Biologia molecolare

Struttura del DNA e topologia del DNA

Si tratta di un filamento singolo di DNA: lo scheletro è costituito da legami fosfato e poi vi sono le basi azotate che rappresentano l’informazione vera e propria. Alcune basi (adenina e guanina) sono più grandi di altre, per questo motivo l’appaiamento tra un’elica e l’altra è vincolato: deve avvenire in modo tale che non ci sia distorsione della doppia elica, quindi adenina-timina e citosina-guanina per mantenere un ingombro costante.

Le due catene si appaiano mediante legami idrogeno: l’appaiamento A-T prevede la formazione di 2 legami idrogeno, mentre l’appaiamento C-G 3 legami idrogeno. La distanza tra i due filamenti è sempre costante e viene mantenuta costante anche durante la fase di sintesi, ovvero replicazione.

I mattoni con cui viene polimerizzata la catena di DNA sono i deossinucleotidi trifosfati; una volta polimerizzata metterà insieme dei deossinucleotidi monofosfati. La reazione di polimerizzazione del DNA è una reazione biochimicamente sfavorita: dalla reazione viene liberato pirofosfato e l’idrossiadenosina monofosfato viene incorporata a formare un nuovo intermedio della sintesi di DNA. Per favorire questa reazione essa è accoppiata ad una pirofosfatasi che converte i pirofosfati in fosfati. In questo modo uno dei prodotti viene convertito in un fosfato e quindi spinge l’equilibrio verso la formazione del polimero.

• Sintesi semiconservativa: il DNA parentale veniva dissociato in due eliche, ognuna delle quali diventava parte di una nuova molecola di DNA insieme ad una catena di neosintesi. Ci sono casi (ricombinazione) che prevedono anche porzioni di sintesi dispersiva.

La catena di DNA nella sua struttura nativa prevede i due filamenti appaiati. I due filamenti si appaiano grazie ai ponti idrogeno, ma si può interferire con questo appaiamento, ad esempio, alzando la temperatura: così si fornisce energia, sotto forma di calore, che può essere utilizzata per denaturare la doppia elica. Il processo inizierà da A-T (poiché hanno solo 2 legami idrogeno), finché poi non si otterrà una denaturazione completa.

Si può fare, però, anche il contrario: una volta denaturato completamente il DNA, i 2 filamenti singoli si possono riappaiare riducendo la temperatura. Quindi è un processo reversibile.

Cos’è il numero di legame

Ci sono dei livelli di attorcigliamento molto complessi che vengono descritti dalla topologia.

Una molecola di doppio filamento di DNA circolare, covalentemente chiusa è una molecola planare, ovvero che si inserisce uniformemente su un piano; ha attorcigliamenti semplici, il cui numero si identifica con T (twisting number). Se abbiamo 360 paia di basi avremo T=36. L (linking number) è la sommatoria di due parametri: T (numero di attorcigliamenti semplici) e W (numero di superavvolgimenti della doppia elica).

Se possiamo definire 2 tipi di superavvolgimenti, uno che avviene nel senso della direzione della doppia elica (avvolgimento positivo) e uno che è in direzione contraria (avvolgimento negativo), e abbiamo la stessa molecola precedentemente analizzata di 360 nucleotidi, il numero di avvolgimenti simboli è 36, ma in questo caso si possono contare 4 superavvolgimenti negativi. Quindi L = 36 – 4 = 32. Famiglie termiche, ovvero famiglie di topoisomeri, che si possono convertire l’una l’altra semplicemente modulando la temperatura.

Cosa sono le topoisomerasi

Ogni qual volta il numero di legami cambia significa che è stata introdotta una rottura nella doppia elica, non si può cambiare il numero di legami senza rompere la doppia elica e per questo ci sono enzimi specializzati. Questi enzimi si chiamano topoisomerasi e ne esistono principalmente due tipi: topoisomerasi di tipo 1 o tipo 2.

Differenza topoisomerasi di tipo 1 e topoisomerasi di tipo 2

In generale la topoisomerasi di tipo 2 agisce sempre solamente sul doppio filamento, ha bisogno di ATP ed è l’unica in grado di convertire DNA rilassato in DNA superavvolto; il passaggio contrario, da DNA superavvolto a DNA rilassato rilascia energia e il taglio può essere effettuato anche da topoisomerasi di tipo 1, poiché essa non usa energia. Quando si rompe un singolo filamento ad opera della topoisomerasi di tipo 1 la rottura prevede che il singolo filamento non sia più covalentemente legato. Non vi è perdita d’informazione ma un filamento può ruotare intorno all’altro e questo può cambiare il numero di legami.

I topoisomeri e le capacità della molecola di DNA di subire cambiamenti topologici è fondamentale per tutti i processi che hanno a che fare con le dinamiche della cromatina (trascrizione, ricombinazione, condensazione). La topologia è fondamentale perché il DNA deve subire delle trasformazioni topologiche nello spazio per passare da uno stato all’altro dei processi.

In quali processi biologici le topoisomerasi funzionano

Da notare che questi enzimi quando tagliano non lasciano mai il moncone, rimangono sempre agganciati. Questi enzimi sono molto importanti per la replicazione del DNA e per il ciclo cellulare e sono stati utilizzati come bersagli farmacologici da moltissimi anni per terapie antitumorali: molti farmaci utilizzati in chemioterapia sono inibitori delle topoisomerasi inibiscono questi enzimi con l’idea che inibendo la replicazione delle cellule tumorali si possa sconfiggere il tumore, il problema è che questi inibitori bersagliano anche le cellule normali.

La molecola rilassata covalentemente chiusa è sempre quella che viene rallentata durante la corsa elettroforetica perché il suo ingombro sterico le impedisce di correre efficientemente tra le maglie della gelatina. La lineare è più veloce, ma quelle che hanno ingombro sterico minore sono le molecole superavvolte.

A seguito dell’aggiunta della topoisomerasi si possono osservare i diversi intermedi: nella situazione in cui gran parte del DNA superavvolto è diventato rilassato e si possono contare diversi gradi di superavvolgimento finché non si perde la risoluzione. La tecnica elettroforetica permette di separare il DNA in base non alla dimensione o alla sequenza, ma in base al contesto topologico. Queste gelatine vengono colorate con Bromuro di Etidio, sostanza che si intercala nella doppia elica del DNA: questa molecola è fluorescente e una volta che si intercala si può visualizzare con i raggi ultravioletti. La gelatina viene, quindi, posizionata su una lampada a raggi UV al buio e così si visualizzano le bande bianche.

Cosa vuol dire quando il numero di legami cambia o non cambia

Enzimi di restrizione e manipolazione del DNA

L’elettroforesi in questo caso viene utilizzata per valutare la differenza di dimensione dei frammenti di DNA. Una volta applicato il campo elettrico i frammenti nel pozzetto migreranno all’interno della gelatina muovendosi verso l’elettrodo positivo: i frammenti più piccoli migrano più velocemente dei frammenti più grandi, questo è il modo con cui si può separare il DNA in base alle dimensioni. Le condizioni per separare il DNA in base alle dimensioni sono diverse da quelle che si usano per separare il DNA in base al contesto topologico.

Gli enzimi di restrizione, che altro non sono che forbici molecolari, riconoscono sequenze specifiche sulla sequenza del DNA (ad esempio Escherichia Coli EcoR1 è un enzima che riconosce una sequenza di 6 paia di basi, ogni volta che legge questa sequenza taglia il DNA).

Se noi prendiamo questo frammento di dimensioni x in cui ci sono molte zone in cui l’enzima taglia, a seguito della digestione enzimatica si otterranno 7 frammenti, alcuni più piccoli ed altri più grandi. Prendendo il risultato di questa digestione e facendola migrare all’interno di un pozzetto nella gelatina, il frammento più piccolo migra più velocemente. Per valutare la dimensione dei frammenti si possono usare gli standard di peso molecolare e quindi paragonare la dimensione standard con la dimensione del frammento ignota.

• Uno che taglia lasciando due monconi “blant” piatti (esempio Hpal riconoscendo la sequenza GTT/AAC che è palindromica) taglio a estremità piatte
• Uno che lascia un moncone a singolo filamento ed una regione protuberante (EcoR1: il taglio con EcoR1 produce due estremità dette “appiccicose”) taglio a estremità appiccicose

Spesso si utilizzano queste tecniche per tagliare il DNA e cucirlo con altri pezzi di DNA, sfruttando gli enzimi di restrizione (proteine che hanno l’azione di forbici molecolari). Al termine, l’enzima che lega le estremità è la DNA-ligasi che ristabilisce il legame covalente.

Per motivi diversi, soprattutto considerando che in eucarioti le sequenze geniche sono interrotte dagli introni, è stata messa a punto una tecnologia diversa per collezionare frammenti di DNA che rispecchiano proprio la colinearità del frammento trascritto: in altre parole, l’ideale sarebbe avere frammenti di DNA senza la presenza degli introni. Ecco perché è stata messa a punto una tecnologia che prevede la costruzione della c-DNA: si parte da RNA e si purifica l’RNA messaggero, successivamente l’RNA messaggero viene appaiato ad un pezzo di DNA fatto di T (poiché la coda di RNA messaggero è fatto di A) —> il DNA di T si appaia alla coda di A è il DNA contiene un 3’ OH, fondamentale perché non c’è nessuna DNA polimerasi che è in grado di allungare e polimerizzare senza il 3’ OH. A questo punto si usa l’enzima trascrittasi inversa, che è un enzima virale in grado di copiare l’RNA in DNA —> la trascrittasi inversa allunga l’oligo di T in DNA copiando l’RNA. Quindi si crea una molecola fedele copia dell’RNA messaggero, con il vantaggio che l’RNA messaggero maturo non contiene più gli introni. Poi si rimuove il frammento di RNA e si può facilmente replicare il frammento di c-DNA in DNA, creando un doppio filamento: ecco che si ottengono tanti frammenti di cDNA, copie fedeli dell’originale RNA messaggero —> il vantaggio è che il cDNA a questo punto rappresenta tutte le copie geniche espresse da quel tipo di cellula, non le copie genomiche. Più un gene è espresso nella cellula, più viene rappresentato all’interno di questa libreria di cDNA. I cDNA poi vengono legato dentro i vettori plasmidici per costruire la collezione.

Quindi vi sono 2 tipi di collezioni:

• Genomica: rappresenta i frammenti di DNA genomico, che contengono introni, esoni, sequenze non espresse
• Libreria di cDNA: contiene solo e unicamente frammenti di DNA che riflettono l’espressione genica di un tipo di cellula

La replicazione del DNA

La replicazione dei cromosomi è una delle fasi più delicate della cellula. In eucarioti la fase di replicazione dei cromosomi avviene durante la fase S del ciclo cellulare,