Appunti Biologia Molecolare Clinica

Biologia molecolare clinica

Esame scritto

Andrea Mosca

Esame scritto con tre domande aperte per chi segue (75% delle presenze) 106/03/2018.

Difetti eritrocitari

Enzimatici e di membrana

Le patologie più diffuse e più semplici da studiare. I globuli rossi sono cellule altamente specializzate al trasporto dell'ossigeno, sono senza nucleo e presentano un metabolismo semplice: glicolisi (no mitocondri e no ciclo di Krebs), via dei pentosi fosfati e alcune reazioni del metabolismo degli aa. Quando si parla di difetti enzimatici ci si riferisce a condizioni che hanno a che fare con la mancata espressione o espressione alterata di uno o più enzimi implicati nel metabolismo dei globuli rossi ad esempio, esochinasi enzima deputato alla trasformazione del glucosio in glu-6p. Per ogni enzima sono stati descritti dei casi di difetti genetici che si ereditano in modo autosomico recessivo (soggetto omozigote per la variante) e in qualche caso il locus genico si trova sul cromosoma X e si assiste ad una trasmissione legata al sesso. Dal punto di vista clinico i pazienti manifestano condizioni più o meno diverse, ma quasi tutti manifestano la condizione AECNS anemia (si ha meno emoglobina 13-15g/dl) cronica emolitica (i globuli rossi vanno incontro a lisi) non sferocitica (i globuli rossi non hanno l'aspetto sferulare, dovuto a difetti nelle proteine della membrana, fatta eccezione per l'enolasi).

Difetti di glucosio 6 fosfato deidrogenasi

È il primo enzima dello shunt dei pentosi monofosfati e catalizza la conversione del glu-6p in acido p-gluconico. In condizioni normali il glucosio che entra nei globuli rossi per il 90% viene metabolizzato attraverso la glicolisi e una piccola parte, il 10%, passa per lo shunt dei pentosi. Se vi sono condizioni di stress metabolico per la cellula, il NADPH viene usato dalla glutatione reduttasi che riduce il glutatione ossidato in ridotto che è in grado di perossidare l'acqua ossigenata. Quindi in condizioni di stress il fabbisogno di NADPH aumenta. L'enzima è una proteina tetramerica, formata dallo stesso tipo di subunità (omotetramero) ed è in equilibrio con una forma dimerica e, in condizioni particolari, può splittare il dimero nella forma monomerica che non è attiva dal punto di vista catalitico. È un'unica catena polipeptidica di 515aa con un peso di 59kDa. Ogni subunità ha un sito particolare dove si può legare una molecola di NADP. Per poter purificare l'enzima, alla fine degli anni '80, hanno usato 1400L di sangue. Se si hanno 10mL di globuli rossi si possono estrarre 3g di emoglobina ma solo 10 microgrammi di G6PD. La sequenza primaria è stata scoperta alla fine degli anni '90 e solo dopo 20 anni si è ottenuta la struttura 3D della molecola. È estremamente instabile e difficile da cristallizzare. Sono stati trovati dei soggetti con difetti genetici caratterizzati da mutazioni in determinati residui dell'enzima.

Il difetto di G6PD è una condizione frequente: in tutto il mondo ci sono da 300-400 milioni di persone affette da mutazioni a questo enzima. La prevalenza è molto variabile da 0,5% fino ad arrivare al 25% come nella popolazione sarda. Si ha una distribuzione a macchina di leopardo. La prevalenza della carenza di G6PD è molto alta in alcune parti del mondo. La sua distribuzione è in gran parte tropicale e parallela alla distribuzione della malaria, una malattia con alta morbilità e mortalità, e rappresenta una potente forza selettiva nelle popolazioni umane. L'ipotesi che questa infezione fosse responsabile di un polimorfismo equilibrato, mantenendo un'alta frequenza di mutazioni di deficit di G6PD come difesa contro la malaria, è stata esaminata in numerosi studi epidemiologici in Africa e altrove. Nell'Italia continentale la prevalenza è molto alta. Le varianti di glucosio 6-p deidrogenasi sono alte, ma in Italia, la variante più frequente è quella Med che presenta una mutazione nel sesto esone ed è indicata come variante mediterranea G6PD. I soggetti adulti che presentano queste varianti presentano forte emolisi che può essere scatenata dopo l'assunzione di certi farmaci (antimalarici, antinfiammatori, paracetamolo), favismo (fava contiene dei glicosidi che nei soggetti G6PD portano a gravi conseguenze), ittero neonatale (condizione abbastanza frequente, numero di globuli rossi alto già alla nascita e una certa parte di globuli rossi si distrugge, e quando si libera emoglobina viene catabolizzata prontamente producendo bilirubina. Dopo 3-4 mesi la produzione di bilirubina diminuisce. Se si assistono però a delle condizioni come carenze di G6PD o enzimi deputati al catabolismo della bilirubina si ha l'ittero che può portare anche a morte), AECNS. Sono state descritte centinaia di varianti e a seconda della mutazione e l'attività enzimatica può essere più o meno compromessa. Sono state identificate 5 classi di difetti enzimatici: la classe 5 presenta un aumento dell'attività catalitica, ma negli altri casi si ha un deficit più o meno notabile di attività enzimatica. Nella variante mediterranea si ha un grave deficit dell'attività enzimatica che rappresenta meno del 10% (classe 2). Il favismo si manifesta solo nel 10-20% dei soggetti Gd che mangiano fave, bisogna distinguere anche tra fave fresche e secche che danno luogo a poteri emolitici diversi. Vi sono anche altri fattori che possono influenzare il favismo come l'ambiente e il sistema del complemento.

La colorazione dello striscio di sangue periferico con colorante permette di evidenziare i corpi di Heinz, che sono piccole componenti di natura proteica che indicano la presenza di aggregati proteici nei globuli rossi. Lo studio era stato condotto su prigionieri di guerra che si sono offerti di prendere farmaci antimalarici e venivano fatti a loro esami per vedere se andavano incontro a crisi emolitica. Dai risultati si vede un donatore sensibile alla primaquina (farmaco antimalarico) che va incontro a crisi emolitica. Valutazione dell'ematocrito, percentuale di reticolociti, marcatura dei globuli rossi con cromo 51 per misurare la vita dei globuli rossi in relazione al time corse. In un soggetto normale dopo 120 non ci sono più globuli rossi. A seguito di somministrazione di primaquina, l'ematocrito nel giro di 2 settimane crolla e aumentano i reticolociti (a seguito di un aumento di ematopoiesi midollare). La percentuale di cellule marcate con cromo 51 diminuisce in maniera inversamente proporzionale alla percentuale di reticolociti. L'uso degli antimalarici in questi pazienti portava anche ad una diminuzione della glutatione perossidasi. Nei soggetti sensibili alla primaquina la quantità di glutatione ridotto era inferiore rispetto ai soggetti non sensibili. L'effetto è dose dipendente. Il mangiare fave fresche può causare crisi emolitica nei soggetti con difetti G6PD.

Nella fava sono presenti alcuni glicosidi (composto che ha uno zucchero e una base) che sono responsabili dello scatenamento di uno stress ossidativo da specie reattive dell'ossigeno. Ad esempio, la vicina (estratta dalla fava) una volta che arriva nell'intestino, viene sottoposta all'azione della beta-glucosidasi e si assiste alla separazione dello zucchero dalla base con la formazione della di-vicina, che in condizioni tipiche della reazione di fenton (ioni ferrosi in presenza di acido ascorbico) si trasforma in una specie reattiva dell'ossigeno: anione superossido e un radicale, che possono generare reazioni a catena e portare alla distruzione della catena lipidica della membrana cellulare e alla distruzione della cellula. In condizioni fisiologiche queste molecole formano l'acqua ossigenata che grazie al glutatione ridotto viene subito neutralizzata e l'anione superossido e il radicale non portano alla lisi della membrana cellulare.

Ittero neonatale

L'ittero neonatale è un fenomeno comune perché la bilirubina che si forma dal catabolismo dell'eme, in condizioni normali, viene veicolata negli epatociti e coniugata all'acido glucuronico che viene poi escreta attraverso la bile. Il processo di coniugazione della bilirubina nei neonati non è ancora sviluppato e la maggior parte della bilirubina è legata in maniera aspecifica all'abumina, portando alla formazione della bilirubina non coniugata. Se questi livelli salgono e riescono a passare la BEE, possono portare allo sviluppo del Kernittero, ossia una condizione che porta a gravi problemi di sviluppo e accrescimento. L'ittero neonatale si manifesta in maniera variabile in diverse popolazioni ed è più frequente nelle donne che hanno un parto prematuro (prima della 32° settimana di gestazione) ed è associato in maniera variabile con difetti del metabolismo della bilirubina, con la sindrome di Gilbert. È stato visto in alcune popolazioni che la sindrome di Gilbert è un'aggravante dell'ittero neonatale se il neonato è portatore del difetto G6PD. Durante il parto, essendo una condizione di stress, le difese antiossidanti devono essere ottimali. Il difetto di G6PD impedisce una barriera antiossidante ottimale e facilita l'insorgenza dell'ittero neonatale e se vi è anche l'associazione della sindrome di Gilbert, l'ittero è ancora più grave.

Gene del G6PD

Il gene del G6PD è antico nella scala evolutiva, presente anche nei moo, altamente conservato e si trova sul cromosoma X. Ha una trasmissione legata al sesso. Una donna può avere entrambi i loci wild-type, uno wild-type e uno mutato oppure entrambi mutati. L'uomo che presenta solo un cromosoma X può avere il cromosoma X wild-type oppure mutato (emizigote). È un gene con 13 esoni e la variante mediterranea è una variante dove la G6PD ha una mutazione nel 6° esone dove al posto di una C al posto di una T. nella maggior parte dei casi si hanno mutazioni puntiformi, mutazioni doppie e in casi rari si hanno delle delezioni o delle mutazioni non senso. In particolare, la mutazione africana A- è data da una doppia mutazione (classe 3). Soggetti con mutazioni della G6PD presentano una certa instabilità della conformazione che tende a precipitare e formare i corpi di Heinz. Questi precipitati danneggiano la membrana eritrocitaria. L'enzima è ubiquitario, in tutte le cellule, e si è visto che i soggetti che hanno deficit di G6PD sono più sensibili alle infezioni perché nei neutrofili (cellule deputate alla difesa contro patogeni) si ha una diminuzione della capacità ossidativa dei neutrofili andando incontro ad un aumento della sensibilità alle infezioni. In soggetti adulti che hanno subito traumi (incidenti) lo sviluppo di sepsi è del 50% contro il 3% del wild-type, indicando che le difese sono molto compromesse. È molto importante caratterizzare genotipicamente i pazienti. Bisogna quindi misurare l'attività enzimatica oppure si può procedere con lo studio del DNA: la misura dell'attività enzimatica viene fatta prevalentemente in ambito ginecologico, pediatrico. L'analisi del DNA può essere fatta anche con tecniche molto rapide con revers dot-blot. Il riconoscimento del gene mutato è difficile, in quanto si possono avere fenomeni di lyonizzazione (mosaicismo) e quindi non è facile riconoscere gli eterozigoti con la valutazione enzimatica. Inoltre, l'attività enzimatica cambia a seguito di una crisi emolitica: i globuli rossi più giovani hanno un'attività più alta rispetto a quelli più vecchi. La caratterizzazione enzimatica per classificare le 5 classi veniva fatta valutando la Km, Stabilità, Optimum di pH, Ki NADPH classe 1: grave deficit enzimatico con anemia emolitica cronica non sferocitica; classe 2: insufficienza enzimatica grave (meno del 10% del normale); classe 3: deficit enzimatico da moderato a moderato (10% -60% del normale); classe 4: carenza enzimatica molto lieve o assente (60% -100% del normale); e classe 5: aumento dell'attività dell'enzima (più del doppio del normale). La misura dell'attività enzimatica può avere una percentuale di errore variabile a seguito di crisi emolitica e tale misura non può essere effettuata se il paziente è stato trasfuso. Il test del corpo di Heinz e il test di stabilità al glutatione hanno distinto, con un po' di affidabilità, il deficit di G6PD da individui normali. Ma questi test erano indiretti. Il test del corpo di Heinz, in particolare, doveva essere eseguito in condizioni attentamente controllate rispetto all'ossigenazione, e nessuno dei due era semplice da eseguire. L'analisi del G6PD misurando la riduzione di NADP a NADPH ha richiesto uno spettrofotometro a raggi ultravioletti. Lo sviluppo di test di screening semplici che potrebbero essere effettuati negli studi di popolazione facilitati sul campo, e tali test sono stati utili anche per scopi clinici. Motulsky descrisse una procedura in cui la riduzione del NADPH, invisibile a occhio nudo, era legata alla riduzione del blu crespo brillante visibile. Successivamente, sono stati sviluppati altri semplici test, utilizzando come endpoint visivi la riduzione di sostanze quali il blu di metilene, il tetrasodio MTT, il dicloroindofenolo o la metaemoglobina. Questi test sono stati sostituiti dal test in fluorescenza a spot. In questa procedura la riduzione di NADPH è osservato direttamente in virtù della sua fluorescenza, invece di collegare il ridotto nucleotide piridinico a un colorante. Gli spot test sono semplici e rapidi.

Difetti di membrana

Gli eritrociti sono cellule che possono modificare le loro dimensioni ma hanno un rapporto tra la superficie e il volume che è costante. Tollerano deformazioni nella forma ma non tollerano modificazioni del rapporto superficie volume. La robustezza della struttura dei globuli rossi è paragonabile a quella dell'acciaio. La struttura della membrana eritrocitaria è stata definita attorno agli anni '60: presenta un doppio strato fosfolipidico con proteine integrali. Al di sotto è localizzato il citoscheletro che localizza le spectrine che sono collegate alla membrana tramite dei complessi di collegamento. La banda 3 è legata alla spectrina mediante l'ankarina, un altro complesso presenta l'actina e la tropomiosina con la glicoforina C. Sono tutti residui oligosaccaridici. Esistono delle interazioni verticali e orizzontali. Il globulo rosso può modificare la sua forma agendo su questi tipi di interazioni. Vi possono essere delle mutazioni a livello di queste proteine che possono causare modificazioni della cellula. A livello della membrana vi è anche il gruppo Rh, il trasportatore Duffy, Kell, KCNN4 trasportatore del potassio, GLUT1 trasportatore del glucosio facilitato non insulino dipendente. Una tecnica per separare le proteine in base al loro peso molecolare è la SDS-page, mediante la quale è stata possibile separare le proteine dei globuli rossi: quelle a più alto peso molecolare sono le spectrine, che sono seguite da dalle bande che sono state denominate con numeri progressivi in base al peso molecolare. Alcune bande sono nette mentre in altri casi si visualizzano delle sfumature e delle code, indicando che la proteina non è omogenea, ma è andata incontro a modifiche post-traduzionali.

Una condizione abbastanza frequente di tipo ereditario è la sferocitosi ereditaria, ossia eritrociti che non presentano la classica forma biconcava. È il disordine congenito più comune in Nord Europa con una prevalenza di 1:5000-1:2000. Il quadro clinico è contraddistinto da anemia cronica di grado variabile, splenomegalia (ingrossamento della milza), reticolocitosi (aumenta il numero di reticolociti che normalmente è dell'1%. L'aumento è causato da un aumento della lisi degli eritrociti), sferociti. La diagnosi non è sempre lineare e facile: test per valutare natura emolitica, esame striscio sangue periferico, studio resistenza osmotica eritrocitaria (diminuita), studio proteine di membrana. Nei test che si effettuano bisogna escludere la patologia autoimmune. L'evidenza dell'emolisi è rappresentata dall'aumento della bilirubina. LDH se aumenta è indice generico di citolisi. La prevalenza in Italia è rappresentata dall'1% dei donatori di sangue apparentemente sani. Nel 75% dei casi la HS è a carattere dominante con penetranza variabile. Nel 25% trasmissione di tipo recessivo ad insorgenza di nuove mutazioni.

Mutazioni geniche: spectrina, ankirina e banda 3. Spectrina e ankirina sono proteine intracellulari, mentre la banda 3 si localizza a livello della membrana. Vi possono essere diversi scenari: carenza di spectrina e ankirina, carenza di proteine integrali di membrana. In entrambi i casi i globuli rossi vescicolano e portano all'evoluzione di uno sferocita che ha un rapporto superficie volume particolarmente sensibile agli stress osmotici e viene più facilmente sequestrato nella milza, distrutto, con formazione di bilirubina causando anemia emolitica. Mediante tecniche di citofluorimetria si possono misurare queste micro vescicole. Le mutazioni possono essere di vario tipo. La gravità dell'anemia emolitica è variabile, nel caso la milza sia molto ingrossata può essere rimossa completamente o solo in parte. La banda 3 è il principale trasportatore di anioni, bicarbonato, è una proteina di membrana e in alcuni casi aggrega a formare tetrameri, in altri a formare dei dimeri. È molto elettrondensa e in condizioni di ipossia l'aggregazione della banda 3 si modifica. Aggregati di banda 3 promuovono il riconoscimento dei globuli rossi da parte del sistema del complemento e la conseguente lisi. La spectrina presenta due forme: alfa e beta. Il reticolo di spectrina è costituita da filamenti di alfa e beta e si accodano all'N-t di una con il C-t dell'altra secondo un andamento alfa-beta e appaiamento in modo opposto al secondo filamento. È una proteina grossa con...