Biologia molecolare

Biologia molecolare

Flusso dell'informazione genetica

Dal DNA alle proteine: DNA trascrizione mRNA → traduzione PROTEINE.

Che cos'è la biotecnologia?

Biologia: scienza della vita, ovvero studio di ciò che sostanzialmente è vitale, studio di come funziona il mondo vivente.

Biotecnologie: è l'applicazione delle conoscenze biologiche per produrre dei beni o dei servizi. La biotecnologia è l'applicazione tecnologica che si serve dei sistemi biologici, degli organismi viventi o di derivati di questi, per produrre o modificare prodotti o processi per un fine specifico. In altre parole: è un ramo della biologia che utilizza gli esseri viventi o le conoscenze che derivano dalla biologia.

Materiale genetico

Gli acidi nucleici trasmettono l'informazione genetica. La vita si sviluppa a partire dall'RNA ma avviene poi un passaggio al DNA in quanto la struttura a doppia elica ha una maggiore stabilità (vantaggio). Si era convinti che l'informazione genetica fosse trasmessa tramite le proteine poiché il DNA è una molecola troppo semplice, un polimero composto dalla sola ripetizione di quattro basi.

Esperimenti chiave

• Griffith: parte dal presupposto che esiste una molecola depositaria dell'informazione genetica. Griffith studia un vaccino della polmonite utilizzando Streptococco. Due ceppi di:
• Il ceppo R, che genera colonie rugose, è benigno, non è dotato di capsula polisaccaridica protettiva e il sistema immunitario della cavia in cui viene iniettato riesce a degradarlo.
• Il ceppo S, virulento e liscio, contiene nel genoma le informazioni per l'involucro polisaccaridico (che conferisce la forma liscia) che lo isola dal riconoscimento immunitario. Griffith aveva trovato che il batterio virulento, anche quando ucciso dal calore, era in grado di trasformare il batterio benigno in un batterio virulento vivo. Suggerì quindi che il materiale genetico codificante la capsula rimanesse intatto anche dopo l'uccisione del batterio virulento e che potesse entrare in un'altra cellula per ricombinare il suo materiale genetico.

Esegue poi un prelievo di sangue dalla cavia in cui erano state iniettate entrambi i tipi di cellule e trova delle colonie di Streptococco S. L'informazione per la produzione dell'involucro è così passata dalle cellule morte a quelle vive. C'è un principio trasformante.

• Avery: conclude che il DNA è il principio trasformante. Crea una coltura di cellule S ed esegue diverse estrazioni e aggiunge alle diverse provette cellule R. I risultati ottenuti piastrando le cellule e facendo crescere colonie furono:
• Proteine → cellule R
• DNA → cellule R + colonie di cellule S
• RNA → cellule R
• Lipidi → cellule R
• Polisaccaridi → cellule R
• Liquido (controllo negativo) → cellule R

Da questo si conclude che è il DNA il principio trasformante.

Cosa succede a livello molecolare? Le cellule S contengono il gene cap che codifica per il rivestimento polisaccaridico. Con il calore si ha la rottura della cellula. Si rompono anche le molecole di DNA. Quando avviene il contatto con le cellule R, il gene cap, in alcune cellule, va a sostituire con un doppio crossing-over il gene cap che non codifica per nessun rivestimento. Al termine ottengo alcune cellule che hanno sviluppato la capacità di generare il rivestimento e che non sono quindi eliminabili dal sistema immunitario. Il mondo scientifico rifiuta però l'esperimento di Avery.

• Chase e Hersey: utilizzano un virus, un organismo che ha al suo interno solo DNA e proteine in modo tale da discriminarne definitivamente uno. Crescono due colonie in terreni differenti:
• Il primo contiene zolfo 35, marcatore di proteine
• Il secondo contiene fosforo 32, marcatore di DNA

Iniettano poi un batterio ospite, E. Coli, con fagi derivati da uno dei due terreni e centrifugano in modo tale da terminare l'infezione, eliminare tutto il materiale del fago rimasto fuori dal batterio e ottenere sul fondo delle due provette un pellet batterico. Analizzo poi la radioattività delle due provette:

• La provetta con virus marcato con zolfo 35 riscontra radioattività solo nella fase contenente i capsidi dei virus.
• La provetta con fosforo 32 segna radioattività anche nel pellet batterico essendo che i virus trasmettono il DNA all'interno del batterio → è appunto il DNA il fattore trasformante.

Trasformazione batterica

Metodo utilizzato da Chase e Harsey. Si introduce DNA estraneo circolare (plasmide) in un batterio. Non è possibile inserire un DNA lineare perché il batterio lo riconosce come estraneo e ne degrada le estremità. Solo i virus possono infettare un batterio con il proprio DNA lineare. Si differenzia dalla trasfezione che è il processo con cui introduco DNA estraneo non in un batterio ma in una cellula.

Come avviene la trasformazione batterica

• Sviluppo della fase di competenza: isolamento del frammento di DNA e del plasmide.
• Legame del DNA trasformante alle cellule competenti.
• Ingresso del DNA trasformante.
• Integrazione del DNA (ricombinazione): avviene attraverso uno shock termico.
• Espressione del DNA trasformante nella cellula in cui viene iniettato il plasmide ricombinante.

Acidi nucleici

Gli acidi nucleici sono polimeri lineari di nucleotidi. Nucleotide = zucchero + base azotata + fosfato. DNA: zucchero 2-deossiribosio, in posizione 2' non c'è un ossidrile. RNA: zucchero ribosio. Base azotata: composta da uno (pirimidine: citosina, timina e uracile) o due anelli aromatici (purine: guanina, adenina). I diversi nucleotidi sono uniti da un legame fosfo-diesterico: legame che impegna l'ossidrile 3' di un nucleotide e il carbonio in posizione 5' dell'altro nucleotide. Si formano due legami esteri. Le basi possono essere modificate dopo la sintesi del DNA/RNA:

• DNA: metilazione di citosina, adenosina.
• RNA è molto più modificato.

Nucleosidi: base + zucchero. Nomenclatura dei fosfati: il fosfato alfa è quello direttamente legato allo zucchero e che forma lo scheletro degli acidi nucleici. Per rilevare la sintesi dovrò marcare il fosfato alfa. Il fosfato alfa è quello che forma lo scheletro degli acidi nucleici.

Chargaff

Specifica la composizione nucleotidica del DNA. Purifica il DNA da un certo numero di cellule diverse specie in maniera tale da ridurre il contenuto ai singoli nucleotidi e a separarli. Esegue una cromatografia su strato sottile per verificare la quantità dei diversi nucleotidi nelle diverse specie.

Conclusioni:

• I quattro nucleotidi non sono presenti in eguale quantità.
• Le specie hanno una diversa composizione in nucleotidi caratteristica.
• Il DNA preparato da diversi tessuti e organi dello stesso organismo ha sempre la stessa composizione in basi e non cambia con l'età, lo stato di nutrizione o l'ambiente.
• Il numero di A è uguale al numero di T; il numero di G è uguale al numero di C.
• Il rapporto purine-pirimidine è 1:1.

Watson e Crick

Lavorano partendo dalle scoperte di Chargaff, Wilkins e Franklin (che utilizzarono la tecnica della diffrazione ai raggi X per analizzare le fibre di DNA) e arrivano a importanti scoperte sulla molecola di DNA.

DNA

Il DNA ha una struttura a doppia elica destrogira con uno scheletro esterno carico negativamente (la carica è determinata dalla presenza dei gruppi fosfato). I due filamenti sono antiparalleli. Le basi stanno all'interno, non sono accessibili alla soluzione (sono idrofobiche). La doppia elica è molto regolare, con un diametro di 2 nm e un passo (distanza tra due punti nella stessa posizione) di 3,4 nm o 10,5 coppie di basi. La regolarità è mantenuta dall'accoppiamento delle basi, una purina e pirimidina (legami idrogeno e interazioni idrofobiche). A e T fanno due legami idrogeno, G e C ne fanno tre. Si creano un solco maggiore e un solco minore. Quando una proteina interagisce con il DNA in maniera sequenza specifica (interagisce con le basi) tende a interagire nel solco maggiore perché la alfa-elica della proteina ha esattamente le dimensioni per insinuarsi in questo solco. La molecola è molto stabile, se voglio denaturarla innalzo la temperatura o utilizzo una soluzione basica in quanto la repulsione elettrostatica è destabilizzante per la struttura. La complementarietà della doppia elica ne garantisce, oltre alla stabilità, la duplicazione in due molecole figlie. I due filamenti si aprono e vengono copiati dall'enzima necessario seguendo la complementarietà delle basi.

Strutture alternative del DNA

• Quella di Watson e Crick è la conformazione B
• Conformazione A: doppia elica con diametro più ampio, con un passo di 2,5 nm. La troviamo in presenza di alcol e quindi in un ambiente povero di acqua. Tipica struttura del RNA nelle regioni a doppio filamento e durante la trascrizione (DNA appaiato con RNA).
• Forma Z, levogira e più slanciata: ha un diametro di 1,8 nm. Si forma quando la sequenza è ricca in G e C oppure in condizioni di alte concentrazioni di sale. Esiste una piccola frazione di DNA in questa forma.

RNA

Contiene uracile al posto di timina e ribosio al posto di deossiribosio. È a singolo filamento anche se forma regioni a doppio filamento. Le molecole sono molto più corte di quelle di DNA; portano l'informazione di uno o pochi geni. Breve vita media (molto instabile in quanto è a singolo filamento). Può contenere basi insolite, modificate e non presenti nel DNA. Eccezioni date da virus con genomi a RNA a doppio o singolo filamento. Può assumere diverse conformazioni in quanto le basi possono ruotare e ripiegarsi liberamente attorno al legame fosfodiesterico e le basi possono impiegarsi in appaiamenti non tradizionali. L'ossidrile in 2' (non presente nel DNA) impedisce la formazione di una doppia elica di tipo B (conformazione standard del DNA), favorendo invece la conformazione A con il solco maggiore più stretto e profondo e quello minore più largo e accessibile. La presenza dell'OH in posizione 2' rende la molecola di RNA molto reattiva l'RNA può avere funzione catalitiche.

Denaturazione e ibridazione degli acidi nucleici

Le soluzioni di DNA a doppio filamento isolato sono molto viscose a pH 7 e a temperatura ambiente. Quando queste soluzioni vengono sottoposte a condizioni estreme di pH e temperatura (superiore agli 80°C) la viscosità diminuisce bruscamente, segno del fatto che il DNA è andato incontro a un cambiamento fisico: questo cambiamento è detto denaturazione (processo che può essere subito anche dall'RNA). Con la denaturazione si ha la distruzione dei legami idrogeno tra le basi appaiate e questo porta la doppia elica a disgregarsi in due filamenti singoli (non avviene pertanto la distruzione dei legami fosfodiesterici). Dopo la denaturazione, se la temperatura scende, la molecola a doppia elica si riforma (processo di rinaturazione o annealing delle basi). La denaturazione può essere totale o parziale. Nel caso di denaturazione completa, la rinaturazione avverrà in tempi più lunghi in quanto le sequenze complementari dei due filamenti devono prima cercarsi e, grazie a collisioni casuali, formano un breve tratto a doppia elica. Successivamente le rimanenti basi si appaiano più velocemente. Ho un campione con DNA a una certa concentrazione e con una certa assorbanza (260 nm). Scaldo la provetta e man mano l'assorbanza aumenta fin quando non ho la denaturazione completa. L'assorbanza aumenta in correlazione con la denaturazione in quanto la stretta interazione tra le basi della doppia elica scherma l'assorbimento dei raggi UV (effetto ipocromico). Il filamento singolo di DNA ha un'assorbanza superiore del 40% (effetto ipercromico). Se lascio poi riposare il campione a temperatura ambiente mi si riformerà la doppia elica e il valore dell'assorbanza sarà nuovamente quello iniziale. La transizione dal DNA a doppio filamento alla forma a singolo filamento può quindi essere rilevata seguendo l'assorbimento della luce UV.

Come faccio a visualizzare la denaturazione e la rinaturazione?

Per stimare la concentrazione di DNA utilizzo lo spettrofotometro: una lunghezza d'onda attraversa una soluzione contenente DNA e quando incontra DNA viene modificata. In base alla modificazione calcolo la concentrazione di DNA. Il valore dato dalla macchina è l'assorbanza, con una formula matematica risalgo alla concentrazione (Legge di Lamber-Beer: A = c l ε).

Se dopo aver denaturato il campione lo pongo a 0°C (la temperatura non scende gradualmente, ma viene abbassata rapidamente) non riesce a rinaturarsi regolarmente. Le molecole si dispongono secondo il gomitolo statistico in cui il DNA forma alcune regioni a doppio filamento random perché ha scaricato energia. La regione a doppio filamento può derivare da un ripiegamento del filamento stesso o dall'appaiamento con una regione complementare di un altro filamento. In questa situazione, come assorbe il DNA? Con un'assorbanza maggiore del valore iniziale ma minore del singolo filamento (situazione intermedia).

Ibridazione degli acidi nucleici: il concetto di sonda

Prendiamo due molecole identiche che si differenziano solo per due sequenze. Scaldo e denaturo. Riscendo con la temperatura ad un valore vicino a quello iniziale posso formare degli ibridi tra i due filamenti (duplex ibridi) con delle regioni di mismatch. Non necessariamente ho un perfetto appaiamento. Tutto questo introduce in concetto di sonda, fondamentale negli esperimenti di biologia molecolare. La sonda è una molecola, spesso marcata e riconoscibile, a singolo filamento e aggiunta in largo eccesso in maniera tale che trovi la propria sequenza complementare. Deve essere in largo eccesso in modo tale che venga favorito l'appaiamento con la sonda. Quando ho denaturato aggiungo la sonda e scendo con la temperatura in modo tale da rinaturare. La sonda in largo eccesso avrà maggiore probabilità di incontrare il suo complementare.

Proteine

Macromolecole composte da amminoacidi che formano una lunga catena lineare che si ripiega su se stessa in strutture tridimensionali. Le proteine sono le macromolecole da cui dipendono tutte le attività della cellula.

Amminoacidi

Ogni amminoacido contiene un carbonio centrale (detto carbonio alfa) a cui sono legati un gruppo amminico, un gruppo carbossilico e una catena laterale che è quella che caratterizza ciascun amminoacido. Il legame peptidico avviene tra il gruppo carbossilico di un amminoacido e il gruppo amminico dell'amminoacido successivo (con liberazione di una molecola d'acqua).

Conformazione della proteina

• Ogni proteina assume un'unica conformazione anche se ne potrebbe teoricamente assumere un numero enorme. Le informazioni per quella conformazione specifica sono contenute nella sequenza amminoacidica di cui si compone la proteina. Se denaturiamo una proteina (65°) è difficile che essa ritorni nella sua conformazione iniziale assunta durante la sintesi peptidica. Non siamo capaci di prevedere con assoluta certezza la conformazione di una proteina, ma possiamo fare delle ipotesi nel caso in cui si abbia a che fare con proteine di struttura primaria simile.
• Il folding, il ripiegamento, è prevalentemente influenzato dal comportamento della proteina in ambiente acquoso e quindi dalla natura degli amminoacidi: i residui idrofobici tendono a stare all'interno, mentre quelli polari tendono a stare verso l'esterno in modo tale da poter interagire con l'acqua.
• La struttura finale di una proteina è mantenuta da legami deboli non covalenti (interazioni idrofobiche, legami idrogeno, interazioni ioniche, forze di Van der Waals). Significa quindi che le proteine perdono facilmente la propria struttura.

Livelli strutturali delle proteine

1. Primaria: sequenza di amminoacidi legati da legame peptidico in cui il gruppo carbossilico di un amminoacido interagisce con il gruppo amminico dell'amminoacido successivo. L'ordine degli amminoacidi è scritto nel gene che codifica per la tale proteina.
2. Secondaria: alfa elica (10-15 residui) e foglietto beta (3-10 residui). Ogni proteina ha circa 1/3 di ogni struttura, il resto è disordine proteico che connette le diverse strutture secondarie. Nell'alfa elica i legami peptidici sono paralleli all'asse dell'elica e si formano legami idrogeno intracatena. I gruppi R degli amminoacidi sono rivolti verso l'esterno dell'elica. Nel foglietto beta i gruppi R sporgono perpendicolarmente all'asse del foglietto e si formano legami idrogeno tra foglietti adiacenti (paralleli o antiparalleli).
3. Terziaria: definita dall'orientamento tridimensionale delle strutture secondarie e delle anse che le connettono: la proteina si ripiega nello spazio, fatto reso possibile dai legami deboli. Esistono anche legami covalenti nella struttura terziaria, sono molto pochi. Un esempio è il ponte disolfuro tra due cisteine. La struttura terziaria che una catena polipeptidica assume dopo l'avvolgimento è quella con la più bassa energia, ovvero la struttura più stabile dal punto di vista termodinamico. Questo è determinato già dalla sequenza amminoacidica della struttura primaria.
4. Quaternaria: struttura assunta da proteine composte da diverse subunità che possono essere uguali o diverse. Interazioni tra subunità avvengono tramite legami non covalenti.