Biologia Molecolare

Codice genetico

Scoperta del DNA

Il medico e il microbiologo inglese Griffith stava studiando la possibilità di fare un vaccino per prevenire la polmonite e per i suoi studi utilizzava due ceppi del batterio Streptococcus pneumoniae: il ceppo R e il ceppo S (R e S stanno per rough e smooth, cioè “rugoso” e “liscio”, a seconda dell’appartenenza della colonia di batteri cresciuta in una piastra di agar).

Il ceppo R, che è privo di una capsula polisaccaridica, non causa polmonite. Al contrario, il ceppo S, che ha una capsula polisaccaridica che lo protegge dalle difese immunitarie dell’animale, causa polmonite e successiva morte nei topi in cui viene iniettato. Quando il ceppo S inattivato viene mescolato col ceppo R e i due sono iniettati insieme nei topi, questi contraggono polmonite e muoiono. Griffith scoprì che il ceppo R normalmente non patogeno acquisisce la capsula polisaccaridica e mantiene questa caratteristica fenotipica per molte generazioni. Griffith ipotizzò che un qualcosa del ceppo S inattivato penetrasse nel ceppo R convertendolo in un S virulento. Lui chiamò questo qualcosa principio trasformante.

Avery per capire quali componenti macromolecolari presenti nell’estratto di batteri del ceppo S (proteine, lipidi, polisaccaridi, DNA e RNA) è l’effettivo responsabile della trasformazione fecero degli estratti dai batteri patogeni che distribuirono in varie provette. Ciascuna provetta conteneva un diverso reagente per la degradazione specifica: tripsina che digerisce le proteine, RNasi che degrada l’RNA, DNasi che degrada il DNA ecc. A tutte le provette venivano aggiunti i batteri rugosi non patogeni che dovevano essere trasformati. Solo l’eliminazione del DNA impediva la trasformazione dei batteri da rugosi a lisci e patogeni, dimostrando che era questa molecola il principio trasformante.

Nel 1952 un esperimento di tipo completamente diverso confermò il DNA come materiale genetico. L’esperimento del frullatore fu eseguito da Hershey e Chase. Un fago è un piccolo virus che infetta i batteri e consiste di un capside proteico che ne racchiude il materiale genetico. Quando un fago infetta un batterio, vi inserisce il materiale genetico mentre il capside rimane al di fuori. Hershey e Chase marcarono radioattivamente il DNA del fago con fosforo radioattivo e le proteine del capside con zolfo radioattivo. Subito dopo l’infezione del batterio con i fagi marcati nel brodo di coltura, questo veniva frullato con un normale frullatore, che provocava il distacco del capside fagico vuoto dai batteri in cui era entrato il materiale genetico del fago. La successiva centrifugazione consentì di verificare che il DNA marcato con il ³²P radioattivo si trovava all’interno dei batteri, mentre le proteine ³⁵S erano rimaste fuori.

Struttura degli acidi nucleici

Gli acidi nucleici, DNA e RNA, sono costituiti da catene polinucleotidiche cioè polimeri lineari di unità chiamate nucleotidi. I nucleotidi sono molecole costituite da tre componenti: uno zucchero pentoso, una base azotata, uno o più gruppi fosfato.

Nel caso del DNA lo zucchero è il deossiribosio, mentre nell’RNA è il ribosio. I due zuccheri differiscono per un gruppo OH presente sulla posizione 2 del ribosio e che manca nel deossiribosio. Le basi azotate che si trovano negli acidi nucleici naturali sono di due tipi: purine (a doppio anello eterociclico) e pirimidine (a singolo anello).

Esistono due purine, adenina (A) e guanina (G), presenti sia nel DNA che nell’RNA, e tre tipi di pirimidine, citosina (C), timina (T) e uracile (U), di cui la citosina è comune a DNA e RNA, mentre la timina è componente del solo DNA trovandosi al suo posto l’uracile nell’RNA. La differenza tra uracile e timina è la presenza di un gruppo metilico in posizione 5 dell’anello pirimidinico.

Quando una delle suddette basi è legata alla posizione 1 di uno zucchero, abbiamo i nucleosidi, che prendono il nome di adenosina, guanosina, citidina, timina e uridina. Ai nucleosidi possono essere legati uno o più gruppi fosfato e, in tal caso, prendono il nome di nucleotidi: questi sono chiamati acido adenilico, acido guanilico ecc. Il gruppo può trovarsi legato al carbonio 5’ dello zucchero oppure al carbonio 3’. I nucleotidi possono contenere un solo gruppo fosfato oppure due o tre.

I nucleotidi che vengono utilizzati come substrato per la sintesi del DNA e dell’RNA hanno tre gruppi fosfato legati in serie sulla posizione 5’ vengono indicati con α, β e γ. L’abbreviazione per i nucleotidi è la lettera che indica la base (A, G ecc) preceduta da una lettera “d” minuscola nel caso la base sia legata al deossiribosio, e seguita dall’indicazione del numero di gruppi fosfato: MP (monofosfato), DP (difosfato) o TP (trifosfato).

Lo scheletro della catena polinucleotidica è costituito dall’alternanza di zuccheri e di gruppi fosfato, e le basi sporgono lateralmente da questo scheletro. Tra uno zucchero e l’altro c’è solo un gruppo fosfato e che quindi si tratta di un polimero di nucleosidi monofosfato: ciascun gruppo fosfato forma un legame estere con il carbonio 5’ di uno zucchero e un secondo legame estere con il carbonio 3’ dello zucchero successivo; il legame è chiamato legame fosfodiesterico e conferisce una sorta di polarità alla catena polinucleotidica la quale mostra due diverse estremità. Questa polarità 5’→3’ delle catene polinucleotidiche è molto importante.

Chargaff si era accorto che preparazioni di DNA di origine diverse possono avere un differente contenuto delle quattro basi A, C, G e T e concluse che, mentre organismi di diverse specie possono avere DNA con composizione in basi differente, il DNA preparato da diversi tessuti od organi della stessa specie ha sempre la stessa composizione in basi. La regola di Chargaff dice che: la percentuale di A è sempre uguale alla percentuale di T e la percentuale di C è sempre uguale alla percentuale di G. Questa regola non è valida nel caso dell’RNA.

Scoperta della doppia elica

Crick e Watson nel 1953 capirono che se si appaiava A con T e G con C e disponevano i due filamenti zucchero-fosfato all’esterno e di sistemare le basi affacciate all’interno ciò permetteva di giustificare la regolarità del diametro di una doppia elica.

Parametri strutturali della doppia elica

Secondo il modello proposto da Crick e Watson le coppie di basi sono disposte quasi perpendicolarmente rispetto all’asse della doppia elica e vi è sempre l’appaiamento tra una A e una T e tra una G e una C. Nella coppia di basi A-T si ha la formazione di due legami a idrogeno, mentre la coppia G-C forma tre legami a idrogeno. Un'altra caratteristica importante della doppia elica del DNA è che le due catene polinucleotidiche sono “antiparallele”.

La doppia elica (duplex) del DNA ha una struttura regolare, destrorsa, compie un giro completo ogni 34 Å e ha un diametro di circa 20 Å. La distanza tra due coppie di basi adiacenti è di 3,4 Å e ci sono, quindi, circa 10 coppie di basi per ogni giro di elica. L’elica presenta un’asimmetria dovuta alla posizione delle molecole di deossiribosio ai lati delle basi. Questa asimmetria genera nella doppia elica due solchi di dimensioni diverse, detti appunto solco maggiore e solco minore. Quasi tutte le proteine che si legano specificatamente al DNA hanno dei domini ad α-elica che riconoscono le sequenze esposte nel solco maggiore.

La stabilità della doppia elica dipende da varie forze. I due scheletri che contengono gli atomi di fosforo carichi negativamente tendono a respingersi, i legami H tra le basi contribuiscono alla stabilità della doppia elica e questa stabilità è aumentata dall’effetto idrofobico dovuto all’impilamento (stacking) delle basi. Questa sovrapposizione è stabilizzata dalla idrofobicità delle basi stesse, che, così impilandosi, mantengono minimo il contatto con l’acqua. La stabilità della doppia elica in soluzione non è uguale per tutti i DNA. Infatti, la stabilità dipende dalla composizione in basi del DNA: un DNA pieno di coppie C-G è più stabile di un DNA ricco in coppie A-T. Inoltre, dipende dalla particolare sequenza di nucleotidi del DNA: infatti l’effetto idrofobico dipende dall’impilamento.

Strutture alternative e strutture superiori degli acidi nucleici

Strutture alternative

La struttura a doppia elica proposta da Crick e Watson è la situazione in vivo e viene identificata come forma B. In varie condizioni strutturali la doppia elica di DNA può assumere altre strutture. Se si riduce l’umidità in cui si trova la fibra di DNA, esso assume la forma A, l’elica è destrorsa ma le coppie di basi presentano una maggiore angolatura rispetto al piano perpendicolare all’asse della doppia elica, ci sono 11 basi per ogni giro di elica e l’elica presenta una forma un po’ “tarchiata” rispetto alla forma B. La forma Z presenta un’elica sinistrorsa e un’elica più “magra e allungata” rispetto alla forma B. Una piccola percentuale del DNA presente nelle cellule si trova in forma Z e la causa che genera il DNA Z è il cambiamento di orientamento del legame glicosidico tra la guanina e il deossiribosio. Nella forma B lo zucchero e la base sono presenti nella conformazione “anti” mentre nella forma Z si presentano nella formazione “sin”.

In casi molto particolari si possono formare anche delle regioni a tripla elica. Un tratto di DNA duplex ragionevolmente lungo (20-30 coppie di basi) che ha un filamento composto di sole pirimidine e l’altro di purine, può accogliere nel solco maggiore una terza catena polinucleotidica composta di sole pirimidine. Questa catena polipirimidinica ha una polarità 5’→3’ uguale a quella della sequenza di purine, e quindi inversa rispetto alla sequenza pirimidinica della doppia elica. Le purine formeranno legami H oltre che con le pirimidine del duplex anche con quelle della molecola extra. Questi particolari legami idrogeno non canonici si chiamano appaiamenti di Hoogsteen.

Quartetti di G

Una struttura si può formare da quattro tratti di DNA o RNA a singolo filamento che contengano ciascuno 3 o più G consecutive. I quattro tratti di DNA si affiancano l’uno all’altro a formare una struttura a quattro filamenti (quadruplex) tenuti insieme da legami idrogeno tra le G. Questi legami a idrogeno sono del tipo “appaiamenti di Hoogsteen”. La situazione più comune è quella dei quartetti di G intramolecolari, in cui i tratti di DNA contenenti le serie di G si trovano tutti su un singolo filamento che, ripiegandosi tre volte su se stesso, forma un quadruplex. Gli orientamenti 5’→3’ dei quattro filamenti sono due a due antiparalleli e si possono trovare in vivo.

Strutture cruciformi e strutture a forcina

Quando in un quadruplex di DNA o RNA sono presenti, adiacenti o a breve distanza, due copie della stessa sequenza in orientamento opposto, queste vengono chiamate ripetizioni invertite, le due ripetizioni invertite costituiscono una sequenza palindromica che può assumere una struttura cruciforme. Le sequenze ripetute costituiscono due “steli”, mentre le basi che separano le due sequenze ripetute non hanno modo di appiattirsi e formano due “anse”. Un acido nucleico a singolo filamento che abbia la stessa sequenza di uno dei due filamenti del duplex appena descritto potrà assumere una struttura con uno stelo a doppia elica e un’ansa. In questo caso si ha una struttura a forcina.

Topologia del DNA e DNA Topoisomerasi

Il DNA si attorciglia su se stesso a formare strutture complesse, dette superavvolgimenti. Queste strutture “topologiche”, se non controllate, possono interferire con l’espressione dei geni. Lo stato superavvolto del DNA contiene energia che è utilizzata per aprire i due filamenti. Per controllare il grado di superavvolgimento del DNA che, se è eccessivo, può essere dannoso è necessario che il DNA venga tagliato, su uno o entrambi i filamenti, fatto ruotare e infine rilegato. Per svolgere questo compito, tutti gli organismi hanno selezionato una classe di enzimi che si chiamano topoisomerasi.

Esistono due tipi di superavvolgimenti: quello che vediamo nel DNA nudo si chiama avvolgimento plectonemico, quello che invece si ha quando il DNA è avvolto intorno all’ottamero istonico si chiama avvolgimento toroidale e da un punto di vista topologico è equivalente. Molecole di DNA circolari covalentemente chiuse di uguale lunghezza ma che differiscono solo per il numero di legame, sono definite topoisomeri. I topoisomeri che differiscono anche per un solo numero di legame o nodi con vari incroci possono essere risolti mediante elettroforesi su gel di agarosio.

DNA topoisomerasi

Lo stato topologico del DNA deve essere tenuto sotto controllo e per fare questo la doppia elica deve essere aperta e richiusa temporaneamente grazie a enzimi specifici chiamati DNA topoisomerasi, che hanno la caratteristica comune di creare un taglio transiente sul DNA, con una reazione di transesterificazione fatta dal suo gruppo OH. Le DNA topoisomerasi si differenziano tra loro per il meccanismo di azione con il quale cambiano la topologia del DNA:

• Rotazione controllata, l’enzima introduce una singola rottura su un filamento a doppia elica e permette la rotazione su se stesso del filamento intatto per un numero variabile di giri.
• Strand passage, consiste nel creare una rottura singola o a doppio filamento sul DNA, allargare l’interruzione prodotta e far passare l’altro filamento o la doppia elica attraverso la rottura che successivamente verrà risaldata, è tipica delle topoisomerasi di tipo I.
• A doppio cancello, in questo processo il filamento tagliato chiamato T (transport) del DNA entra nella parte superiore dell’enzima, che si apre per accoglierlo; dopo l’apertura della doppia elica del segmento G (gate), il segmento di T attraversa tutto l’enzima, che si apre nella parte inferiore, rimuovendo in questa maniera due superavvolgimenti alla volta. È tipico delle topoisomerasi di tipo II.

Struttura dell'RNA

L’RNA da un punto di vista chimico è molto simile al DNA, con la differenza fondamentale che lo zucchero che costituisce la sua impalcatura è il ribosio, che in posizione 2’ ha un gruppo ossidrilico (OH). La presenza di questo gruppo impedisce all’RNA di assumere una conformazione stabile a doppia elica di tipo B. L’RNA è generalmente una catena a singolo filamento, ma è in grado di formare tratti a doppia elica con una conformazione simile al DNA A. L’altra differenza è che contiene l’uracile al posto della timina.

L’RNA ha molteplici funzioni all’interno della cellula e questo è dovuto al fatto che la sua struttura può assumere conformazioni molto diverse, costituite da anse, forcine e gemme. Questo è possibile per due ragioni: la prima è che le basi possono ruotare e ripiegarsi liberamente intorno al legame fosfodiesterico, la seconda è che le basi dell’RNA possono impegnarsi in appaiamenti non soltanto di tipo Watson-Crick, cioè A-U, G-C, ma anche Hoogsteen. La presenza dell’ossidrile in posizione 2’ impedisce la formazione di una doppia elica di tipo B e favorisce la formazione di un’elica di tipo A dove il solco minore è più largo e accessibile e il solco maggiore più stretto e profondo. Questa situazione favorisce interazioni di legami idrogeno con il solco minore e rende impossibile la formazione di complessi stabili con proteine nel solco maggiore, come avviene per il DNA. La presenza dell’OH in 2’, inoltre, rende la molecola dell’RNA molto reattiva perché il gruppo ossidrilico tende a fare un attacco nucleofilo sullo scheletro zucchero-fosfato degli acidi nucleici. Questa caratteristica permette all’RNA di avere funzioni catalitiche.

Le strutture secondarie dell’RNA possono essere predette con una buona approssimazione. Mentre in genere le anse destabilizzano la struttura, alcune possono essere molto stabili grazie alle interazioni idrofobiche di impilamento che si determinano tra le basi e che hanno un contenuto energetico molto vantaggioso, come per esempio nel tetraloop formato dalla sequenza GC-UGUU-GU. Gli appaiamenti tra le basi possono essere formati anche in posizioni non contigue, dando vita a strutture complesse definite pseudonodi. Un altro tipo di ripiegamento e interazioni intramolecolare dell’RNA è il motivo A-minore che si trova per esempio nei ribozomi di gruppo I e negli RNA ribosomiali. Il motivo A-minore stabilizza i contatti tra eliche di RNA, interazioni tra anse ed eliche e la conformazione di giunzioni e ripiegamenti molto stretti. Questo tipo di struttura terziaria è la più abbondante nelle interazioni che si formano nella subunità grande del ribosoma.

La risoluzione mediante cristallografia a raggi X di RNA strutturati ha permesso di definire e catalogare molti tipi di ripiegamenti caratteristici dell’RNA:

• Ribose-zipper domain (chiusura lampo di ribosio) che si forma quando, in un ripiegamento di una lunga regione a doppia elica, due solchi minori si trovano in contatto e il 2’OH di un’elica interagisce con l’ossigeno 2 di una base pirimidinica o con l’azoto 3 di una purina. Guardando il modo in cui si ripiega si può paragonare questa molecola alle proteine e gli RNA che hanno una funzione catalitica si definiscono ribozomi.

Proprio per questa capacità dell’RNA di formare strutture diverse, si sono generate molecole di RNA che sono in grado di adattarsi.