Biologia molecolare

La complessità della regolazione genica

Un singolo gene può essere trascritto in maniera diversa in quanto esistono promotori differenti e gli introni possono essere rimossi in maniera differente. Lo splicing è il processo di rimozione degli introni; si producono dei trascritti differenti che danno origine a proteine con diversi domini funzionali. Le proteine che si ottengono possono poi andare incontro a delle modificazioni post traduzionali. Le proteine si associano a formare complessi che non sono stabili ma possono cambiare conformazione. Per studiare questi sistemi occorrono degli approcci metodologici su larga scala che combinano tecnologie biochimiche, ingegneristiche e informatiche.

È possibile analizzare famiglie di molecole nella cellula non in modo specifico ma complessivo. Questa possibilità è rappresentata da:

• Sequenziamento del genoma umano
• Analisi dei trascrittomi: insieme dei trascritti prodotti da una cellula di un sistema biologico
• Analisi dei proteomi: insieme di

molecole di DNA.

Si depositano in modo ordinato sul vetrino delle gocce di soluzione, ciascuna con una piccola quantità di ogni frammento di DNA che funge da sonda: le sonde si legano covalentemente al vetrino e non si staccano né si mescolano tra loro.

Si prendono due campioni biologici che voglio confrontare. Reference: campione sano di riferimento. Test: campione da analizzare che presenta per esempio una patologia. Da essi si estraggono tutti gli mRNA, cioè l'insieme dei trascritti di tutti i geni.

Gli mRNA purificati vengono trattati con la trascrittasi inversa: per ogni mRNA è sintetizzata una molecola di cDNA a doppia elica. Si ottengono quindi due popolazioni di cDNA: quella che proviene da reference e quella che proviene da test.

Tutti i cDNA vengono marcati con dei fluorofori che legano il DNA e danno colore diverso per i cDNA dei due campioni: rosso per test e verde per reference.

Si prendono uguali quantità di cDNA da entrambi i campioni,

si mescolano, si denaturano e vengono fatti ibridare con il microarray. In condizioni di alta restringenza, quando le sequenze di cDNA trovano una sequenza complementare tra tutti gli spot del microarray, si legano. Per ogni gene ho due tipi di cDNA che competono per legarsi allo stesso target.

Un laser colpisce il vetrino con lunghezza d'onda tale da eccitare entrambi i tipi di fluorofori; la macchina misura la luce emessa da tutti gli spot:

• Se lo spot emette luce chiaramente verde si è legato cDNA che ha fluoroforo prevalentemente verde, cioè il gene in questione è maggiormente espresso nel campione reference.
• Se lo spot emette luce chiaramente rossa si è legato cDNA che ha fluoroforo prevalentemente rosso, cioè il gene in questione è maggiormente espresso nel campione test.
• Se lo spot emette luce intermedia giallo l'espressione del gene è circa la stessa nei due campioni analizzati.

Attraverso questo confronto è

• Se ho colorazione gialla intermedia significa che l'aggiunta del farmaco non ha alterato la trascrizione del gene.
• Se lo spot vira al verde significa che in seguito a trattamento la trascrizione diminuisce.
• Se lo spot vira al rosso significa che la trascrizione aumenta.

Trascrizione cambia in maniera analoga. Per esempio se nella malattia che sto analizzando il gene dell'actina è sovraespresso l'aumento dell'espressione segue una sua cinetica. Se trovo gruppi di geni che rispetto a tutti gli altri variano la loro espressione in maniera simile all'actina, probabilmente anche questi geni sono correlati alla patologia.

Rilevare le mutazioni. Si usa il microarray per analizzare le SNP (single nucleotide polymorphism). Si costruisce un microarray in cui le sonde di DNA, in questo caso, rappresentano tutti i siti polimorfici di un determinato gene, tutte le possibili mutazioni del singolo nucleotide in una determinata posizione (per esempio un nucleotide A può essere mutato in C o in G). Si sintetizzano gli oligonucleotidi e si depositano sul vetrino del microarray. Con la PCR si amplificano tutti i siti polimorfici del gene e si marcano con molecole fluorescenti: la mutazione sarà presente anche nell'amplificazione.

se la proteina debba andare incontro a degradazione. Le proteine dopo un certo intervallo di tempo, quando perdono la loro attività, vengono degradate dalla cellula in modo ordinato: l'enzima ubiquitina ligasi riconosce le proteine non integre o mutate e lega loro l'ubiquitina. Le proteine con questo segnale vengono riconosciute dal proteosoma che le degrada. Molti enzimi inoltre vengono attivati o disattivati attraverso la fosforilazione da parte di proteina chinasi. Se ci si ferma al trascrittoma si perde tutta la regolazione che c'è dopo: per esempio analizzando il campione da due tessuti, uno sano e uno malato, è possibile che il gene per la proteina sia trascritto allo stesso livello però nella patologia posso non avere più la proteina perché magari la malattia è legata al procedimento di regolazione dell'ubiquitina. Le proteine si separano con elettroforesi in base alla dimensione, ma le proteine hanno una struttura

è variata, cioè se per esempio delle proteine sono sparite; le cause possono essere:

• Le due proteine sono state degradate o la trascrizione dei geni è spenta
• Le proteine hanno subito modifiche post-traduzionali che ne hanno variato la motilità nell’elettroforesi del punto isoelettrico. Per esempio la stessa proteina fosforilata o defosforilata ha una migrazione diversa.

Come riconosco le proteine di ogni spot? Dopo averle separate le proteine devono essere identificate: si possono usare anticorpi specifici per capire a quale spot corrisponde la proteina che sto cercando oppure si sottopone ogni spot a un’analisi con spettrometria di massa. La spettrometria di massa permette di stabilire il peso molecolare di una piccola molecola con precisione assoluta.

1. Isolata una proteina per elettroforesi, si isola lo spot specifico che contiene la proteina di interesse.
2. La proteina è digerita con miscugli di diverse proteasi che riconoscono e