Biologia Molecolare

Biologia molecolare

La biologia molecolare studia le interazioni delle molecole informazionali (DNA e RNA) con le proteine, che determinano la realizzazione del progetto vitale. Risulta importante a questo scopo la conoscenza della struttura delle proteine e degli acidi nucleici. Descrive inoltre i processi della trascrizione, della duplicazione e della traduzione, il controllo del ciclo cellulare e della morte cellulare (apoptosi).

Acidi nucleici

Gli acidi nucleici sono macromolecole polimeriche lineari di nucleotidi, i cui monomeri sono i nucleotidi stessi. I nucleotidi sono formati da uno zucchero, una base azotata e alcuni gruppi fosfato legati allo zucchero. La base azotata può essere una purina o una pirimidina, entrambi composti eterociclici aromatici; lo zucchero è solitamente un pentoso (ribosio nel RNA e desossiribosio nel DNA), che insieme alla base azotata costituisce un nucleoside; uno o più gruppi fosfato legati al nucleoside costituiscono il nucleotide.

• Posseggono un ruolo fondamentale nel metabolismo energetico della cellula; l'ATP in particolare è un'importante molecola nucleotidica con ruolo energetico.
• Sono importanti nella sintesi degli zuccheri e dei lipidi (ad esempio il glucosio viene attivato attraverso legame con nucleotidi).
• Giocano un ruolo informazionale importante, in particolare nel DNA e nel RNA.

Le basi pirimidiniche coinvolte nella formazione dei nucleotidi sono 3: citosina (C), uracile (U) e timina (T); sono costituite da un anello a 6 atomi, di cui 4 atomi di C e 2 atomi di N; mentre la citosina è presente sia nella molecola di DNA che nella molecola di RNA, l'uracile è una base pirimidinica esclusiva del RNA e la timina è una base esclusiva del DNA. Le basi puriniche delle molecole informazionali sono invece l'adenina (A) e la guanina (G); sono costituite da un anello pirimidinico legato ad un anello imidazolico; così come le basi pirimidiniche, le basi puriniche sono molecole fortemente planari e poco polari (dovuta all'aromaticità degli anelli); nelle basi puriniche si ha solamente un leggero piegamento di pochi gradi a livello del doppio legame che unisce i 2 anelli. Sia l'adenina che la guanina sono presenti in entrambe le molecole informazionali; nel RNA transfer sono presenti per il 30% basi modificate, quali l'ipoxantina e la xantina, intermedi chimici del catabolismo delle purine, e l'acido urico, prodotto finale del catabolismo delle purine.

Analizzando le singole basi pirimidiniche, è essenziale dire che la citosina, che possiede un gruppo amminico in posizione 4, va incontro a deaminazione spontanea in presenza di acqua; la deaminazione porta alla trasformazione della citosina in uracile; se l'uracile fosse una base pirimidinica specifica del DNA, i sistemi di riparazione non riuscirebbero a discriminare l'uracile originale da quello derivante dalla deaminazione della citosina; poiché l'uracile non è presente nel DNA, la sua presenza viene subito riconosciuta e quindi viene immediatamente sostituito. La timina differisce dall'uracile solamente per un gruppo metilico in posizione 5 (può essere quindi considerata la forma metilata dell'uracile).

A causa della presenza del gruppo chetonico in posizione 2, le basi pirimidiniche possono dare origine a tautomeria cheto-enolica. Tuttavia, la forma termodinamicamente più stabile è quello chetonica.

Legame e struttura dei nucleotidi

Il legame glicosidico, o più precisamente β-N-glicosidico, che si instaura tra la base azotata e lo zucchero di un nucleotide, si forma a livello dell'azoto 1 (nelle basi pirimidiniche) o a livello dell'azoto 9 (nelle basi puriniche) nelle basi e a livello dell'atomo di carbonio 1' a livello dello zucchero. L'esterificazione fosforica del nucleoside si instaura a livello del carbonio 5' dello zucchero; la presenza di un nucleoside fosforilato in posizione 3' ci indica che tale nucleotide deriva dall'idrolisi di una catena nucleotidica precedentemente presente, poiché gli acidi nucleici sono dei polimeri lineari di nucleotidi legati dal carbonio 3’ al 5’ attraverso ponti fosfodiesterici.

Come detto precedentemente, lo zucchero presente nelle molecole di DNA è il desossiribosio, mentre lo zucchero esclusivo del RNA è il ribosio. Tale differenza risulta sostanziale nella stabilità del DNA; il desossiribosio consente infatti al DNA di essere più stabile. Il desossiribosio, infatti, differisce dal ribosio perché non presenta in posizione 2' un gruppo ossidrilico; il gruppo OH in posizione 2', presente nel ribosio, è suscettibile ad attacco nucleofilo (e quindi anche da parte di uno ione OH^-), che avviene facilmente in ambiente biologico; il gruppo nucleofilo strappa il protone al gruppo ossidrilico in posizione 2', dando origine a O^-, che a sua volta attacca nucleoficamente il gruppo fosfato impegnato nel legame fosfodiestereo all'interno della molecola informazionale, provocando rottura della doppia elica e formazione di un legame fosfodiestereo 3'-2' intramolecolare; questo meccanismo risulta importante durante la trascrizione per la maturazione di mRNA, ma sarebbe altamente dannoso per il DNA, perché ciò provocherebbe la rottura della doppia elica. L'assenza del gruppo ossidrilico in posizione 2' nel desossiribosio evita questa reazione, prevenendo la rottura della molecola di DNA.

Il nucleotide è una molecola molto flessibile. I punti di flessibilità di un nucleotide, considerati sulla possibilità di rotazione di un legame, sono diversi. I legami più flessibili sono i 6 legami dello scheletro zucchero fosfato, che quindi possono ruotare con 6 differenti gradi di libertà. Un secondo legame con una certa flessibilità è il legame tra il carbonio 4' e quello 5'. Altro legame flessibile è il legame glicosidico tra lo zucchero e la base azotata, che può assumere 2 differenti posizioni: la posizione anti (al di fuori del piano dello zucchero) e la posizione sin (all'interno del piano); ciò è possibile solo per le basi puriniche, poiché le basi pirimidiniche, a causa dell'ingombro sterico del gruppo chetonico in posizione 2, impediscono la posizione di tipo sin. Un ultimo grado di flessibilità si riscontra negli atomi di C che compongono lo zucchero; normalmente 4 dei 5 atomi si trovano in un piano, e rispetto a questi il carbonio 2' o quello 3' possono avere un certo angolo di rotazione, dando origine così a quattro diverse conformazioni ripiegate dello zucchero; se il carbonio 2' (o 3') si trova verso l'estremità alcolica, si dice che si trova in configurazione endo; se invece si trova rivolto verso il basso allora si dice che si trova in configurazione eso; nel DNA B la conformazione favorita è quella con il carbonio C 2' in posizione endo.

DNA

Il DNA o Acido Deossiribonucleico, è un acido nucleico che contiene le informazioni necessarie alla biosintesi di RNA e proteine, e sono molecole indispensabili per lo sviluppo ed il corretto funzionamento della maggior parte degli organismi viventi. È una molecola formata da 2 filamenti polinucleotidici, i cui nucleotidi di ogni filamento sono legati da legami fosfodiesterici, e i 2 filamenti interagiscono fra di loro mediante diversi tipi di interazioni, dando origine alla tipica struttura a doppia elica del DNA.

All'interno della doppia elica si dispongono le basi azotate dei vari nucleotidi, ed in particolare una purina di un filamento si associa ad una pirimidina dell'altro filamento (nello specifico l'adenina interagisce con la timina mediante 2 legami a idrogeno, mentre la citosina interagisce con la guanina mediante 3 legami a idrogeno); all'esterno, invece, si dispone lo scheletro carbonioso del nucleotide (costituito dallo zucchero e dal fosfato). In definitiva il diametro interno della doppia elica è pari a 1,1 nm, mentre quello esterno è di circa 2-2,2 nm. Poiché in precedenza abbiamo visto come siano molto flessibili le strutture dei nucleotidi, ne consegue che anche la struttura del DNA è dinamica ed altamente flessibile, che può cambiare conformazione in relazione alla situazione in cui si trova.

I 2 filamenti devono scorrere in maniera antiparallela, altrimenti non possono affrontarsi correttamente. Gli zuccheri dei 2 nucleotidi che si affrontano nei 2 filamenti non si trovano nello stesso piano, ma esso è inclinato e divide il piano trasverso in 2 angoli, uno di 120° e l'altro di 240°. A causa dell'aromaticità delle basi, la forma planare del DNA è termodinamicamente instabile e in ambiente acquoso spontaneamente forma un'elica destrorsa. Il passo dell'elica non è uniforme, e ciò è dovuto al fatto che di volta in volta i 2 zuccheri non si trovano sullo stesso piano ma formano un piano trasverso in 2 angoli; si vengono a formare un solco minore, in cui si avvita l'angolo di 120°, ed un solco maggiore, in cui si avvita l'angolo di 240°; i solchi si alternano. Le basi entrano in contatto con l'esterno a livello dei solchi, che quindi rappresentano il punto di contatto per il legame con altre molecole informazionali o con proteine; in particolare, nel solco maggiore i nucleotidi espongono il più possibile i propri residui chimici, e quindi esso risulta il solco migliore. Il DNA deve essere riconosciuto da proteine leganti, che interagiscono con il DNA grazie alla possibilità di poter instaurare più legami a idrogeno.

Osservando le 2 basi appaiate si nota come, ad esempio, nella coppia guanina-citosina siano presenti da sinistra verso destra 2 accettori di legami a idrogeno, un donatore di legami a idrogeno ed un idrogeno in successione (A-A-D-H) nel solco maggiore, e un accettore, un donatore ed un accettore di legami a idrogeno in successione (A-D-A) a livello del solco minore. Invertendo la coppia, ovvero in presenza della coppia citosina-guanina, si nota come nel solco maggiore la sequenza dei donatori ed accettori di elettroni varia (H-D-A-A), mentre nel solco minore la sequenza rimane la stessa (A-D-A); ciò porta alla conclusione che nel solco maggiore non solo sono possibili più legami a idrogeno, ma sono anche discriminabili le 2 basi, a seconda della sequenza dei donatori e degli accettori di legami a idrogeno, mentre ciò non avviene nel solco minore, poiché la sequenza, sia che la coppia di base è guanina-citosina, sia che è citosina-guanina, rimane la stessa (sempre A-D-A), e quindi le 2 basi non sono discriminabili. Di conseguenza, è molto più probabile che una proteina leghi il DNA a livello del solco maggiore, che costituisce, oltre che un più ampio livello di legame, anche un linguaggio di riconoscimento. I gruppi chimici presenti nel solco minore non riescono a far distinguere una coppia di basi da un'altra. È da puntualizzare che una proteina lega più solchi in successione, e non un solo solco, per avere un livello di complementarietà massimo.

La sequenza delle basi nel DNA rappresenta un motivo di plasticità; sequenze ricche in A-T provocano una maggiore curvatura del solco minore, rendendolo ancora più profondo, mentre sequenze ricche in C-G provocano un aumento dell'angolo del solco maggiore, appiattendolo ulteriormente. Normalmente le coppie A-T e C-G sono mescolate, e le variazioni di dimensione del solco maggiore e minore si compensano, rendendo la molecola di DNA quasi lineare; esistono però zone del DNA ricche di C-G, e il DNA appare curvato.

Conformazioni del DNA

La conformazione ad elica del DNA è termodinamicamente stabile. La struttura è stabilizzata da più forze, quali i legami a idrogeno tra fosfato ed ambiente acquoso esterno, le interazioni idrofobiche tra i vari piani delle coppie di basi, così come le forze di Van der Waals che si instaurano fra di esse, ed i legami a idrogeno che si formano tra le basi che si affrontano nella doppia elica. La distanza di 2,2 nm è perfetta per evitare le repulsioni elettrostatiche tra i gruppi fosfato dei 2 filamenti; una distanza minore provocherebbe repulsione tra i 2 filamenti e rottura della struttura a doppia elica.

La conformazione che normalmente presenta il DNA è la conformazione B. La conformazione B è un'elica destrorsa con un passo dell'elica (distanza tra 2 punti equivalenti nell'asse longitudinale) di circa 3,4 nm (34 Å). La distanza fra 2 coppie di basi sovrapposte non può variare liberamente, ma varia entro un intervallo stabilito, per evitare la repulsione tra le coppie di basi; la repulsione è dovuta agli elettroni presenti nelle basi; la distanza ottimale per evitare tale repulsione è di 3,4 Å; ne consegue che un passo dell'elica a conformazione B è costituito da 10 coppie di basi, e poiché un passo dell'elica compie un giro completo di 360°, ogni coppia di basi è sfalsata di 36° rispetto alle coppie di basi inferiore e superiore. Il DNA può comunque assumere altre conformazioni, che non sono però assunte spontaneamente, perché la termodinamica conferisce alla conformazione B la maggiore stabilità.

In vitro è stato dimostrato che quando una doppia elica viene posta in un ambiente in assenza di acqua, tale elica assumeva una conformazione più tozza e più larga, da causare un accorciamento del passo, che diviene di circa 30 Å. Una conformazione di questo tipo è assunta sperimentalmente da eliche eteroduplex, ovvero costituite da un filamento di DNA e da uno di RNA, oppure da eliche in cui si affrontano 2 filamenti di RNA (duplex). Questo tipo di conformazione viene chiamata conformazione A; è sempre un elica destrorsa, e casi fisiologici in cui si ha la presenza di una tale conformazione sono ad esempio l'RNA transfer, in cui almeno 3 anse sono a doppia elica, oppure durante la trascrizione, in cui il DNA stampo resta legato al RNA messaggero, formando un eteroduplex, o ancora durante la duplicazione (nei frammenti di Okazaki). In tutti i casi, la presenza del gruppo ossidrilico in posizione 2' del ribosio del RNA si inserisce male nella struttura a doppia elica, creando ingombro sterico; di conseguenza l'elica si allarga, il passo dell'elica diminuisce e il numero di paia di basi in ogni passo dell'elica aumenta da 10 a 12; quest'ultimo appunto ci mostra che la distanza fra le coppie di basi diminuisce radicalmente da 3,4 Å a 2,5 Å, rendendo l'elica instabile; per questo motivo eliche di questo tipo sono sempre di piccole dimensioni.

Un altro tipo di conformazione è la conformazione Z; essa è stata inizialmente dimostrata in vitro, ma non ci sono tuttora prove cristallografiche che confermino la sua esistenza in vivo. Tuttavia, determinati domini di alcune proteine, chiamati domini z, sembrano perfettamente compatibili ad un'elica di DNA con conformazione Z; è quindi ipotizzabile che tale conformazione possa essere assunta dal DNA nei processi di trascrizione e duplicazione. Una prima particolarità di una doppia elica a conformazione Z è quella di possedere lunghi filamenti polinucleotidici costituiti da una successione di coppie G-C; ai raggi X tali eliche appaiono più lunghe e sottili, con un passo dell'elica che raggiunge anche i 42 Å; il diametro dell'elica inoltre si riduce da 2,2 Å a 1,7 Å; infatti, la sequenza in successione di coppie G-C stabilizza inoltre la conformazione sin della purina, a sfavore della più favorita conformazione anti, riducendo di conseguenza il diametro; per accomodare la modifica della conformazione della purina, poiché la citosina non può portarsi in posizione sin per questioni di ingombro sterico, per ripristinare i legami a idrogeno gira per intero lungo il legame fosfodiestereo, compiendo uno spostamento di 180°, con conseguente avvicinamento dei gruppi fosfato; l'avvicinamento dei gruppi fosfato dei 2 filamenti rende l'elica instabile e suscettibile all'apertura; inoltre, tale rotazione rende l'elica sinistrorsa, diversamente alle altre conformazioni B ed A; altra particolarità è l'aspetto del solco maggiore, molto esposto, superficiale ed accessibile, quasi piatto. Rendendo l'elica instabile e suscettibile all'apertura. Il processo di apertura, che avviene facilmente in una conformazione di questo tipo, risulta importante per i processi di trascrizione e duplicazione, e quindi si suppone che tale conformazione sia assunta dal DNA durante questi processi per poter separare i 2 filamenti con più facilità.

La conformazione Z è favorita non solo da sequenze ricche in coppie di guanina-citosina, ma anche da altre condizioni, quali la presenza di un gruppo metile sulla citosina (formazione di 5-metil-citosina) e la presenza nel DNA di superavvolgimenti negativi. La metilazione della citosina fa parte delle cosiddette variazioni epigenetiche, ovvero variazioni dell'espressione di una sequenza del DNA senza sostituzione della sequenza di basi (senza mutagenicità). La citosina viene metilata in posizione 5 per azione del DNA metiltransferasi, un enzima che sfrutta come donatore di gruppi metilici l'S-adenosil-metionina. La metilazione della citosina, dovuta a variazione epigenetica, è associata al silenziamento genico (che provoca la non trascrizione della sequenza genica ad essa associata); le citosine metilate sono quindi implicate nel DNA tumorale; il DNA tumorale è diverso da quello della cellula normale; esso infatti si presenta ipometilato in generale rispetto al DNA normale, ovvero nel complesso le citosine metilate sono in numero inferiore rispetto a quelle riscontrate nel DNA normale, ma risulta ipermetilato in sequenze particolari, ovvero quelle sequenze che regolano le proteine oncosoppressorie o che regolano le proteine che riparano il DNA; ciò provoca silenziamento genico di queste.