Biologia molecolare

FISH

Tecnica di citogenetica molecolare che permette di visualizzare la localizzazione e il numero di copie di una specifica sequenza di DNA sia su cromosomi metafasici che nuclei interfasici con sonde marcate con fluorocromi. E' una tecnica di ibridazione che permette, dopo fissazione di metafasi e nuclei interfase su vetrino, di identificare sequenze specifiche negli acidi nucleici; tale identificazione avviene mediante sonde marcate in maniera non isotopica, impiegando fluorocromi che emettono a diverse lunghezze d'onda. I cromosomi vengono deposti su un vetrino da microscopio, denaturati e ibridati con sonde fluorescenti. E' stata utile per vedere su quale cromosoma si trova una sequenza, permette di visualizzare la posizione specifica di una sequenza di DNA. Oggi viene usata per determinare aberrazioni cromosomiche e numero di copie di un cromosoma. Viene usata in diagnosi prenatale, diagnosi preimpianto, diagnosi di sindromi cromosomiche e mosaicismi in epoca postnatale.

filamenti di DNA a 45-67°C per 30 secondi- extension: la polimerasi sintetizza nuovi filamenti di DNA a 72°C per 1-3 minuti- denaturazione: i filamenti di DNA vengono separati a 95°C per 1-30 secondi

Nella provetta quindi devo avere: taq polimerasi, desossiribonucleotidi trifosfati, primer (forward e reverse → uno per filamento: filamenti antiparalleli), DNA stampo, soluzione tampone per mantenere il pH controllato, sali (le cellule sono salate, gli enzimi hanno una concentrazione di sale ottimale) come MgCl (il magnesio è fondamentale).

2RT-PCR

Non posso fare una PCR per vedere l'espressione di un gene perché non posso usare RNA, allora converto RNA in DNA tramite trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNA dipendente) → RT-PCR. Quindi posso analizzare se un gene è espresso o no, estraggo l'RNA, purifico l'RNA in modo da avere solo mRNA (polyT), nella provetta metto trascrittasi inversa e il suo necessario (desossinucleotidi) →

mantengo rapporti relativi dei geni. Copio tutti i trascritti presenti nella cellula → trascrittoma: ho tutto il trascrittoma copiato in cDNA. Quindi faccio la PCR, metto tutto e solo i primer specifici per il gene d'interesse, nel primo ciclo ho RNA e DNA appaiati e quando si denatura i primer si appaiano uno al DNA e uno all'RNA, ma la taq polimerasi riconosce solo quello con DNA. Si tratta di una tecnica veloce e molto sensibile, virtualmente una molecola di DNA può finire in una provetta che fa da controllo negativo (metto tutto tranne lo stampo) facendolo risultare positivo, per questo servono controllo positivo e negativo, se il controllo negativo esce positivo. La Northern blot e l'ibridazione in situ sono tecniche dirette per osservare l'RNA. Se faccio una curva con la quantità di molecole prodotte dalla PCR in base al numero di cicli c'è un momento iniziale in cui la quantità di molecole è amplificata.

direttamente proporzionale al numero di molecole iniziali, ma a un certo punto la curva fa un flesso e quindi non è più direttamente proporzionale. Non posso più sapere qual è il più abbondante perché non è lineare. Teoricamente la resa è 2, il valore teorico di amplificazione non viene mai raggiunto: c'è competizione tra i filamenti figli complementari per l'annealing con i primers; c'è perdita di attività enzimatica della polimerasi dovuta comunque a denaturazione termica, anche non considerando la denaturazione, la DNA polimerasi diventa limitante negli ultimi cicli (troppo target da analizzare).

Posso conoscere quale RNA inizialmente era più abbondante grazie alla real time PCR (RT-qPCR) che permette di monitorare in tempo reale l'andamento della reazione ed effettuare una quantizzazione del frammento amplificato. Si sfrutta la fluorescenza, sotto ho un termociclatore uguale.

trascrittasi inversa mantenendo le frequenze relative edottengo cDNA. Devo far sì che i due campioni tra loro siano colorati in maniera diversa. Prendo uguale quantità cDNA lo mescolo e loibrido al microarray. Un gene assente nei due campioni depositato in un quadratino non si ibrida → eccito e non vedo fluorescenza. Un gene housekeeping ugualmente espresso si ibrida → eccito e vedo fluorescenza in uguale quantità. Il risultato finale è una serie di quadratini. Tutto non è dovuto a un solo gene ma è una somma di cambiamenti → bisogna analizzare l’intero sistema. Questi sistemisono stati l’inizio per un’analisi omica. Ora sono stati sostituiti dal sequenziamento dell’RNA, che è diventato semplice, mentrel’ibridazione su microarray è difficile e c’è rumore di fondo.

WESTERN BLOT

Le corrispondenti tecniche a livello proteico utilizzano sonde proteiche ovvero anticorpi. Gli

anticorpi (Ab o Ig per immunoglobulina) si ritrovano nel sangue e sono usati dal sistema immunitario per identificare e neutralizzare sostanze estranee, come batteri e virus.

Un antigene è qualunque sostanza che introdotta in un organismo stimola la produzione di un anticorpo. Un saggio immunoenzimatico è una tecnica di laboratorio che si avvale del legame tra antigene e il suo anticorpo omologo per identificare e/o quantificare uno specifico antigene o anticorpo in un campione.

Gli anticorpi possono essere policlonali o monoclonali. Gli anticorpi policlonali riconoscono molteplici epitopi; generalmente prodotti in coniglio (ma anche topo, gallina, capra, struzzo). Se inietto una proteina umana nel topo, questo risponde con diversi tipi di anticorpi, la mia proteina ha diversi epitopi che possono scatenare risposta anticorpale, quindi ho un siero policlonale. Se nel topo inietto una sequenza amminoacidica piccola scatena la risposta di un anticorpo → siero monoclonale: un

Un anticorpo che riconosce un solo epitopo è prodotto con una procedura complessa di fusione cellulare e screening che porta alla produzione di cloni singoli capaci di produrre un solo tipo di anticorpo in grado di riconoscere un solo epitopo. Questi anticorpi sono generalmente prodotti in topo.

La western blot permette di visualizzare l'espressione di una specifica proteina riconoscendola con un anticorpo e successivamente utilizzando un saggio immunoenzimatico o immunofluorescenza.

Per preparare il campione, viene eseguita un'elettroforesi con SDS-PAGE per separare le proteine in base al loro peso molecolare. Le proteine vengono quindi trasferite su un filtro di nitrocellulosa utilizzando una corrente elettrica. Poiché le proteine sono cariche negativamente, rimangono sul filtro.

Successivamente, i siti liberi sul filtro vengono saturati mettendo il filtro in incubazione con latte scremato, che contiene pura caseina e occupa i siti liberi.

A questo punto, viene eseguita un'ulteriore incubazione con l'anticorpo primario che si lega alla proteina di interesse. L'anticorpo primario funge da sonda e non satura i siti di legame. Infine, è possibile visualizzare il risultato.