Biologia Molecolare

TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI

Il processo di sintesi dell’RNA su uno stampo di DNA è chiamato trascrizione e l’attore primario

dell’intero meccanismo è un enzima chiamato RNA polimerasi.

Questo enzima è formato da varie subunità che dopo essersi legate al DNA lo apre, creando una

zona denaturata, chiamata bolla di trascrizione che poi si muove con l’enzima e il DNA si apre

via via che l’enzima procede e si richiude posteriormente.

Il processo di trascrizione comprende tre diverse fasi: inizio, allungamento e terminazione.

L’RNa prodotto non rimane appaiato al DNA ma si stacca dallo stampo a una distanza di pochi

nucleotidi da dove è stato aggiunto l’ultimo ribonucleotide alla catena.

Unità di Trascrizione

Quando la doppia elica del DNA viene aperta, l’RNA polimerasi usa uno solo dei due filamenti

come stampo: il filamento stampo è complementare il messaggero mentre l’altro, il filamento

codificante, ha la stessa sequenza del messaggero con le T al posto delle U.

L’RNA polimerasi si lega a particolari sequenze di DNA che si chiamano promotori e che sono

situate all’inizio del gene. Il promotore contiene anche il nucleotide da cui inizia la sintesi dell’RNA,

che viene definito sito d’inizio della trascrizione (TSS).

La trascrizione procede poi fino a una particolare sequenza chiamata terminatore e si definisce

unità di trascrizione il tratto di DNA che va dal promotore al terminatore.

Le sequenze di DNA che precedono il punto di inizio alla trascrizione sono dette “a monte”

(upstream) mentre quelle che seguono l’inizio sono dette sequenze “a valle” (downstream).

La sintesi della catena di RNA avviene in direzione 5’3’ e l’RNA polimerasi, a differenza della DNA

polimerasi, non ha bisogno di un innesco per sintetizzare un nuovo filamento di RNA.

Le tre fasi di trascrizione

L’RNA polimerasi per trascrivere un tratto di DNA che contiene uno o più geni procede come tre

distinti passaggi: la fase d’inizio, in cui avviene il riconoscimento del promotore e il DNA si apre

formando la bolla di trascrizione, la fase d’allungamento, in cui la polimerasi e la bolla si

muovono lungo il DNA e la fase di terminazione, in cui l’RNA polimerasi si arresta al terminatore,

il trascritto di RNA si dissocia dalla polimerasi e la bolla si richiude.

Il legame che si forma inizialmente tra l’RNA polimerasi e il promotore viene definito complesso

chiuso perché il DNA non è ancora stato aperto per formare la bolla. Una volta che l’enzima è

legato al promotore si ha l’apertura della bolla e la formazione del complesso aperto.

Inizialmente l’RNA polimerasi sintetizza, senza distaccarsi, un frammento di RNA che viene

rilasciato prima di raggiungere i 9 nt; questa sintesi abortiva è ripetuta più volte fino a quando,

superata la lunghezza di 9 nt, si forma un ibrido DNA-RNa sufficientemente stabile.

Durante la fase di allungamento l’enzima si muove lungo il filamento stampo in direzione 3’5’

sintetizzando la catena di RNA dal 5’ al 3’ e muove con se la bolla di trascrizione. L’enzima si

muove in media a una velocità di circa 50 nucleotidi al secondo.

Struttura delle RNA polimerasi

Le strutture delle RNA polimerasi procariotica e della RNA polimerasi II eucariotica hanno una

forma caratteristica “a pinza” che gli permette di agganciarsi al DNA ed è costituito da diverse

subunità.

L’RNA polimerasi batterica è costituita da 5 subunità:

- 2 subunità α, che sono responsabili dell’assemblaggio del complesso e contengono due

domini che hanno funzioni diverse: il dominio C-terminale si lega a una zona del promotore

chiamata UP-element, mentre il dominio n-terminale è responsabile dell’interazione con le

altre subunità dell’enzima

- una subunità β, che contiene il sito catalitico che sintetizza l’RNA e che contiene due atomi

di Mg²⁺

- una subunità β’, che si lega al DNA in maniera non specifica

- una subunità ω che ha la funzione di promuovere e mantenere stabile il complesso con un

meccanismo simile ai chaperoni molecolari.

Per legarsi in maniera specifica al promotore la polimerasi ha bisogno di una sesta subunità

₂

chiamata σ, andando a formare un oloenzima α ββ’ωσ. La subunità σ è costituito da quattro

regioni distribuiti sul nucleo enzimatico, in parte verso l’esterno, per riconoscere il promotore, e in

parte nella regione interna tra le due parti della “pinza”.

Il DNA è costretto dalla struttura a fare una piegatura di quasi 90° nella parte posteriore

dell’enzima che viene definita “muro”. Nella parte superiore c’è il foro di uscita dell’RNA e più a

destra il canale da dove esce il DNA che si riappaia alla fine della bolla.

Al centro c’è una struttura chiamata “timone” che contribuisce a tenere aperta la bolla e nella parte

inferiore una struttura chiamata “imbuto” permette l’entrata di ribuonucleosidi trifosfati.

Inizio della trascrizione nei procarioti

Nella fase di inizio l’RNA polimerasi non ha bisogno di un primer ma è in grado di iniziare

direttamente la sintesi dell’RNA sullo stampo.

Tecniche sperimentali hanno permesso di vedere che lo spazio occupato dalla polimerasi sul

promotore in presenza di nucleotidi è maggiore che in loro assenza, per dare spiegazione a questi

dati sono stati proposti tre possibili modelli:

- passaggio transiente, la polimerasi avanza per un breve tratto sintetizzando un corto

frammento abortivo di RNA e poi indietreggia

- a bruco, dove la polimerasi si allunga e si contrae sul DNA

- accartocciamento, dove la polimerasi inizialmente sta ferma sul promotore e ingloba

dentro sé un tratto di DNA che si “accartoccia” al suo interno.

Dati cristallografici hanno sostenuto quest’ultima ipotesi.

Promotori e fattore sigma

Il legame al DNA della RNA polimerasi non è specifico, mentre per trascrivere un determinato gene

l’enzima deve essere in grado di riconoscere il sito d’inizio con grande precisione. Questo

problema è risolto da due diversi elementi: la sequenza specifica del DNA chiamata promotore e

la subunità σ.

Il fattore σ riconosce il promotore e diversi fattori σ riconoscono diversi promotori.

⁷⁰

Il fattore σ riconosce per esempio un promotore costituito da due sequenze conservate lunghe

sei nucleotidi che si trovano in posizione -10 e -35 rispettivamente, separate da un tratto lungo da

17 a 19 nucleotidi. ⁷⁰

Comparando più di 300 promotori presenti nel genoma riconosciuti da σ si è potuto generare una

sequenza consenso che rappresenta gli elementi -10 e -35 più comuni. ₈₂ ₉₅ ₄₅ ₆₀ ₅₀ ₉₅

La sequenza consenso, anche detta Pribnow box è, sul filamento codificante, T A T A A T

dove i numeri indicano, in percentuale, la frequenza con la quale la base è presente. L’elemento

₈₂ ₈₄ ₇₈ ₆₅ ₅₄ ₄₅

-35 ha come consenso la sequenza T T G A C A .

⁷⁰

Esistono poi, per σ , alcuni promotori la cui struttura devia da quella tipica. Tre diversi tipi di

⁷⁰

promotore presenti nel genoma di E.coli sono: il promotore classico σ , un promotore implicato

nella trascrizione dei geni per l’RNA ribosomiale che contiene un elemento aggiuntivo a monte

⁷⁰

della sequenza -35 chiamato elemento UP e un altro gruppo di promotori σ che non contengono

la sequenza -35 ma, in compenso, hanno un elemento -10 esteso contenente una piccola

sequenza conservata a monte del -10.

Distacco della RNA polimerasi dal promotore e allungamento dell’RNA

Dopo la fase iniziale abortiva, alcuni cambiamenti di conformazione del fattore σ permettono lo

scorrimento dell’RNA polimerasi lungo il DNA e inizia la fase processiva di allungamento del

trascritto.

L’allungamento del trascritto, però, non è affatto un processo continuo e senza interruzioni,

esistono infatti fattori di allungamento come GreB e GreA che aumentano la velocità di

allungamento mitigando le pause e riattivando i complessi arrestati.

Questo meccanismo si basa sulla stimolazione dell’attività endogena di editing endonucleolitico

della polimerasi, mediante una lunga struttura coiled-coil di GreB che si inserisce nel canale di

ingresso dei nucletodi fino al sito attivo della polimerasi.

Quando un RNA polimerasi incontra dei danni sul DNA può anche arrestarsi del tutto e la

rimozione della polimerasi bloccata e il reclutamento degli enzimi per la riparazione sono promossi

dalla proteine TRCF. Topologia e trascrizione

La struttura topologica del DNA ha un ruolo importante nella trascrizione durante la fase di

allungamento.

Il DNA si apre davanti all’enzima e si richiude dietro.

Questo fenomeno genera superavvolgimenti positivi davanti e superavvolgimenti negativi dietro

alla polimerasi e viene definito modello dei domini gemelli per la trascrizione o twin domain

model.

Ogni 10 nucleotidi che vengono polimerizzati si genera un superavvolgimento positivo a valle e un

superavvolgimento negtivo a monte.

Se si accumulano troppi superavvolgimenti positivi, il DNA diventa troppo compatto e la

trascrizione si arresta.

Terminazione della trascrizione nei procarioti

La trascrizione termina quando l’RNA polimerasi raggiunge delle sequenze specifiche sul DNA

chiamate terminatori.

Esistono due meccanismi diversi per terminare la trascrizione: in un primo caso, sequenze

denominate terminatori intrinseci inducono la polimerasi a staccarsi dal complesso e a rilasciare

la catena di RNA prodotto, senza l’ausilio di alcun fattore aggiuntivo. Nel secondo caso,

denominato terminazione Rho-dipendente, la sequenza di terminazione non è in grado di

promuovere da sola la dissociazione del complesso, ma necessita dell’azione della proteina Rho.

Terminatori Intrinseci

Un tipico terminatore intrinseco, detto anche Rho-indipendente, è rappresentato da un tratto di

DNA che contiene delle sequenze palindromiche ricche in G-C seguite da un tratto di 8-9 nucleotidi

ricco in A e T. l’RNA trascritto forma nella regione palindromica una forcina che destabilizza il

complesso trascrizionale.

Inoltre si pensa che la forcina induca la dissociazione della regione ibrida DNA-RNA e un

cambiamento conformazionale di alcuni domini dell’RNA polimerasi,

Terminatori Rho-dipendenti

In vivo Rho (ρ) si associa all’RNA nascente in una regione ricca di citosine lunga circa 40

nucleotidi denominata sito di utilizzo di Rho (rut).

Questo sito si trova a valle della regione codificante e una volta leg