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PCR
È una tecnica che ci permette di amplificare una sequenza partendo da un ostampo ci serve un Dna target (genomico, cDna, polimerasi con correzione delle bozze), 2 oligonucleotidi (direct e reverse), un tampone con magnesio, nucleotidi.
Es. duplex di Dna che deve essere denaturato ad una temperatura di circa 96°C dopo di che dobbiamo far appaiare i primer ad una temperatura intorno 50-65°C, quindi bisogna raffreddare. È importante lavorare alla temperatura giusta perché a 50°C succede che si appaiano in modo specifico con 100% di appaiamento di basi complementari usando una temperatura più bassa saranno sempre appaiati, ma in modo non specifico.
Il primer che si appaia sul filamento stampo è il direct, mentre quello che si appaia sul filamento codificante è il reverse la Dna polimerasi si attacca e inizia a sintetizzare a 72°C.
Poi inizia un altro ciclo, quindi un ciclo è fatto di denaturazione, appaiamento primer e...
È un trattamento che dovrebbe modificare l'espressione genica, e Control che è normale, non vedo nessuna differenza significa che questo trattamento per 40 cicli non fa assolutamente nulla (vedo tanto cDna per TBI che per Control) e questo anche nel gene di controllo se lo faccio per 30 cicli vedo che il trattamento sembra ridurre in modo significativo l'espressione dell'osteocalcina, ma non per i geni di controllo a 25 cicli vedo che con il trattamento riesco ancora a vedere l'mRna, mentre nel controllo non vedo più nulla, significa che l'mRna è espresso di più nel TBI che nel Control a 25 cicli a 20 amplificazioni l'mRna dell'osteocalcina non si vede proprio mi chiedo allora se il trattamento induce l'espressione dell'osteocalcina? Dipende da quanti cicli faccio, se ne faccio troppo pochi non vedo nulla, se ne faccio troppi non c'è alcuna differenza.
Ciò che succede nel tubo di PCR arriva a saturazione, che io parta da tot molecole o un altro numero non cambia nulla perché arrivo comunque a saturazione. Bisogna provare a trovare quanto prodotto di PCR ho ad ogni ciclo (altrimenti andare a tentativi con i cicli). È possibile tramite Real time PCR che ci permette di monitorare la quantità di prodotti PCR ad ogni ciclo in tempo reale. Mi disegna curve di amplificazione e possono stabilire qual è la reale differenza tra due campioni (quindi è quantitativa). Real time RT-PCR.
Se facciamo una Real time di un messaggero è una per questa tecnica si usa SYBR Green che emette fluorescenza quando intercalato in un doppio filamento, mentre emette bassa fluorescenza quando non è nel DNA a doppio filamento quindi vede l'amplificato, non il cDNA. Si fa quindi una reazione di PCR normale con questo colorante fluorescente e si misura a ogni ciclo quanto colorante è presente.
tanto più ci saranno prodotti di PCR→tanto più sarà fluorescente perché intercalato in doppi filamenti di DnaIl punto della curva in cui la quantità di fluorescenza inizia ad aumentare velocemente è detto il ciclo soglia o Threshold Cycle (Ct) per ogni campione→si ottiene una curva di amplificazione e il relativo Ct e vediamo che la curva è sempre sigmoidee, ma quello che cambia è il Ct→il Ct è inversamente proporzionale alla quantità di Dna stampo iniziale contenuto nel campione(mRna) es. confronto tra campione azzurro e campione giallo (Ct: 14 e 16): il campione giallo ci mette 2 cicli in più a superare il ciclo soglia, ad avere la stessa quantità di prodotti PCR del campione azzurro, ma la domanda è quanto mRna in meno c’era? ad ogni ciclo raddoppiano quindi significa che l’mRna era in meno di 4 volte nel giallo quindi tanto più basso è il Ct tanto più
alto è il quantitativo di stampo originario si tratta di un Metodo comparativo del -Δ(Ct2-Ct1)2Ct la formula di questo metodo è Cap 27.
Gli efetti epigenetici sono ereditati. L'epigenetica si riferisce ai cambiamenti che influenzano il fenotipo senza alterare il genotipo, cioè tutte le modificazioni ereditabili che variano l'espressione genica pur non alterando la sequenza del DNA. Ad esempio, la lunghezza del collo della giraffa dovuta all'adattamento per raggiungere rami più alti diventa poi una caratteristica ereditabile.
Articolo 2014 che dice che l'esperienza olfattoria parentale influenza il comportamento e la struttura neurale nelle generazioni successive. Un topo maschio viene sottoposto ad un certo numero di volte ad un odore caratteristico seguito da una scarica elettrica, così impara ad associare all'odore il pericolo della scossa e reagisce con tremore (paura) allo stimolo odoroso (anche quando la scarica non è presente).
arriva lui trema all'odore) aumentano i neuroni olfattori, c'è una maggiore sensibilità allo stimolo olfattorio e avvengono dei cambiamenti nei centri del cervello adibiti all'elaborazione degli stimoli
I figli di questo topo poi fanno la stessa cosa il tremore del topo all'odore si tramanda di generazioni hanno fatto una fecondazione in vitro e questa caratteristica si tramandava lo stesso, senza la presenza di una femmina significa che dipende dai gameti, lo spermatozoo è sufficiente a riprodurre questa caratteristica
Si inizia a studiare questo specifico gene in seguito al trattamento con odore e scossa elettrica vedono che il gene viene demetilato e questo aumenta l'espressione del gene la demetilazione del gene è il carattere epigenetico che viene trasmesso alle generazioni
Ciò che è straordinario e ancora non chiaro è come questo carattere arrivi alle cellule germinali deve prodursi uno
contiene trasposoni, ma pochigeni che codificano caratterizzata da acetilazione e metilazione di H3 in K9–È capace di propagarsi alla cromatina vicina occhio rosso: gene white–espresso deve essere in una regione eucromatica che però ha vicine delleregioni eterocromatiche può avvenire un’inversione del gene che si viene a–ritrovare in mezzo ad una regione eterocromatica il gene white può non–funzionare e dare un occhio bianco perché è diventato eterocromatico*
Geni responsabili della propagazione: screening genetico i geni sono–detti suppressor of variegation (Su(var)) sono stati caratterizzati gli eventi–necessari: interviene una deacetilasi istonica HDAC che deacetila la lisina 9 diH3 che ora può essere metilata da parte di Su(var)3-9 ora la lisina può–essere legata da HP1 (heterochromatine protein 1) che è un altro geneSu(var)2-5, ed è in grado poi di reclutare altre proteine tra cui Su(var)3-9
ealtre metilasi per altre lisine.HP1 ha la capacità di formare omodimeri e quindi può reclutare altri HP1.
Tutti questi reclutamenti fanno sì che questi eventi avvengono in più punti e lisine della regione.
HP1 ha due domini: Chromodominio che riconosce la lisina metilata, e un dominio correlato che interagisce con le metilasi.
Interagisce contemporaneamente sia con gli istoni modificati che con le proteine che modificano gli istoni.
In questo modo, il processo si può propagare.
Le regioni di eterocromatina costitutiva, ad esempio dei telomeri e centromeri, sono un esempio di repressione.
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