Biologia molecolare

POSSIBILI DOMANDE ESAME:

Perché la telomerasi usa RNA- Qual è il problema della replicazione terminale

Tecnica PCR

Consiste nel promuovere un’amplificazione di DNA partendo da pochissime molecole.

Il principio è molto semplice: bisogna denaturare un pezzo di DNA, poi si deve favorire l’appaiamento tra primers disequenza nota e il DNA che si vuole amplificare, infine si fa una reazione in vitro di sintesi di DNA.

In generale, la sintesi di DNA in vitro prevede l’utilizzo di uno stampo che si vuole replicare, deossinucleotiditrifosfati, DNA polimerasi e primers. Qui si inducono tanti cicli di amplificazione che prevedono denaturazione (altatemperatura) e rinaturazione (bassa temperatura), quindi ci sono blocchi termostatici che cambiano temperaturamolto velocemente.

A questo proposito è stata utilizzata una DNA polimerasi termoresistente che proviene da organismi termofili, cioèche vivono ad altissima temperatura, e questa DNA polimerasi

funziona anche ad alta temperatura. Si parte da un frammento genomico che si vuole amplificare, lo si denatura, poi si usano due primers di sequenza nota, si aggiunge la DNA polimerasi insieme a deossinucleotidi trifosfati e la DNA polimerasi amplificherà partendo dal 3' OH. Dopodiché i frammenti di neosintesi vengono denaturati dallo stampo, poi lo stampo viene riamplificato come prima e lo stesso succede per il frammento di neosintesi. Lo stampo originale verrà appaiato da un frammento di neosintesi, e così via... sono cicli continui. In questo modo si possono amplificare anche molecole di DNA in quantità irrisoria e non ci sono limiti sul quanto si può amplificare: questa tecnica è stata utilizzata anche a livello diagnostico, all'inizio aveva dei problemi perché la tecnica non era perfetta ma ora vi sono anche DNA polimerasi in grado di modificare gli errori mentre sintetizzano. Riparazione del DNA Uno dei problemi

La sintesi del DNA replicativo, che avviene ogni volta che la cellula si replica, presenta un'importante caratteristica: non è perfetta. Le DNA polimerasi commettono errori con una certa frequenza, ad esempio possono accoppiare la G invece della T con l'A, causando una distorsione nella doppia elica. Fortunatamente, durante la sintesi del DNA, sono presenti attività riparative mediate dalla stessa DNA polimerasi. Alcune DNA polimerasi hanno la capacità di correggere gli errori (Pol alfa no, delta ed epsilon sì), cioè incorporano un nucleotide errato, tornano indietro, rimuovono il nucleotide sbagliato e ricominciano quando il nucleotide corretto è presente.

Inoltre, abbiamo dei sistemi di riparazione specializzati per correggere errori come l'incorporazione errata di un nucleotide o danni al DNA che causano distorsioni. Questi enzimi riconoscono la zona danneggiata, incidono un pezzo della doppia elica, rimuovono la zona danneggiata creando un gap e successivamente si ha...

la sintesi del DNA che rimuove il pezzo malato eviene risanizzato un pezzo di DNA fedele allo stampo che viene ligato. Questi sistemi di riparazione sonoindipendenti dal replisoma, ma si chiamano di solito Nucleotide Excision Repair (NER) oppure Base Excision Repair(BER), dipende da quale sistema di riparazione recide, rimuove e sintetizza.

Un altro sistema di riparazione, tipico dei sistemi semplici: in questo caso abbiamo 2 T che vengono dimerizzate dairaggi ultravioletti. Esiste un enzima che si chiama fotoliasi in grado di revertire questa dimerizzazione, esso vieneattivato dalla luce e in questo modo il dimero di timina ritorna a formare 2 timine separate. Questo sistema diriparazione è molto efficiente nei procarioti, in cellule umane non esiste. È un sistema reversibile.

Un altro sistema che consente di rimuovere dei gruppi delle basi per ripristinare una situazione normale. Questigruppi potrebbero estorcere la doppia elica, vengono quindi rimossi e si ripristina

una situazione normale. Qualsiasi appaiamento normale determina una distorsione della doppia elica con ovvie conseguenze, quindi questo può essere sia un segnale che un problema (poiché la distorsione è un problema). Ci sono diversi sistemi di riparazione in una cellula, questi sono coordinati dal ciclo cellulare e l'idea è sempre quella di riparare prima di iniziare il ciclo poiché se no c'è il rischio per la cellula di trasferire alla progenie DNA malato.

Riassumendo:

• quali sono alcuni esempi di sistemi di riparazione del DNA

C'è un sistema di riparazione accoppiato alla replicazione, mediato dalle DNA polimerasi stesse con l'attività di correttori di bozza.

Ci sono sistemi di riparazione per incisione e rimozione del pezzo malato, questi sistemi si chiamano NER: sistemi di riparazioni in cui il danno è indotto dai raggi ultravioletti e viene rimosso grazie a enzimi specializzati come la fotoliasi.

Che rimuovono gruppi che determinano la distorsione della doppia elica. Uno dei danni peggiori che si possono verificare è la rottura del doppio filamento. In questo caso c'è una forcareplicativa che sta procedendo, un singolo filamento della doppia elica si rompe: la catena di neosintesi li si interrompe e forma un moncone, risulta così che se quel pezzo è un centromero viene mantenuto, se il pezzo successivo alla rottura non viene replicato viene perso (e quindi si perde un intero pezzo di cromosoma). Diventa quindi una rottura a doppio filamento (DSB: double strand break) che viene riparato mediante sistemi di riparazione specializzati come la ricombinazione.

Perché è importante riparare il DNA prima della sintesi o della mitosi? Perché bisogna prevenire che la progenie erediti DNA mutato.

Quali sono le implicazioni fondamentali di questi sistemi? Questi sistemi proteggono la stabilità del genoma, ovvero l'integrità.

del DNA, qualsiasi evento che disturbi questi sistemi di riparazione determina un'insorgenza di mutazioni e, ovviamente, determina anche l'insorgenza tumorale: ci sono una serie di patologie ereditarie che causano ad esempio predisposizione all'insorgenza tumorale e che sono causate da mutazioni in geni coinvolti nella riparazione del DNA, ci sono situazioni che causano con una certa frequenza tumore al Colon, oppure situazioni che causano predisposizione all'insorgenza di tumore al seno. Quindi è fondamentale che questi sistemi di riparazione funzionino sempre per prevenire l'insorgenza di mutazioni e quindi tumori.

Trascrizione del DNA

La trascrizione è quel processo che prevede che la cellula copi il DNA in RNA. Non tutto il DNA viene trascritto, quello che viene trascritto di solito contiene un'informazione importante.

Qui parliamo di RNA polimerasi che catalizza la formazione di RNA messaggeri, quelli che trascrivono i geni veri.

L'RNA polimerasi si aggancia a un promotore, dopodiché si apre la doppia elica e si produce il piccolo pezzo di RNA: questo processo è molto sfavorito a livello energetico e all'inizio viene abortito molto spesso, poi diventa produttivo, quindi l'RNA polimerasi procede e si forma un trascritto maturo.

La differenza principale in procarioti è che esistono delle subunità che favoriscono l'associazione dell'RNA polimerasi al promotore. Questo è un tipico promotore procariotico, la numerazione negativa vuol dire che è a monte della sequenza trascritta (che parte dalla freccia verso destra), questa proteina che si chiama sigma favorisce l'associazione dell'RNA polimerasi con il promotore: questa è la prima reazione che avviene.

Terminazione della trascrizione: verso la fine della trascrizione vi è una regione che è trascritta in poli U, questo trascritto subisce la formazione della

struttura secondaria ed è proprio questa struttura secondaria a favorire la terminazione della trascrizione. Vediamo più in dettaglio cosa accade negli eucarioti:

- Cos'è il TATA box

Negli eucarioti nel promotore è presente una regione chiamata TATA box (TATA sta per le basi della sequenza). Il TATA box viene di solito riconosciuto dal TBP (proteina) e da un fattore di trascrizione che si chiama TF2D (2 vuol dire che è l'RNA polimerasi 2). L'importante è che l'RNA polimerasi negli eucarioti che fa gli RNA messaggeri sia l'RNA polimerasi 2 (la 1 trascrive l'RNA ribosomiale, mentre la 3 trascrive piccoli RNA e tRNA).

Quello di cui parleremo tratta solo l'RNA polimerasi 2, quella che trascrive i geni veri e propri.

Dopo il TF2D si associa un altro fattore: il 2B. A questo punto l'RNA polimerasi è in grado di associarsi. Essa ha una coda chiamata CTD che abbraccia tutti i fattori che si associano.

Successivamente subentra una proteina che si chiama TF2H, è una chinasi che fosforila il CTD, questo evento di fosforilazione è come se desse un calcio all'RNApolimerasi che incomincia a polimerizzare. Anche in questo caso i primi nucleotidi vengono abortiti finché l'RNApolimerasi non riesce a lavorare in maniera efficiente e si riesce a produrre l'RNA messaggero. Quindi: c'è il TATA box e ci sono dei fattori che riconoscono il TATA box, successivamente l'RNA polimerasi si associa. - che compito ha il TF2H? Il TF2H fosforila il Carbossil-terminal-domain che determina l'evento iniziale della sintesi dell'RNA. Non tutti i geni vengono trascritti sempre: ci sono alcuni geni specifici che vengono trascritti in certi tessuti, piuttosto che in determinati momenti della vita della cellula, oppure in seguito a stress (ad esempio in seguito a danni al DNA o segni ormonali). A monte di ogni gene (al di là del promotore che

è in prossimità del gene da trascrivere) ci sono sequenze che possono svolgere il ruolo di sequenze regolative (ad esempio perdono il nome di Enhancer oppure di sequenze attivatrici) e sono riconosciute da proteine particolari che sono gli attivatori trascrizionali che hanno una parte che riconosce la sequenza attivatrice, e un’altra parte che media l’associazione con un grosso complesso di proteine che si chiama complesso mediatore e che determina l’associazione fra l’RNA polimerasi e le sequenze regolatrici. Queste sequenze attivatrici possono essere localizzate anche molto distanti dal gene da trascrivere, il DNA in questo caso subisce una curvatura che è fondamentale per favorire l’associazione fisica tra attivatore trascrizionale, complesso mediatore e RNA polimerasi. Questa curvatura può essere un classico fenomeno di bending. L’RNA polimerasi ha cominciato a trascrivere, l’RNA messaggero viene modificato mediante

capping, successivamente l'RNA subisce splicing e poi viene poliadenilato. Tutti questi processi post-trascrizionali, avvengono contemporaneamente alla sintesi del trascritto, quindi c'è una sorta di accoppiamento tra RNA polimerasi, apparato del