’

3’

Analisi di un gene con tecnica

del blotting

GEL ELETTROFORESI

L’elettroforesi è una tecnica di separazione che sfrutta

la proprietà delle molecole cariche (DNA, RNA,

Proteine) di migrare quando sono sottoposte ad un

campo elettrico

La separazione avviene su un supporto inerte

all’interno

gelificato (agarosio, poliacrillamide) del

quale si separano i diversi frammenti

I gel per elettroforesi sono immersi in una soluzione

(tampone di corsa) salina che permette il passaggio di

corrente

Le molecole si separano in base al loro peso

molecolare e alla loro carica

l’RNA

Il DNA e migrano verso il polo Positivo grazie

alle carica negativa conferitegli dai gruppi fosfato

GEL ELETTROFORESI

GEL ELETTROFORESI

Gli acidi nucleici vengono generalmente separati su gel di

agarosio

Nell’agarosio viene disciolto ETIDIO BROMURO, una

dell’

sostanza che si intercala tra i filamenti acido nucleico ed

emette una luce rosa-arancione fluorescente se esposta raggi

UV

Il gel si pone sotto una lampada a raggi UV e lo si osserva

Si osservano diverse bande separate lungo la

dall’origine

corsia, di deposizione fino al margine

opposto

Ogni banda rappresenta un insieme di

frammenti di DNA della stessa lunghezza

Analisi del DNA genomico

Rivelazione con Bromuro di Etidio

IL TRASFERIMENTO SU FILTRO: IL “SOUTHERN BLOTTING”

Lo svantaggio dei gel di elettroforesi è la loro fragilità

Tecnica del BLOTTING

I frammenti di DNA vengono generati solitamente con enzimi di

restrizione

“Southern Blotting”

Il rappresenta uno strumento analitico

ampiamente utilizzato in biologia molecolare.

Tecnica ideata da Ed Southern, da cui prende il nome

Consiste nel trasferimento di singoli frammenti di DNA da gel a filtri

di Nylon o Nitrocellulosa

I filtri sono supporti più resistenti e maneggevoli nelle operazioni

successive alla corsa elettroforetica

Uso di sonde molecolari

Southern Blotting

IL PRINCIPIO DEL SOUTHERN

BLOTTING

Il trasferimento del DNA dal gel al filtro avviene per capillarità.

Una soluzione salina, salendo attraverso il gel perché richiamata da carta

assorbente, trascina con se il DNA facendolo legare elettrostaticamente alla

membrana.

Il DNA prima di essere trasferito viene denaturato con una soluzione di

)

idrossido di sodio (NaOH 1 Kg Peso Lastra di vetro

Carta da filtro

3 fogli di carta 3MM

Filtro

Vassoio con soluzione

di trasferimento Gel Carta 3MM imbevuta

Supporto

Analisi del DNA genomico

Rivelazione con Bromuro di Etidio o con Sonda di DNA

Tratto da Thompson & Thompson Genetica Bromuro di Etidio Sonda di DNA

in Medicina - Idelson-Gnocchi

Ma come identifichiamo il frammento di

nostro interesse?

il Concetto di Sonde e di Ibridazione

LE SONDE (O PROBE) E L’IBRIDAZIONE MOLECOLARE

all’interno di una miscela

Per identificare un frammento specifico,

di frammenti di DNA o anche su una membrana dobbiamo metterlo

in evidenza

Possiamo definire SONDA una specie chimica in grado di

riconoscere e segnalare, con assoluta specificità e sensibilità,

mediante un’interazione molecolare, un’altra specie chimica

Nel caso del Southern, il bersaglio molecolare della sonda è la

sequenza ad essa complementare

La reazione di riconoscimento e legame tra due sequenze

complementari viene definita «ibridazione»

Una molecola è definita SONDA se è associata a una fonte di

segnale che riveli l’avvenuta ibridazione

Uso di sonde molecolari

Ibridizzazione

Uso di sonde molecolari

Ibridizzazione

LA MARCATURA DELLE SONDE

Per la marcatura degli acidi nucleici si usa prevalentemente un

32

isotopo radioattivo ( P) come fonte di segnale

I metodi di marcatura possono essere diversi:

Nick Translation: è basato sull’incorporazione

enzimatica di nucleotidi liberi, marcati con un

radioisotopo

Random Priming: utilizza brevi sequenze di DNA per

innescare la reazione di marcatura con sostanze

radioattive

La reazione di ibridazione viene rivelata mediante una lastra

autoradiografica impressionata dal radioisotopo nella posizione in

cui è avvenuta l’ibridazione tra sonda e frammento ricercato

SOUTHERN BLOTTING

Analisi del DNA genomico

Rivelazione con Bromuro di Etidio o con Sonda di DNA

Tratto da Thompson & Thompson Genetica Bromuro di Etidio Sonda di DNA

in Medicina - Idelson-Gnocchi

Analisi di un gene con tecnica

del blotting

Ma la quantità di DNA che si ottiene da una

estrazione è esigua per poter effettuare molti

studi. Inoltre, se si vuole studiare un

segmento di DNA specifico questo non è

presente in numerose copie!!!

Quindi……..

Metodi di amplificazione

PCR

DNA polimerasi: enzima capace di produrre una catena di DNA complementare

ad una catena a singolo filamento.

Necessita di uno stampo e di un innesco con un 3’-OH libero.

La PCR (reazione a catena della polimerasi) consente l’amplificazione di un

frammento di DNA specifico a partire da una minima quantità di DNA stampo.

La reazione richiede: uno stampo di DNA, una miscela di nucleotidi e due

inneschi (primers) che definiscono i punti di inizio della sintesi del DNA

Se si parte da DNA a doppio filamento è necessario separare le catene perché i

primers possano poi legarsi alla zona a loro complementare.

La PCR, quindi, consiste nella ripetizione di cicli in cui si fa variare la

temperatura:

a) denaturazione (94-95°C) rottura dei legami idrogeno e separazione dei

filamenti

b) appaiamento (T specifica) i primers legano la catena nella zona a loro

complementare

c) estensione (T ottimale per la polimerasi in uso) produzione dei frammenti

Alla fine di x cicli di PCR, il prodotto viene controllato:

tramite gel di agarosio oppure tramite sequenziamento ed utilizzato.

LA PCR Denaturazione (95°C)

La doppia elica di DNA si svolge e si divide

nelle due catene complementari

Ibridazione (Anealing) (50-60°C)

I primer, sequenze di DNA a singolo

filamento lunghe da 15 a 30 bp sintetizzate

chimicamente, si appaiano al filamento di

DNA nelle regioni adiacenti alle estremità

della sequenza da amplificare.

Elongazione (72°C)

Un enzima, la Taq polimerasi aggiunto alla

miscela di reazione, è in grado di sintetizzare il

segmento di DNA compreso tra i due primer,

in maniera perfettamente complementare ai

due filamenti stampo

….LA PCR….

….MA COSA SERVE PER UNA REAZIONE DI PCR….?

Vengono usati due primer, in modo da chiudere tra di loro la sequenza da

1. Primer amplificare.

Devono essere specifici, cioè devono legarsi solo in una determinata

posizione

La loro composizione in basi (A,T,C,G) determina la temperatura di

anealing

2. Nucleotidi Vengono aggiunti i quattro nucleotidi per la formazione dei nuovi

filamenti di DNA

La reazione a catena è catalizzata da una DNA polimerasi termostabile

3. Taq Polimerasi isolata dal batterio Thermus acquaticus, che è in grado di sintetizzare il

segmento di DNA compreso tra i due primer, in maniera perfettamente

complementare ai due filamenti di DNA stampo

Il magnesio cloruro è indispensabile per il funzionamento della Taq

4. MgCl 2 polimerasi. In assenza di questo l’enzima non è attivo

Viene aggiunta una soluzione di sali che crea le condizioni ideali per la

5. Buffer buona riuscita della reazione

CONTROLLO

Al termine della reazione di PCR avremo ottenuto milioni di copie del

frammento di nostro interesse, ma non siamo in grado di osservarli

direttamente

Dunque….

Marker Il nostro prodotto di PCR viene controllato su un gel

di agarosio mediante elettroforesi. Il nostro DNA

amplificato apparirà come una singola banda

fluorescente quando osservata al transilluminatore

(raggi UV)

Sullo stesso gel viene caricato un Marker di

Lunghezze, cioè una miscela di frammenti di DNA a

lunghezza conosciuta, che ci permette di verificare

se il frammento amplificato è quello da noi ricercato

in funzione della sua lunghezza

IN CONCLUSIONE

La reazione di PCR avviene in provette,

all’interno di un apparecchio chiamato

Termociclatore (Thermal Cycler), in grado di

variare le diverse temperature per ogni ciclo

I prodotti ottenuti dalla PCR possono essere

utilizzati per le diverse analisi di laboratorio,

come per esempio diagnosticare la presenza di

una mutazione e quindi di una malattia

genetica

Sequenziamento automatico

Sequenziamento automatico:

si utilizzano dei nucleotidi di terminazione che contengono un

tracciante fluorescente diverso per ciascuno dei 4

dideossinucleotidi e dotato di proprietà spettrali differenti.

I traccianti fluorescenti vengono incorporati dalla polimerasi

nella molecola nascente del DNA: si termina la catena e si

attacca il fluoroforo alla fine della molecola interrotta.

Le bande, separate in capillari riempiti di polimero, vengono

individuate grazie alla fluorescenza che emettono quando

passano davanti ad un apposito rilevatore.

Vantaggi: rispetto alle sequenze manuali c’è maggiore

affidabilità (si minimizza l’errore dell’operatore), maggiore

rapidità.

I test genetici : panoramica generale

Il test genetico nella pratica clinica

definisce l'analisi di un gene, del suo

prodotto o della sua funzione finalizzata ad

individuare o ad escludere un'alterazione

verosimilmente associata con una malattia

genetica. I test genetici

• I test genetici sono eterogenei. Nella pratica

medica, essi sono per la maggior parte utilizzati

con finalità diagnostiche.

• I test diagnostici si effettuano sulle persone

che hanno, o si sospetta che abbiano, una

particolare malattia; il quesito che tentano di

risolvere è se il paziente abbia o non abbia una

determinata malattia, e non se la svilupperà in

.

un certo momento della sua vita

• I test genetici sono classificati invece come

presintomatici, quando identificano il rischio di

sviluppare una malattia in futuro in una persona

non affetta al momento dell'analisi e che

appartiene ad una famiglia nella quale uno o più

individui hanno una malattia ad esordio tardivo.

• Un risultato patologico dell'analisi indica che

quella persona è destinata a sviluppare la

malattia ad un certo momento della sua vita,

ammesso che viva sufficientemente a lungo.

consente di attivare interventi preventivi

I familiari che invece non hanno la mutazione

eliminano lo stato d'ansia ed evitano indagini

inutili.

• I test genetici rivolti all'identificazione dei

portatori individuano le persone che presentano

un rischio riproduttivo aumentato per alcune

malattie recessive comuni.

• sia attraverso gli screening di popolazione (ad

es. talassemia nell'area del Mediterraneo),

• sia con gli screening a cascata, sui familiari dei

pazienti affetti da malattie comuni in certe

popolazioni

• Infine, i test genetici predittivi riguardano

numerose malattie comuni, nelle quali il

rischio di malattia è aumentato o ridotto,

ma con un livello di accuratezza molto più

basso, rispetto a quello degli altri test

genetici (ad es. ApoE4 e malattia di

Alzheimer, polimorfismi del recettore delle

chemochine e AIDS).

I test genetici

• La sfida è quella di assicurare che i test

genetici siano offerti nella maniera più

efficace e corretta, con elevati standard

qualitativi.

• Quest'obiettivo può essere raggiunto solo

se i test genetici sono considerati come

un servizio integrato e non solo come

un'attività di laboratorio.

Le altre analisi di laboratorio,

richiedono solo l'acquisizione del campione,

l'indagine dei laboratorio e la compilazione del

referto.

i test genetici dovrebbero essere preceduti da una

fase di preparazione, informazione e

sottoscrizione del consenso e la consegna del

referto dovrebbe essere seguita dalla

discussione e dall'interpretazione del risultato e,

quando indicato, dal supporto all'utente.

la consulenza genetica è importante almeno

quanto la fase di laboratorio.

Le analisi genetiche consentono di mettere in

evidenza le mutazioni/polimorfismi del DNA

umano che sono responsabili dell'insorgere di

malattie genetiche o che sono correlate a un

aumentato rischio di sviluppare patologie

Conseguenze di mutazioni

puntiformi

Conseguenze di mutazioni del

DNA

Conseguenze di mutazioni del DNA


PAGINE

112

PESO

6.23 MB

AUTORE

kalamaj

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia (a ciclo unico - 6 anni)
SSD:
Università: Foggia - Unifg
A.A.: 2012-2013

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher kalamaj di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Medicina di Laboratorio - Microbiologia Clinica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Foggia - Unifg o del prof Sarracino Annalisa.

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