Biologia molecolare

Il Toxoplasma gondii e la sua dipendenza dalle vie sintetiche della cellula infettata

L'oxoplasma gondii non è in grado di utilizzare i nucleotidi della cellula infettata ed è perciò dipendente dalle vie sintetiche della stessa. Si può quindi agire sulla via metabolica delle pirimidine tramite l'uso di inibitori e bloccare così la replicazione dell'agente patogeno.

Degradazione delle pirimidine

Le pirimidine possono essere riciclate solo sotto forma di nucleosidi; il catabolismo di citosina β-alanina e uracile genera ione ammonio e CO2, mentre quello della timina vede, al posto della β-alanina, β-amminoisobutirrico. In generale, il processo di degradazione è il seguente:

1. Riduzione dell'anello pirimidinico tra C5 e C6;
2. Aggiunta di acqua tra N3 e C4 per permettere l'apertura dell'anello;
3. Rimozione del gruppo NH2 e ripristino della funzione carbossilica su C2;
4. Rimozione del gruppo carbossilico sotto forma di CO2 per formare:
• β-alanina per C e U;
• β-amminoisobutirrato per T.

I deossiribonucleotidi vengono sintetizzati per riduzione della funzione ossidrilica su C2’ da parte della ribonucleotide, ,reduttasi (RNR), un enzima tetramerico formato da due subunità formanti la subunità R1, e due formanti la-subunità R2, e che permette la sostituzione dell’OH con un H (viene mantenuta la configurazione dello zucchero)tramite reazioni radicaliche. Esiste una sola RNR, che sarà perciò non specifica per un singolo nucleotide; le RNRpossono essere classificate in tre differenti classi, tra le quali la più conosciuta e studiata è quella di classe 1: questasfrutta come processo una reazione radicalica portata avanti da un residuo di Tyr radicalica, stabilizzata da due atomi3+di Fe legati ad un atomo di O; in alcuni casi, Fe può esser sostituito da Mn. Le RNR di classe 2 utilizzano invece, comecofattore, la vitamina B12 sottoforma di cianocobalamina. Quelle di

classe 3, infine, lavorano insieme alla S-adenosilmetionina, ma questo tipo di RNR sono state trovate solo in alcuni organismi anaerobi.Il meccanismo radicalico è stato evidenziato grazie al fatto che, se si inibisce la formazione del radicale tramite l'uso diurea, l'enzima smette di funzionare. In generale, la reazione parte da un residuo di Tyr radicalica situato su una β-subunità la distanza tra questo residuo e il sito catalitico risulta però essere di 35 Å, lunghezza troppo elevata per permettere una reazione radicalica diretta; deve essere quindi presente un sistema di trasporto degli elettroni che veicoli il radicale da Tyr al sito catalitico. Durante la reazione, viene colpito per primo, dalla reazione radicalica, il C3'; il radicale viene poi trasferito al C2' per permettere la riduzione. Il donatore di H al C2' è una Cys situata nell'enzima; questa Cys non corrisponde ad una specifica ma può essere un

radicalica ritrasferisce il radicale alla Tyr riprendendo il suo H;9. Essendo che le due Cys si trovano ancora ossidate, grazie a glutaredoxina (Grx) o tioredoxina (Trx), il ponte viene ridotto e l'enzima rigenerato. Anche Grx e Trx dovranno essere, e verranno, rigenerati da sistemi secondari. I deossiribonucleotidi servono solo per la sintesi del DNA. L'attività dell'enzima viene regolata da:

• Sito di attività: informa l'enzima se deve lavorare o meno. Lega ATP, stimolando la produzione di dNTP, o dATP, inibendone invece la produzione. Ciò è dato dal fatto che, legando dATP, l'enzima si organizza in una struttura tetramerica che impedisce il trasferimento del radicale da Tyr al sito catalitico;
• Sito di specificità: lega ATP, dATP, dGTP e dTTP. A seconda del nucleotide che viene legato in questo sito, la specificità dell'enzima nei confronti di un determinato NTP varia.

I siti di specificità sono

situati vicini a quelli catalitici; l'informazione data dai siti di specificità viene veicolata al sito catalitico tramite un dominio flessibile, detto loop 2, il quale, tramite modifica conformazionale, permette la variazione di specificità dell'enzima nei confronti del ribonucleotide da ridurre. Per regolare il pool d dNTP, la cellula degrada selettivamente i dNTP grazie ad una proteina specifica quale la SMADH1, una deossiribonucleotide trifosfatasi che catalizza l'idrolisi dei dNTP a nucleosidi e gruppi P. A differenza degli altri nucleotidi pirimidinici, la timina, più propriamente 5-metiluracile, non viene prodotta direttamente dalla stessa biosintesi ma piuttosto viene ottenuta:

• Da dUDP: trasformato in dUTP, poi in dUMP e infine dTMP;
• Da dCDP: trasformato in dCMP, poi in dUMP e infine dTMP.

L'enzima che catalizza la formazione della timina è la timidilato sintasi, la quale si occupa di aggiungere il gruppo metilico.

• 5-fluorouracile: inibisce la timidilato sintasi;
• Metotrexato, aminopterina e Trimetoprim: inibiscono la DHF reduttasi.

Utilizzabili sono i dideossinucleotidi, i quali non possono essere utilizzati per la sintesi dei nucleotidi del DNA poiché non sarà possibile l'attacco radicalico al gruppo OH-3' durante la catalisi.

28/04/21 DNA

Doppia elica formata da due filamenti di acido polideossiribonucleico antiparalleli, ovvero disposti con le proprie direzioni 5'-3' in senso opposto. L'elica ha un diametro costante di circa 2 nm ed è lunga 1.6 milioni di nm (1.6 mm) (per E. coli). Il DNA eucariotico si trova compattato e ripiegato su determinate strutture dette istoni, mentre il compattamento nei procarioti avviene per avvolgimento della catena su sé stessa. Facendo un'analogia con le proteine, il DNA possiede una struttura primaria, costituita dalla sequenza di basi azotate, una struttura secondaria, costituita dall'appaiamento delle due strutture primarie, e una direzionalità, che va dal terminale 5' (N-terminale) a quello 3' (C-terminale).

Le basi azotate del DNA non si appaiano casualmente, ma lo fanno in base al numero e alla disposizione di legami H che riescono a formare tra di loro:

• A-T: 2 ponti H. Distanza di 1.1 Å
• C-G: 3 ponti H. Distanza di 1.0 Å

Il fatto che C e G formano un numero maggiore di legami H si traduce in una maggiore stabilità strutturale in regioni del DNA in cui sono presenti grandi quantità di queste basi; di contro, in questi punti sarà necessario un maggiore dispendio di energia per poter aprire la catena. La stabilità della struttura è data, oltre che dai legami H, anche da interazioni idrofobiche e di Van der Waals, le quali si vengono ad instaurare tra le basi azotate (dette complessivamente forze di stacking); la presenza di gruppi P e ribosio nello scheletro della molecola permettono invece di solubilizzare il DNA in acqua e allo stesso tempo anche di nascondere ad essa le basi idrofobiche. Le numerose cariche negative date dai gruppi P

nucleotidiche di inizio gene per la trascrizione genica. Tra i due solchi, l'unico che permette tale riconoscimento è il solco maggiore, poiché è l'unico sufficientemente α-elicalargo per permettere l'entrata di un di riconoscimento del fattore di trascrizione. Il riconoscimento avviene per interazione intermolecolare tra l'α-elica e le basi azotate del DNA. La composizione di basi del DNA varia da organismo a organismo, ma la quantità di basi di ogni singolo organismo rimane sempre la stessa e non viene modificata da fattori quali l'ambiente o l'alimentazione (q.tà di A = T e G = C). In struttura secondaria, il DNA può assumere 3 possibili conformazioni:

• DNA A: destrorso, corto e largo, con passi larghi 2.3 Å, costituito da 11.6 paia di basi per giro. Fu scoperto tramite estrazione del DNA in situazione di disidratazione cellulare. Il solco maggiore e quello minore non sono riconoscibili. Tutte le basi