Biologia molecolare

BIOLOGIA MOLECOLARE

INTRODUZIONE

La biologia molecolare è la branca che studia i meccanismi molecolari su cui si fonda la fisiologia degli

esseri viventi. Lo studio molecolare tiene conto della struttura, delle proprietà e delle reazioni delle

molecole chimiche che costituiscono gli esseri viventi.

Con la terminologia biologia molecolare si può indicare, inoltre, l’insieme delle tecniche che consentono di

rilevare, analizzare, manipolare e clonare gli acidi nucleici del DNA e dell’RNA.

NOZIONI DI BASE:

Legame chimico

Il legame chimico è la forza con cui due atomi sono tenuti assieme.

Questi possono essere:

- Forti (legame covalente)

Tengono insieme le struttura stessa della molecola (è difficile da rompere).

- Deboli (che possono rompersi a temperature fisiologiche, 37°)

La biologia molecolare si basa quasi esclusivamente sul controllo di questi legami.

Legami a idrogeno

o Forze di van der Waals

o

Caratteristica dei legami deboli

- Sono più distanti

- Hanno maggiore valenza (numero maggiore di elettroni di valenza)

- Sono mobili e possono ruotare

Formazione di legami chimici

La formazione di legami chimici implica cambiamenti della forma di energia.

Si parla in questo caso di energia libera, che si indica con ∆G.

⇄

A + B AB + energia libera

⇄

AB + energia libera A + B

Equilibrio

Un’altra caratteristica importantissima è che tutti questi legami, tutte le reazioni, sono in equilibrio. 1

Secondo principio della termodinamica

Così come per i composti chimici, anche per le macromolecole vale il principio della termodinamica,

ovvero, nelle reazioni spontanee avviene sempre una diminuzione dell’energia libera (∆G è negativo).

Ad esempio, un complesso DNA-PROTEINA si formerà solamente se la ∆G diminuisce.

Se si forma un complesso l’∆G di quella reazione è sicuramente negativa.

L’equilibrio della reazione (spostamento verso prodotti o reagenti) può essere modulato, e questo vuol dire

che si può regolare l’interazione tra le macromolecole.

N.B.

Se invece, una reazione ha un ∆G positivo, vuol dire che non è spontanea e che per avvenire ha bisogno di

energia, che in questo caso è fornita dagli enzimi, appunto dei catalizzatori.

∆G negativo = spontanea (rilascia energia)

∆G positivo = non spontanea (richiede energia)

Se il ∆G risulta uguale a 0, la reazione è reversibile.

Questo concetto è importantissimo, e vuol dire che si può tornare indietro.

Legami deboli: legami a idrogeno e forze di van der Waals

- Legame a idrogeno

Legame intermolecolare che ha luogo quando in una molecola è presente un

atomo di idrogeno legato a un elemento elettronegativo e di piccole

dimensioni come F, O e N, Cl, Br.

Si viene a formare quindi, una parziale carica positiva sull’idrogeno e una

parziale carica negativa sull’altro atomo.

Quando un’altra molecola si avvicina, questa si orienterà in modo tale da disporre il suo doppietto

elettronico verso l’H, e questo genera una grande forza di attrazione.

Il legame a idrogeno è la più forte delle interazioni tra le molecole in termini di energia e vale circa

5 Kcal/mol. La somma dei vari legami a H rende una struttura molto stabile (struttura DNA è mantenuta da

legami a H).

2 - Forze di van der Waals

Questi legami sono molto deboli, ma anche questi, sommati tra loro, possono avere un ruolo molto

importante. Ad esempio, la stabilità della doppia elica in soluzione è mantenuta da questi legami.

Queste forze di van der Waals sono essenzialmente due e si distinguono in:

1. dipolo – dipolo indotto:

una molecola polare si avvicina ad una apolare inducendo in quest’ultima un dipolo elettrico (questo

dipolo è di minore intensità, e dura fino a che le due molecole sono vicine).

2. dipolo istantaneo – dipolo indotto:

questi dipoli sono generati dal fatto che gli elettroni girano intorno al nucleo, di conseguenza tra le

due molecole apolari vicine, si verrà a creare un dipolo.

N.B.

Queste forze sono molto deboli, ma comunque anche qui la loro somma, può avere un ruolo importante.

Ovviamente la loro intensità è direttamente proporzionale alla superficie su cui si vengono a instaurare,

ovvero, tanto più è estesa la superficie di interazione della molecola, tanto più forte sarà la somma di queste

forze.

STORIA DEL DNA

È importante ricordare alcuni personaggi che hanno fatto la storia.

Uno di questi è:

- Gregor Mendel (per la prof è il fondatore della biologia molecolare): (1865)

Pubblicò i suoi studi condotti sulle piante di piselli nel 1865.

All’inizio i suoi studi non vennero presi in considerazione, fino a che il francese De Vries all’inizio

del ‘900 riscoprì i testi di Mendel.

- Sutton e Boveri (1903)

Altri personaggi da menzionare sono Sutton e Boveri, che nel 1903, formularono la teoria

cromosomica dell’ereditarietà: il fenomeno dell’ereditarietà è legato ai cromosomi che poi si

scoprirà essere fatti di DNA.

- Hersey e Chase (1952)

Questi due genetisti sono famosi per il loro esperimento: l’esperimento di Hersey-Chase.

Questo esperimento dimostrava che l’informazione genetica era contenuta nel DNA e non nelle

proteine. Il DNA di alcuni batteriofagi riusciva a infettare altri organismi viventi.

Usarono traccianti radioattivi (P per il DNA e S, zolfo, per le proteine).

- Watson e Crick

Infine, Watson e Crick riuscirono a identificare la struttura del DNA. 3

STRUTTURA DEL DNA

Il DNA è un polimero costituito da una serie di subunità connesse estremità per estremità.

Queste, sono tenute insieme da legami covalenti che in condizioni fisiologiche sono estremamente stabili.

La subunità in questione, quindi l’unità strutturale del DNA è il nucleotide che è costituito da:

- Uno zucchero

- Un fosfato

- Una base azotata

Zucchero: pentoso

Lo zucchero del DNA è un pentoso (a 5 atomi di C), chiamato deossiribosio

(cioè senza un ossidrile) (al posto del C , invece di un -OH, c’è un -H).

2

La presenza di questo H in posizione 2, fa del DNA una molecola altamente

stabile e adatta a conservare l’informazione genetica (a differenza dell’RNA che

invece è altamente instabile).

I carboni del pentoso vengono numerati da 1’ a 5’ (1 primo, 5 primo, ecc.).

Questo per distinguerli dai C delle basi azotate che invece non hanno il ‘ (primo).

Se parliamo di 3’ OH, stiamo parlando del C tre del pentoso a cui è legato -OH.

4

Base azotata

La base azotata invece può essere distinta in due diversi tipi:

- Purine e pirimidine

Queste a sua volta possono essere distinte in altri due tipi:

1. Pirimidine

Sono più piccole perché hanno un solo anello benzenico a 6 atomi di C.

- Citosina

- Timina

2. Purine

Sono più grandi perché sono formate da due anelli benzenici (a 5 e a 6 atomi di C).

- Adenina

- Guanina

Si numerano senza il ‘ (primo) per distinguerle dai C degli zuccheri.

Le basi azotate sono legate alla posizione 1’ del pentoso con N1 della pirimidina o N9 della purina.

Il legame tra C e N è il legame N-glicosidico.

Il complesso base azotata + zucchero è chiamato NUCLEOSIDE.

Quest’ultimo viene trasformato in NUCLEOTIDE nel momento in cui gli viene aggiunto il fosforo con un

legame fosfoesterico (il PO viene legato allo zucchero).

4

I nucleotidi però, per la sintesi del DNA, vengono trasformati in

nucleotidi trifosfati, ovvero, gli vengono aggiunti due gruppi fosfati.

b, g)

La presenza di questi fosfati (a, conferisce l’energia necessaria per

la sintesi del DNA.

La sintesi del DNA avviene grazie alla polimerizzazione della catena,

dove in poche parole, il 5’Pa del nucleotide, si lega al 3’OH della

catena, formando un LEGAME FOSFODIESTERICO. a b

L’energia di questo legame viene fornita dalla rottura tra il P e il P ,

e il conseguente rilascio del gruppo pirofosfato.

Dal momento che questo legame avviene sempre tra il PO del C 5’, e il

gruppo -OH del 3’ (dell’altro zucchero), la catena avrà sempre

un’estremità 5’ e un’estremità 3’. →

Quindi, la sintesi del DNA proseguirà sempre in direzione 5’ 3’. 5

Quindi, per come è costituito il DNA, si può proprio

distinguere uno scheletro esterno, costituito dallo zucchero,

e una parte interna costituita dalle basi.

In ogni caso, già Watson e Crick, avevano capito che il DNA

in realtà aveva una struttura a doppia elica, che seguiva

regole ben precise:

- Pirimidina si lega sempre con una purina

E viceversa.

N.B.

Purina-purina non è possibile, perché essendo costituiti da due

anelli benzenici, sono troppo grossi, così come due pirimidine

insieme sono troppo piccole.

Regola:

- PIRIMIDINA – PURINA

Tautomeria delle basi: complementarità

Un’altra cosa importantissima da ricordare, è che nelle basi, gli atomi di N si trovano nella forma NH

2

(amminica), e raramente nella forma NH (imminica). Stessa cosa vale per gli atomi di C della guanina e

della timina, che hanno la forma chetonica (C=O) e non enolica (C-OH).

Quindi le basi sono in equilibrio nella forma cosiddetta tautomerica.

Questo determina quindi, una certa complementarità tra basi:

A – T

C – G

Queste coppie di basi si possono formare solo se queste si

trovano nella forma tautomerica giusta.

6

Stabilità DNA: catene antiparallele e interazioni tra basi

Per soddisfare la formazione di questi legami tra le basi (vedi sopra), le due catene devono essere sempre

→ →

antiparallele tra loro, ovvero, uno deve andare in direzione 5’ 3’, e l’altra in direzione 3’ 5’.

Dal punto di vista energetico, la legge che guida la formazione del DNA in questo specifico orientamento è

la seconda legge della termodinamica, in quanto, questa struttura, è quella energeticamente più stabile,

quindi è favorita.

In più, la struttura non è piatta, ma si forma una

doppia elica destrorsa.

Altra caratteristica di questa struttura è che le basi

giacciono perpendicolari all’asse dell’elica, e sono

impilate l’una sull’altra, contribuendo alla stabilità

dell’elica.

Questa maggiore stabilità è dovuta a interazioni

idrofobiche quali forze di van der Waals.

Solco maggiore e solco minore

Un’altra caratteristica importante è dovuta dalla particolare disposizione del legame glicosidici, che non

sono posizionati perfettamente l’uno opposto all’altro. Questo fa si che il DNA, una volta arrotolato,

formi dei solchi con diverse misure: un solco maggiore e un solco minore.

Nell’immagine accanto possiamo osservare in alto a

sinistra un accoppiamento tra guanina e citosina. In

mezzo ci sono i legami a idrogeno e nella parte superiore

abbiamo il solco maggiore, mentre nella parte inferiore

abbiamo il solco minore.

Le A stanno per accettore, quindi quegli atomi possono

accettare un legame a idrogeno. Le D invece possono

fungere da donatori di legami a idrogeno.

Come possiamo vedere nell’immagine, nel solco

maggiore, la possibilità di creare legami è superiore

rispetto a quello inferiore.

Questo perché innanzitutto essendo più grande c’è meno

ingombro sterico, inoltre esistono proprio più possibilità

di creare legami.

Questo è importante per due motivi:

- Rende la struttura più stabile (più legami H = più stabilità)

- Favorisce la specificità di legame. 7

N.B.

Questo secondo concetto è importantissimo.

Tutto nella biologia molecolare si basa sulla specificità di legame.

Noi dobbiamo sempre immaginarci che una proteina presa totalmente a caso, si

troverà davanti a km e km di DNA, di conseguenza, deve riconoscere un sito

specifico, costituito da poche coppie di basi a cui legarsi.

Una volta che la proteina troverà il sito e si legherà ad esso, l’equilibrio sarà

altamente spostato verso la formazione del complesso.

N.B.

Questo è un primo esempio di rapporto struttura-funzione, ovvero di come

appunto la struttura sia importante poi anche per la funzione.

Per capire, il solco maggiore è più specifico, perché se ad esempio lo

paragoniamo ad un chiavistello, tanto più è elaborato il chiavistello, tanto più

specifica dev’essere la chiave per aprire.

In conclusione, la maggior parte delle proteine, se non tutte, interagiscono con il solco maggiore (questo

perché ha maggiore specificità).

N.B.

C’è solo una proteina che interagisce con il solco minore che è la TBP, e che studieremo più avanti.

Vari tipi di DNA: A-B-Z

Questa che abbiamo appena visto è il DNA di tipo B, ovvero il DNA più abbondante della cellula.

Di DNA ne abbiamo altri due tipi: DNA di tipo A e DNA di tipo Z.

Inoltre, un’altra cosa da tenere a mente è che la struttura del DNA è abbastanza

flessibile, non va immaginata come una cosa rigida, anzi, addirittura le singole basi del

DNA possono ruotare.

Questo processo è importante perché determina anche l’attacco di varie proteine al

DNA, come succede per esempio con la DNA-polimerasi che una volta che ha trovato

il promotore, alza un’adenina del DNA per renderlo meno stabile, denaturarlo, e

iniziare la trascrizione.

Nella figura accanto vediamo al centro, quello

di tipo B, che è il più abbondante, a sinistra

quello di tipo A, e a destra quello di tipo Z.

Il DNA di tipo A non ha una grossa

differenza tra solco minore e solco maggiore.

Il DNA di tipo Z invece ha delle differenze

strutturali importanti. Infatti, invece di essere

un’elica destrorsa, è un’elica sinistrorsa (si

avvolge in senso antiorario rispetto all’asse).

8

Caratteristiche DNA di tipo B

Le caratteristiche principali del B-DNA sono:

- Coppie di basi sono perpendicolari all’asse dell’elica

- Ogni giro completo include 10 bp (10,5)

- L’angolo di rotazione delle basi è di circa 36° (34,6°)

- L’impalcatura degli atomi genera due solchi: quello maggiore e quello minore.

- La stabilità è dovuta sia ai legami H tra le basi complementare, che alle interazioni idrofobiche

(forze di van der Waals) tra le basi vicine.

Caratteristiche DNA di tipo A

Le caratteristiche principali dell’A-DNA sono:

- Coppie di basi inclinate rispetto all’asse dell’elica

- Ci sono più basi per giro (numero variabile: più di 10,5)

- Solco maggiore più profondo e meno accessibile (a causa dei gruppi fosfato che sporgono molto)

- Solco minore meno esposto

- Lo possiamo trovare quando il DNA si lega all’RNA, in presenza di sequenze poli-A o poli-T e in

condizioni di disidratazione.

Caratteristiche DNA di tipo Z

Le caratteristiche principali dello Z-DNA sono:

- È un’elica sinistrorsa

- Ha più basi per giro

- Più sottile e con un andamento a zig-zag

- Meno stabile perché i gruppi fosfati sono più vicini

- Ha un solo solco denso di cariche

N.B.

Quest’ultimo tipo di struttura è possibile per la diversa disposizione sin e anti della guanina.

Anti = elica destrorsa

Sin = elica sinistrorsa 9

Curvatura del DNA

Non dobbiamo immaginare il DNA come una struttura rigida, ma come una struttura flessibile.

Questo, infatti, è soggetto a curvature, avvolgimenti e allungamenti che corrispondono a cambiamenti negli

angoli rotazionali dei legami covalenti lungo l’asse.

N.B.

La curvatura può anche essere il risultato di interazioni DNA-proteine.

Denaturazione DNA

La denaturazione consiste nel separare le due eliche del DNA che avviene con utilizzo di energia

(aumentando la temperatura) che determinano la rottura dei legami H.

La velocità di denaturazione dipende dalla sequenza.

N.B.

Abbiamo un altro esempio struttura-funzione.

La presenza di legami H è fondamentale per la

denaturazione, perché se fossero stati legami forti, questo

processo non sarebbe stato possibile.

E una cosa fondamentale è che questo processo è

reversibile. Infatti, la rinaturazione avviene in maniera

specifica secondo le regole di appaiamento tra le basi.

Per quanto riguarda la temperatura, se bisogna separare

tutta la molecola di DNA, userò una T di 80-90°.

Se invece ho bisogno di separare una piccola parte di DNA, potrò utilizzare una temperatura più bassa.

N.B.

Infatti, in condizioni fisiologiche, la cellula deve denaturarsi solo in piccole porzioni, come ad esempio

prima della replicazione.

Questa caratteristica del DNA è stata usata molto nel mondo della biotecnologia (vedi PCR).

10

Compattamento DNA: problema topologico DNA

Il DNA procariotico è circolare, mentre quello eucariotico è lineare, ma in realtà non si trova praticamente

mai in questa forma nel nucleo. In entrambi i casi, il DNA assume tutta una serie di strutture che rende i

cromosomi stabili e impacchettati in delle forme (non casuali) che hanno una specifica relazione struttura-

funzione.

Ad esempio, nel caso dei procarioti, abbiamo una

struttura interna proteica, alla quale vengono ancorate

molecole di DNA superavvolte. Nel caso del cromosoma eucariotico invece, abbiamo vari

livelli di compattamento. Il primo è l’arrotolamento del DNA

sugli istoni, che porta alla formazione della cosiddetta “collana

di perle” costituito dai nucleosomi.

Questa collana di perle poi andrà a formare u