Biologia molecolare

Biologia molecolare

A fine '800 si scoprì la presenza di DNA, RNA e proteine nelle cellule, non si conosceva la struttura, si sapeva che ci fossero caratteri trasmissibili ma non si pensava a qualcosa che trasportasse l'informazione genetica. Il dogma centrale della biologia prevede che il DNA cromosomico funzioni da stampo per le molecole di RNA che vengono successivamente trasportate nel citoplasma dove determinano l'ordine degli aa all'interno delle proteine.

Esperimento di Griffith

La prima evidenza dell'esistenza di un principio trasformante venne data da Griffith (microbiologo), studiando la polmonite si era accorto dell'esistenza di due ceppi di pneumococco: uno molto virulento e mortale e l'altro meno virulento (non evade il sistema immunitario). I due ceppi presentano differenze al microscopio, il ceppo virulento è rivestito di una capsula polisaccaridica (traslucido) → S (smooth), si distingue dal non virulento che ne è privo e risulta rugoso → R (rough). Quando il topo viene inoculato con il ceppo S muore, con R vive. Griffith voleva capire cosa permettesse al ceppo S di formare la capsula, quindi prese cellule S e le uccise al calore rendendole non virulente (il topo vive), in seguito prese cellule R e le mischió con le S uccise al calore → il topo muore. Isolando i batteri dal sangue del topo trovò pneumococco S, l'informazione è passata dalle cellule uccise al calore alle cellule R → dimostra per la prima volta l'esistenza di un principio trasformante. La trasformazione è definitiva ed ereditaria.

Ma chi è il principio trasformante? Gli acidi nucleici erano difficili da purificare in forma integra, si sa da cosa sono formati (ACGT), purificavano molecole di 30 pb e sembrava assurdo che fosse tutto codificato da frammenti così corti, quindi risultava più probabile che il principio trasformante fossero le proteine che con 20 aa garantivano maggiori combinazioni e venivano purificate con lunghezza maggiori. Questa ipotesi venne smentita da Avery.

Esperimento di Avery

Dimostra che il principio trasformante è insito nel DNA (bomba di Avery). Prende le cellule S, le uccide al calore e divide l'estratto delle cellule totale in tre diverse provette, a ciascuna aggiunge un enzima idrolitico che distrugge uno degli elementi candidati come principio trasformante: proteinasi, RNAsi e DNAsi. In seguito prende il contenuto e lo mette a contatto con le cellule R, piastra il tutto su una capsula petri e osserva la presenza di cellule S. Levando proteine e RNA la trasformazione avviene, levando il DNA non avviene.

Dal punto di vista molecolare quando si lisa la cellula batterica il DNA si frammenta e alcuni frammenti contengono le informazioni per produrre la capsula polisaccaridica, se questo frammento riesce ad entrare in un'altra cellula batterica, il DNA si va a sostituire al gene che non è in grado di produrre la capsula e otteniamo un organismo trasformato (trasformazione per procarioti, trasfezione per eucarioti). La trasformazione è un evento raro, non posso integrare DNA lineare con DNA circolare perché la cellula ricevente distruggerebbe il DNA cellulare.

Esperimento di Chase e Hershey

I virus che infettano i batteri sono detti batteriofagi, sono composti da DNA (o RNA) e proteine (capside e DNA). Marcano diversamente proteine e DNA, vengono fatte due colture di coli in parallelo in una vengono cresciuti fagi con zolfo radioattivo (proteine), nell'altra con fosforo radioattivo (DNA). I fagi infettano con diverse marcature e infettano due nuove colture di coli cresciute in ambiente non radioattivo, vado a vedere quale delle due componenti del fago parentale entra nella cellula ospite e quale ricompare nella progenie del fago. Nella progenie del fago vi è la maggior parte dell'acido nucleico → no proteine. Entrambe le colture le cellule di coli hanno ricevuto il principio, ma in solo uno dei due sarà radioattivo, bisogna separare le cellule di coli dal virus tramite centrifugazione (separo oggetti con pesi differenti) → il pellet radioattivo è quello che deriva dalla coltura con fosforo → entra il DNA.

Acidi nucleici

Gli acidi nucleici sono polimeri lineari di nucleotidi. I nucleotidi sono formati da gruppo fosfato, uno zucchero pentoso e una base azotata. Lo zucchero può essere ribosio o desossiribosio che differiscono per la presenza nel ribosio di un OH al 2’. L'RNA è instabile → può dare attacchi nucleofili e possiede punti di attacco per nucleasi → si degrada facilmente. Il DNA per via del mancante OH in posizione 2 è molto più stabile.

I nucleotidi sono uniti tramite legami fosfodiesterici: il fosfato forma un legame estere con il C 5’ di uno zucchero e uno con il 3’ dello zucchero successivo. Un nucleoside è formato da base e zucchero. Una base si unisce allo zucchero rimuovendo una molecola di acqua fra l’ossidrile del carbonio dello zucchero in 1’ e la base stessa → legame glicosidico → nucleoside. Il legame di un fosfato allo zucchero ottenuto eliminando una molecola di acqua tra il fosfato e l’ossidrile sul carbonio 5’ dà un fosfomonoestere.

Le pirimidine hanno un solo anello aromatico e sono citosina, timina e uracile; le purine hanno due anelli aromatici e sono adenina e guanina. Le chinasi agiscono sul fosfato in nel DNA rimane il fosfato in dopo il legame rimane un gruppo pirofosfato ovvero due fosfati γ, α, (per marcare proteine uso ATP marcato in per marcare RNA in γ, α).

DNA

L'impalcatura di ciascun filamento dell'elica è composta di zuccheri alternati a residui fosforici; le basi si proiettano all’interno ma possono essere accessibili attraverso i solchi maggiori e minori. Lo zucchero in posizione 2’ è privo di OH e ha solo due H.

Chargaff comprese la composizione del DNA grazie a un esperimento con cromatografia su strato sottile (separazione di molecola in base a proprietà chimiche/fisiche in funzione della diversa affinità). Usiamo una lastra di vetro (supporto) su cui è spruzzata la sostanza chimica in grado di separare i vari nucleotidi (strato sottile), si posizionano i vari campioni, si posiziona lo strato sottile in verticale in una bacinella contenente il tampone che inizia a correre muovendosi per diffusione verso la porzione alto dello strato sottile, facendo così trascina con sé i nucleotidi che hanno diversa affinità per il tampone. Prese il DNA di varie specie, lo purificò e idrolizzò in nucleotidi, che vennero separati con la cromatografia e trovò che i 4 nucleotidi non sono presenti in eguale quantità; le specie hanno una diversa composizione in nucleotidi; il DNA preparato da diversi tessuti e organi dello stesso organismo ha sempre la stessa composizione in basi; il numero di A è uguale alle T e le G è uguale a C; il rapporto purine-pirimidine è uguale a 1.

Il DNA è composto da una doppia elica destrogira con un passo di 10.4 pb, i filamenti sono antiparalleli, ha una struttura regolare caratterizzata da un diametro di 20 Å (2 nm), questa struttura è possibile perché le pirimidine si appaiano sempre con purine (CG tre legami, AT due), l'appaiamento è reso possibile da legami deboli. L’elica ha due solchi chiamati solco maggiore (22 Å, 2.2 nm) e solco minore (12Å, 1.2 nm), il solco maggiore è il sito preferenziale per l’interazione delle proteine perché contiene perfettamente un’α elica.

Le forze che tengono insieme il DNA sono interazioni idrofobiche, legami idrogeno e repulsione elettrostatica. La complementarietà della doppia elica ne garantisce la duplicazione in due molecole figlie. L’unica forza repulsiva nel DNA è quella tra fosfati carichi -, ma non è abbastanza forte da destabilizzare la doppia elica.

L’elica descritta da Watson e Crick è di tipo B, ne esistono anche altre forme come:

• DNA A: Coppie di basi più angolate rispetto al piano perpendicolare all’asse della doppia elica; 11 coppie di basi per ogni giro d’elica; passo 25Å e diametro 23. In vivo è tipica di eteroduplex RNA/DNA o duplex RNA/RNA
• DNA Z: Elica sinistrorsa; diametro 18Å, passo di 46. Scoperta studiando DNA sintetici in cui G e C si alternano lungo la sequenza; ci sono prove sperimentali che esista una piccola frazione di DNA in vivo in forma Z e ci sono proteine che legano DNA Z.

Alcuni tipi rari di base sono la 5 metilcitosina e la 5 idrossimetilcitosina. Nessun acido nucleico tende a stare a singolo filamento → formare la doppia elica è energeticamente favorito.

RNA

Contiene uracile al posto di timina e ribosio al posto di deossiribosio, è a singolo filamento anche se forma regioni a doppio filamento, le molecole sono molto più corte di quelle di DNA (uno o pochi geni). Ha una breve vita media (molto instabile). Può contenere basi insolite, modificate e non presenti nel DNA. Alcuni virus hanno genomi a RNA a doppio o singolo filamento. Quando a singolo filamento le basi idrofobiche cercando di essere il più possibile lontani dall’ambiente acquoso. La struttura terziaria è resa possibile dall’arrangiamento tridimensionale di blocchi di strutture secondarie, sono possibili perché le basi possono ruotare e ripiegarsi liberamente intorno al legame fosfodiesterico e ai legami che lo legano al ribosio e le basi possono anche impegnarsi in appaiamenti non di tipo Watson-Crick. L’ossidrile in 2’ impedisce la formazione di una doppia elica di tipo B, favorendone una di tipo A con il solco maggiore più stretto e profondo e quello minore più largo e accessibile. L’RNA contiene un elevatissimo numero di nucleotidi modificati (fino a 100) che ne aumentano di molto la variabilità strutturale.

Denaturazione e ibridazione

La doppia elica è tenuta insieme da un grande numero di legami, per arrivare al singolo filamento (denaturazione) bisogna fornire una temperatura molto elevata (T di ebollizione) o un pH diverso. Se prendo una provetta con DNA denaturato e la lascio a temperatura ambiente (passaggio lento e graduale), le molecole si muovono e si incontrano, se le due molecole che si incontrano sono complementari i due filamenti possono appaiarsi → il DNA va verso il sistema a minore energia possibile e si riforma la doppia elica; dopo i primi appaiamenti il sistema si appaia più velocemente.

Per stimare se il DNA è completamente denaturato uso lo spettrofotometro, metto campione in cuvette e lo metto nello spettro, imposto lunghezza d’onda (260 nm), la luce che esce è la stessa che entra meno quelle che assorbe il campione → assorbanza (permette di risalire alla concentrazione di DNA, RNA e proteine). Nel DNA assorbono gli anelli aromatici delle basi azotate, queste si trovano all’interno, la parte esterna scherma le basi: l'assorbanza del DNA è limitata dallo scheletro fosfodiesterico → assorbe di più il singolo filamento. Idrolizzando il tutto a nucleotidi assorbono di più i nucleotidi → se la concentrazione è troppo alta è per questo: errore.

L’assorbanza cresce in funzione della temperatura (andamento sigmoide), inizialmente si formano bolle di denaturazione e poi si arriva a un valore di plateau quando il DNA è completamente denaturato → effetto ipercromico: il DNA assorbe di più quando è denaturato. La temperatura di melting è la temperatura alla quale il 50% delle molecole sono denaturate. La temperatura di fusione dipende dal contenuto di GC che formano più legami idrogeno e dalla forza ionica della soluzione, se la forza ionica è elevata le cariche negative dei gruppi fosfato dell'elica che la destabilizzando sono schermati e di conseguenza l’elica è più stabile, se la forza ionica è bassa le cariche negative sono meno schermate e quindi l’elica è più instabile. Quando la T della soluzione di DNA viene abbassata lentamente i singoli filamenti si riappaiono con quelli complementari, ricostituendo una doppia elica regolare. Quando la T della soluzione di DNA viene abbassata rapidamente (ghiaccio) si forma un così detto gomitolo statistico, prevalentemente dato da legami idrogeno intramolecolari. Se misuro l’assorbanza abbassando velocemente la T è a metà, non è quella iniziale ma è maggiore e non è quella del DNA denaturato, ma è minore. La T di rinaturazione dipende da lunghezza e composizione in basi.

Ibridazione

Non necessariamente si appaiano filamenti della stessa elica, ma possono appaiarsi anche filamenti provenienti da eliche diverse, dipende se il mismatch è tollerato o meno e dalla T, se c’è mismatch c’è una piccola bolla in corrispondenza. Se quando il DNA è denaturato aggiungo una grossa quantità di acido nucleico a singolo filamento complementare (sonda), il DNA del gene si appaia con l’RNA → eteroduplex. La molecola in largo eccesso è detta sonda, se posso riconoscere la sonda, posso estrarre la sequenza d’interesse. La sonda viene utilizzata per cercare molecole con sequenza complementare in miscele di acidi nucleici.

Proteine

Le proteine sono le macromolecole da cui dipendono tutte le attività della cellula; sono strumenti e macchine molecolari che fanno funzionare la cellula. Come enzimi, le proteine aumentano la velocità delle reazioni metaboliche; come ormoni, fattori di crescita e attivatori genici, svolgono numerose funzioni di regolazione; come recettori e trasportatori di membrana, selezionano ciò che reagisce con la cellula o ciò che entra o esce dalla cellula; inoltre, formando filamenti contrattili costituiscono l’apparato per l’attività motoria, mentre formando fibre forniscono il sostegno meccanico sia alla cellula sia all’ambiente che la circonda. Le proteine agiscono anche da anticorpi, da tossine, fanno coagulare il sangue, assorbono o rifrangono la luce e trasportano sostanze da una parte a un’altra del corpo. Sono catene lineari di aa che si ripiegano in conformazioni tridimensionali. Gli aa basici sono lisina, arginina e istidina; gli aa acidi sono acido aspartico e acido glutammico; la metionina è l’aa che iniza la sintesi proteica, alcuni aa contengono anelli aromatici e la cisteina può formare ponti disolfuro (unici legami covalenti sopra la struttura primaria). Tutti gli aa possono essere modificati post traduzionalmente, la più classica è la fosforilazione (chinasi) che può avvenire su tirosina, serina e treonina. Gli aa che formano catena polipeptidica sono uniti tramite legame peptidico (condensazione).

Struttura

Ogni proteina assume un’unica conformazione anche se ne potrebbe assumere teoricamente un numero enorme, le istruzioni per assumere quella conformazione sono contenute nella sequenza di aa. Il folding è influenzato dal comportamento della proteina in ambiente acquoso (residui idrofobici tendono a riavvicinarsi e stare all’interno; residui polari tendono a stare verso l’esterno dove possono interagire con l’acqua). La struttura finale è tenuta assieme da legami deboli non covalenti (interazioni idrofobiche, legami idrogeno, interazioni ioniche, forze di van der Waals) → le proteine perdono facilmente la loro struttura → flessibilità. Possiamo determinare la struttura di proteine e DNA con cristallografia e raggi x, possiamo fare cristalli sono se hanno strutture regolari → solo alcune proteine sono cristallizzabili.

Una proteina è dotata di vari livelli strutturali, la struttura primaria è la forma denaturata (non esiste in natura). La struttura secondaria si forma grazie a legami idrogeno stabili a dare schemi organizzativi regolari, sono motivi tridimensionali che si ripetono nella catena polipeptidica. Se ci sono cisteine si possono formare ponti disolfuro. Le principali strutture secondarie sono:

• Eliche: Lunghe in genere 10-15 residui; forma di spirale destrorsa con lo scheletro all’interno dell’elica e catene laterali proiettate all’esterno. Tenuta insieme per lo più da legami H.
• Sheets: Costituiti da segmenti individuali detti strands di 3-10 residui. I foglietti resistono alle forze di trazione (tensili). La seta è costituita da una proteina contenente un gran numero di foglietti e deve la sua robustezza a questo tipo di architettura. In genere una proteina ha 1/3 di ogni struttura, ma ci sono eccezioni.

Il disordine governa alcune proteine. Le parti di una proteina non organizzate in strutture secondarie definite formano giri o anse. Molte proteine contengono segmenti che sono privi di una conformazione definita. I segmenti disordinati tendono ad avere una composizione in amminoacidi prevedibile, sono ricchi di residui carichi e polari e poveri di residui idrofobici, queste regioni disordinate rivestono ruoli chiave in processi cellulari vitali, spesso legando il DNA o altre proteine. Tali segmenti, una volta legati ad un partner appropriato, vanno incontro ad una trasformazione fisica, assumendo una struttura ripiegata definita.

La struttura terziaria è resa possibile dai gruppi laterali degli aa, si tratta dell’arrangiamento generale, compatto e tridimensionale che la catena polipeptidica adotta in condizioni fisiologiche. Gli eventi tendono a procedere verso stati di energia più bassa, secondo questo concetto, la struttura terziaria che una catena polipeptidica assume dopo l’avvolgimento è quella con la più bassa energia, ovvero è la struttura più stabile dal punto di vista termodinamico che può essere formata da quella catena. L’evoluzione ha scelto quelle sequenze amminoacidiche che generano una catena polipeptidica capace di arrivare spontaneamente, in un tempo biologicamente ragionevole, ad uno stato nativo utile a svolgere una funzione. A volte le proteine sono aiutate da chaperonine per assumere la loro forma.

La struttura quaternaria descrive come le diverse subunità di una proteina si dispongono nello spazio, si riferisce al modo in cui le singole catene polipeptidiche ripiegate si associano le une alle altre.