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Biologia molecolare

Tecniche nello studio di DNA/RNA, estrazione di acidi nucleici e proteine, tecniche immunorelate, elettroforesi e blotting, sequenziamento Sanger e New generation sequencing. Meccanismi molecolari di trascrizione, traduzione e replicazione. Fattori di trascrizione, geni, domini di binding e di attivazione. Epigenetica, metilazione del DNA e struttura della cromatina. Organismi modello nello studio... Vedi di più

Esame di Biologia molecolare docente Prof. N. Landsberger

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REPLICAZIONE DEL DNA

È il processo in cui il genoma di una cellula viene duplicato prima della divisione

cellulare permettendo la sua trasmissione alle cellule figlie. Ognuna delle due eliche

che compongono il DNA contiene l’informazione necessaria per costruire il filamento

complementare.

Inizialmente erano stati proposti tre modelli per spiegare come i filamenti di vecchia e

nuova sintesi potessero essere combinati: - Meccanismo conservativo: entrambi i

filamenti parentali rimangono insieme e

i due filamenti di nuova sintesi formano

una doppia elica neosintetizzata.

- Meccanismo distributivo/dispersivo:

tutti i filamenti contengono DNA sia di

vecchia che di nuova sintesi.

- Meccanismo semiconservativo: le

nuove eliche contengono un filamento

parentale e uno di nuova sintesi.

L’esperimento di Meselshon e Stahl fornì la risposta: 15

Crescono batteri in un terreno contenente l’isotopo pesante dell’azoto N. I batteri

14

vengono poi spostati in un terreno con il normale isotopo di azoto N. Dopo 30 minuti

(tempo di divisione delle cellule batteriche) prelevano i batteri, estraggono il DNA e lo

analizzano su gradiente di cloruro di cesio: ciascuna molecola di DNA si ferma nella

regione della provetta in cui la sua densità è uguale a quella del cloruro di cesio.

ANALISI DEI RISULTATI:

Dopo la prima replicazione si evidenzia una sola banda nel cloruro di cesio: si sono

formate due eliche che hanno la stessa densità. Si esclude così l’ipotesi del metodo

conservativo in quanto si sarebbero dovute evidenziare due bande: una più pesante

costituita dai due filamenti parentali contenenti azoto pesante e una più leggera

costituita da filamenti di nuova sintesi contenenti azoto leggero.

Dopo la seconda replicazione (di nuovo in terreno leggero) si osservano due bande. Si

esclude quindi anche la possibilità del metodo dispersivo in quanto si dovrebbe

formare un’unica banda (i filamenti sono formati sia da DNA parentale pesante che da

DNA neosintetizzato). L’ipotesi corretta è quindi quella del metodo semiconservativo in

cui, da ogni replicazione, si formano nuove eliche contenenti un filamento parentale e

uno neosintetizzato.

La bolla di replicazione è la struttura, osservabile al microscopio, che assume la

molecola di DNA in fase di replicazione. Il punto in cui i due filamenti di DNA si aprono

viene definito forca replicativa. La replicazione avviene in entrambe le direzioni.

FASI DELLA REPLICAZIONE

1. INIZIO: devono essere riconosciute le origini di replicazione, deve formarsi la

bolla di replicazione, deve avvenire il reclutamento dei fattori di replicazione.

2. ALLUNGAMENTO: fase in cui viene sintetizzato il nuovo filamento di DNA.

3. TERMINAZIONE: avviene quando le due forche si incontrano. In E. Coli c’è una

terminazione definita (il DNA è circolare), negli eucarioti no.

Per la sintesi del DNA sono richiesti due substrati:

I quattro deossinucleotidi: dATP, dCTP, dGTP, dTTP

La giunzione innesco-stampo: DNA a singolo filamento che dirige l’aggiunta di dNTPs

complementari nella catena neosintetizzata e DNA a doppio filamento costituito dallo

stampo e dal primer. Al 3’OH del primer verrà legato il primo nucleotide del filamento

neosintetizzato.

La DNA polimerasi legge il filamento stampo in direzione 3’5’ dall’innesco; la sintesi

procede in direzione 5’3’ (nuovo

filamento). Modelli della replicazione del

DNA:

- Modello continuo: non appena la

forca replicativa si muove verso

destra, entrambi i filamenti

vengono replicati in continuo e

nella stessa direzione.

- Modello semidiscontinuo: la sintesi di un filamento è continua mentre l’altro è

sintetizzato in maniera discontinua IPOTESI CORRETTA

- Modello discontinuo: entrambi i filamenti sono sintetizzati in maniera

discontinua.

I piccoli filamenti che vengono sintetizzati (filamento discontinuo) sono chiamati

frammenti di Okazaki. Okazaki ha dimostrato sperimentalmente la replicazione

semidiscontinua del DNA marcando il DNA in replicazione del fago T4 con degli impulsi

molto brevi di precursori radioattivi del DNA. Successivamente hanno separato per

dimensione i prodotti di DNA tramite ultracentrifugazione. A tempi più brevi, la

marcatura si riscontra su piccoli frammenti. Inoltre, utilizzando mutanti con una ligasi

difettosa, si è verificato un accumulo di piccoli frammenti di DNA marcati.

INNESCO A RNA: la DNA polimerasi non sa sintetizzare DNA sia nel caso di DNA doppia

elica o a singolo filamento. Inoltre la DNasi non degrada del tutto i frammenti di

Okazaki, ma lascia piccoli frammenti di DNA.

Le cellule eucariotiche, avendo un genoma molto complesso, sono dotate di più forche

replicative sulla stessa molecola di DNA. Con una sola forca replicative per ogni

cromosoma, le cellule umane avrebbero bisogno di più di 100 ore per duplicare il loro

DNA. La replicazione in tempo limitato del DNA in un cromosoma eucariotico avviene

grazie alla sua suddivisione in tanti repliconi.

L’inizio della replicazione di ciascun replicone avviene in tempi diversi; la velocità è

ridotta probabilmente a causa dell’organizzazione del DNA in cromatina. Per

visualizzare la replicazione viene incorporato in fase S un analogo della timidina

visualizzabile tramite l’uso di un anticorpo. Per l’integrità del genoma è importante che

il DNA venga replicato COMPLETAMENTE e SOLO UNA VOLTA per ogni divisione

cellulare. Questo è un problema particolare per le cellule eucariotiche perché ogni

cromosoma contiene molte origini di replicazione. Una replicazione incompleta porta

alla rottura del cromosoma durante la segregazione. Per assicurare che il DNA venga

replicato solo una volta per ogni divisione i replicatori attivati vengono

successivamente bloccati; quelli replicati passivamente sono bloccati. I replicatori

contengono molte regioni ricche in AT che si aprono facilmente.

ENZIMOLOGIA DELLA REPLICAZIONE:

ELICASI: enzima che utilizza energia libera donata dall’ATP per separare i due filamenti

parentali di DNA.

PROTEINE CHE LEGANO IL DNA A SINGOLO FILAMENTO (SSBP): effettuano un legame

cooperativo. Stimolano le DNA polimerasi e proteggono il DNA dalle endonucleasi.

Impediscono inoltre che il filamento singolo formi strutture secondarie che

renderebbero difficile la replicazione.

DNA POLIMERASI I: sintetizza legami fosfodiesterici in direzione 5’-3’. Ha un’attività di

correzione di bozze in direzione 3’-5’. Ha anche attività esonucleasica in quanto è

l’enzima principalmente coinvolto nella riparazione del DNA e nella rimozione e

sostituzione degli inneschi di RNA. Questo non è l’enzima chiave per la replicazione in

quanto c’è un mutante di Pol1 che è vitale.

Fondamentale per la sintesi del DNA è la presenza di due ioni magnesio. Questi si

trovano nel sito attivo della DNA polimerasi. Un magnesio deprotona il 3’OH

dell’innesco per formare il nucleofilo, l’altro lega il nucleotide in ingresso e facilita il

rilascio di pirofosfato.

Quando la DNA polimerasi è nella forma aperta, il nucleotide si lega al dominio;

l’enzima cambia così conformazione (conformazione chiusa) e muove il nucleotide

nella posizione di appaiamento. L’accuratezza della polimerasi si basa sul

riconoscimento della forma. A livello del sito catalitico avviene anche la

discriminazione tra dNTPs e rNTPs. Questi ultimi non si inseriscono bene nel sito

catalitico a causa della presenza dell’ossidrile in posizione 2’. L’enzima però non

discrimina tra i 4 dNTPs; solo in presenza della corretta coppia di basi il 3’OH

dell’innesco è posizionato correttamente per formare il legame fosfodiesterico.

Quando viene incorporato un nucleotide errato, la velocità di incorporazione del

nucleotide successivo è molto ridotta. Questo provoca lo spostamento del terminale 3’

del filamento nascente dal sito attivo a quello con attività esonucleasica dove viene

idrolizzato il legame appena formato.

DNA POLIMERASI III: principale polimerasi nella replicazione del genoma. È molto

sliding clamp.

processiva ma tale processività si ottiene solo con l’aiuto della proteina

Ha la forma di una ciambella e circonda il DNA a doppia elica. In assenza della sliding

clamp la polimerasi si stacca dallo stampo diffondendosi nell’ambiente. La polimerasi

si stacca dalla sliding clamp solo nel momento in cui riconosce un DNA a doppio

filamento (termine della replicazione). La particolare struttura ad anello della

sliding clamp richiede la sua apertura

per essere caricata sul DNA. Per

questo esiste un sliding clamp loader

che catalizza l’apertura e il

posizionamento della proteina sul DNA

tramite idrolisi di ATP.

Un enzima, per svolgere la propria attività, deve essere processivo: deve sintetizzare

molti legami fosfodiesterici prima di staccarsi, questo è reso possibile da un anello

proteico che la tiene ancorata al filamento SLIDING CLAMP, circonda il DNA ed è

affine alla DNA-polimerasi. In assenza dello sliding clamp la polimerasi ha una

processività limitata. La polimerasi rimane associata fin quando raggiunge il filamento

di hokazaki successivo. La proteina clamp loader è la proteina che catalizza l’apertura

e il posizionamento dello sliding clamp sul DNA usando idrolisi di ATP. La presenza di

una giunzione innesco/stampo induce il caricamento della sliding clamp. Il caricatore

interagisce con la sliding clamp quando non è associata alla DNA polimerasi.

INIZIO DELLA REPLICAZIONE IN E. COLI

Coordinato caricamento delle proteine richieste per la replicazione

 Si legano le proteine iniziatrici

 Il DNA si denatura

 Reclutamento delle elicasi sul DNA a singolo filamento

 Le elicasi favoriscono il reclutamento delle primasi, poi la pinza scorrevole e le

 DNA polimerasi

Reclutamento sequenziale e ben controllato

 Nei procarioti l’origine è riconosciuta da una proteina detta DnaA, negli eucarioti

 da un complesso proteico detto complesso di riconoscimento delle origini (ORC)

IDENTIFICAZIONE DELLE ORIGINI DI REPLICAZIONE

Si effettua un saggio che utilizza un plasmide mancante di

replicatore ma contenente un marker selezionabile assente

nelle cellule ospiti.

Il DNA cromosomico viene tagliato con un enzima di

restrizione e clonato dentro il plasmide.

Un plasmide può essere mantenuto nelle cellule di lievito

(ospiti) solo se fornito di un replicatore.

Le cellule capaci di crescere su piastre di selezione hanno

per forza assunto un plasmide con un replicatore e il

marker le sequenze identificate sono state definite ARS.

REPLICATORI: intera serie di sequenze nucleotidiche sufficienti per dirigere l’inizio della

replicazione. I replicatori includono un sito di legame per proteine iniziatrici che

determinano l’assemblaggio dell’apparato per l’inizio di replicazione e sequenze ricche

in AT che si aprono facilmente. INIZIO DELLA REPLICAZIONE

Le proteine iniziatrici legano specifiche sequenze

all’interno del replicatore, reclutano altre proteine

richieste per l’inizio della replicazione e in alcuni casi

piegano o svolgono una regione di DNA adiacente al

loro sito di legame.

INIZIO DELLA REPLICAZIONE IN E. COLI

Diverse copie d’iniziatore DnaA lega il replicatore oriC con un legame

 cooperativo.

Quando DnaA è associato all’ATP lega anche i siti ricchi di AT portando alla loro

 separazione formazione del complesso aperto

La DNA elicasi (DnaB) associata al caricatore (DnaC) viene reclutata grazie

 all’interazione son il ssDNA e con DnaA.

Il caricatore inserisce l’elicasi sul ssDNA a livello dell’origine.

 Il caricatore si stacca dall’elicasi causando la sua attivazione.

 Una molecola di elicasi è portata su ciascuno dei due filamenti singoli e si

 muovono in direzione 5’-3’.

L’elicasi recluta altri fattori alla forca replicativa.

 La primasi sintetizza i primer a RNA su entrambi i filamenti.

 L’oloenzima della DNA pol III interagisce con la giunzione innesco/stampo.

 Le sliding clamp vengono assemblate su ciascun primer e la sintesi del

 filamento inizia. SWITCHING DELLA POLIMERASI, EUCARIOTI

La replicazione inizialmente è portata avanti

da una polimerasi poco processiva e priva di

attività di proofreading. Dopo pochi

nucleotidi si ha uno switching delle

polimerasi in cui la polimerasi poco

processiva si allontana e ne subentrano due

processive.

La DNA pol α è composta di 4

subunità:

Contiene attività PRIMASICA +

 POLIMERASICA

Dopo la sintesi dell’innesco a carico della primasi l’attività polimerasica

 inizia la sintesi del nuovo filamento di DNA.

La DNA pol α non è altamente processiva ed è priva di attività di

 proofreading.

Interviene quindi la DNA pol ε/δ che è molto processiva = SWITCHING

 DELLA POLIMERASI

La DNA pol ε si inserisce sul leading strand (filamento continuo); la DNA

 pol δ si inserisce sul lagging strand (filamento ritardato).

LA FORCA REPLICATIVA: i due filamenti di DNA

vengono replicati contemporaneamente. Il filamento

discontinuo forma delle anse in modo tale che le DNA

polimerasi legate allo sliding clamp possano

procedere insieme. Nei procarioti, quando la

polimerasi si imbatte in un frammento di Okazaki si

dissocia dallo sliding clamp, si lega la DNA polimerasi

I che inizia a sostituire il primer a RNA con nucleotidi

del DNA, i frammenti saranno uniti dalla ligasi. Negli

eucarioti, la DNA polimerasi allontana il primer a RNA

che ha meno affinità, assume una

conformazione tridimensionale

riconosciuta da un’endonucleasi che lo

taglia.

Termine della replicazione nei procarioti: due forche replicative si scontrano l’una con

l’altra. Si arriva ad avere due molecole di DNA concatenate. La separazione è a carico

dell’enzima topoisomerasi IV che incide il DNA su entrambi i filamenti in modo tale che

si possa aprire, separarsi e poi chiudersi. Le topoisomerasi sono enzimi che incidono in

maniera temporanea il DNA. Le topoisomerasi di tipo I incidono un solo filamento in

modo tale che possa effettuare un giro e allentare la tensione. Le topoisomerasi di tipo

II rompono entrambi i filamenti di DNA utilizzando energia.

Terminazione negli eucarioti: i cromosomi non sono circolari,

ma lineari. Nei filamenti di nuova sintesi vengono mantenuti

i primer a RNA che vengono rimossi il DNA si ritrova con

regioni a singolo filamento a cui non si può legare una DNA

polimerasi perché è in direzione opposta. Questa situazione

è risolta dall’enzima telomerasi, enzima che replica i

telomeri, senza il quale perderemmo un sacco di paia di

basi ai telomeri.

La telomerasi allunga l’estremità 3’ fin quando non è

abbastanza lunga da funzionare come stampo per un

filamento di okazaki. La telomerasi polimerizza DNA con uno

stampo a RNA che essa stessa porta. Le sequenze

telomeriche sono riconosciute da proteine che vi si legano e

segnalano che i telomeri non sono punti di rottura dei

cromosomi.

Le cellule somatiche non hanno le telomerasi,

progressivamente i telomeri si accorciano e muoiono.

TRASCRIZIONE: SCOPERTA DEGLI RNA MESSAGGERI

Il concetto che un RNA messaggero potesse trasformare informazioni dal gene al

ribosoma segue immediatamente la scoperta della doppia elica del DNA. Crick

propone che ogni ribosoma specializzato trascriva una proteina. Jacob, Brenner e

Meselson propongono in alternativa che non esistano ribosomi specializzati ma al

contrario questi traducano RNA chiamati messaggeri.

Premessa all’esperimento per verificare l’ipotesi di Crick:

Quando il fago T2 infetta Coli blocca la produzione delle proteine batteriche

o mentre promuove la sintesi delle proteine virali. Se l’ipotesi di Crick è corretta la

nuova sintesi dovrebbe portare alla produzione di nuovi ribosomi contenenti

RNA fagici.

Vado a marcare i ribosomi di Coli (pesanti) facendo crescere Coli in terreno con

o azoto pesante.

Infetto Coli con il fago T2.

o Trasferisco Coli infettato in un terreno leggero. I ribosomi fagici saranno leggeri

o (e quindi le proteine), ma marco l’RNA radioattivamente aggiungendo fosforo

pesante.

Crick aveva proposto che fosse l’RNA ribosomale a contenere il messaggio per

o la sintesi delle proteine. Se fosse stato così allora interi nuovi ribosomi

contenenti RNA ribosomali specifici del fago sarebbero dovuti essere prodotti

dopo l’infezione da parte del fago.

L’RNA radioattivo deve quindi associarsi con i ribosomi leggeri.

o Secondo l’ipotesi di Jacob, l’infezione da parte del fago determinerebbe la

o sintesi di nuovi RNA messaggeri marcati radioattivamente, specifici del fago.

Questi si assocerebbero con i ribosomi batterici pesanti.

Purifico i ribosomi e li centrifugo su un gradiente di densità. Osservo dove si è

o associato l’RNA radioattivo. Se Crick ha ragione gli RNA devono associarsi solo a

ribosomi leggeri. FALSO: non esistono ribosomi specializzati, ma sono gli RNA

che portano l’informazione. I ribosomi sono costanti e la natura dei polipeptidi

da essi sintetizzati dipende dall’mRNA che a loro si associa.

TRASCRIZIONE: copia dell’informazione da DNA a RNA. Avviene in direzione 5’-3’.

Segue le regole di appaiamento della replicazione del DNA. Questo appaiamento

garantisce un trascritto che è una copia fedele del gene. È catalizzata dalla RNA-

polimerasi. A differenza della replicazione, la trascrizione non richiede un innesto e

interessa solo precisi tratti del DNA.

Perché non si traduce direttamente dal DNA? Per tenere raccolta e compatta

l’informazione genetica e non dover aprire continuamente il DNA. Inoltre tramite l’RNA

ho una maggiore amplificazione.

Gli RNA possono essere:

Monocistronici: portano l’informazione di un solo gene (eucarioti).

o Policistronici: portano l’informazione di più geni (procarioti).

o

LE FASI DELLA TRASCRIZIONE:

1. Inizio: la RNA-polimerasi si aggancia al promotore, una sequenza che determina

la direzione della trascrizione e il punto di inizio. Si formano i primi legami

fosfodiesterici.

2. Allungamento: la RNA-polimerasi accelera il processo per copiare il DNA il più

velocemente possibile. L’enzima diventa processivo.

3. Terminazione: la trascrizione termina nel momento in cui la RNA-polimerasi

riconosce dei segnali di stop.

Com’è fatto un gene:

Promotore (non viene trascritto) e sequenze coinvolte nella regolazione

o dell’espressione.

Sequenze che devono essere trascritte

o

Trascritto maturo:

Regione al 5’ chiamata 5’UTR: untraslated region. È trascritta ma non verrà

o tradotta. Sono regioni che proteggono e stabilizzano il trascritto.

Codone di inizio

o Parte codificante

o Codone di stop

o 3’UTR.

o

RNA-polimerasi batterica: è affine alle cariche negative. Eseguo una filtrazione su gel

che mi separa le proteine in base al peso molecolare, indipendentemente dall’affinità

al DNA. Faccio poi una colonna a scambio ionico per separare in base all’affinità.

Si carica l’estratto proteico sulla colonna e raccolgo in diverse provette:

Input: provetta che contiene l’estratto puro caricato in colonna. In questo modo

 ho un controllo di tutto ciò che ho caricato.

Ciò che si potrebbe legare al lavaggio

 Campione con eluente

Viene fatta un’ultima colonna di fosfocellulosa con ciò che è stato eluito, faccio un

profilo di eluizione con NaCl. Vedo in quali provette si rileva attività enzimatica. Si

ottiene la separazione del complesso in due picchi: in uno c’è solo la proteina sigma,

nell’altro tutte le altre proteine. Si fa un saggio di RNA polimerasi: prendo le proteine

faccio partire una trascrizione e vedo se c’è RNA polimerasi. Si vede che le proprietà

chimiche del complesso di proteine cambiano in base alla presenza di sigma. Sigma è

un componente che ne influenza l’attività.

L’attività polimerasica batterica è composta da un core (complesso di proteine). Nel

momento in cui si aggiunge sigma si forma l’oloenzima. L’oloenzima batterico ha

un’attività di trascrizione molto più efficace.

La subunità sigma è quella che si unisce al core e che permette all’enzima di

riconoscere specificatamente il promotore e iniziare la trascrizione. Il core è

maggiormente affine alle sequenze che non sono il promotore.

All’inizio della trascrizione, l’oloenzima scorre lungo il DNA fino a trovare la sequenza

del promotore e si lega per un tempo sufficiente a permettere la separazione del DNA

e l’inizio della trascrizione. Dopo la formazione di alcuni legami fosfodiesterici, sigma si

sgancia dal core e la trascrizione prosegue.

TRASCRIZIONE IN COLI Si forma l’oloenzima.

 Scanning del DNA per

 trovare il promotore.

Formazione del

 complesso chiuso.

Denaturazione del

 DNA, energeticamente

sfavorevole. Richiede

tempo, la polimerasi

non deve staccarsi in

fretta.

Si passa al complesso

 aperto.

RNA polimerasi inizia

 la trascrizione

incorporando

nucleotidi e a formare

legami fosfodiesterici. Non servono primer.

Si forma il complesso di inizio della trascrizione. I primi legami vengono formati

 lentamente. Spesso si ha un inizio abortivo.

Fase di allungamento. RNA polimerasi diventa processiva. Sintetizza legami

 molto velocemente. Questo succede perché si ha la fuoriuscita di sigma, che

continua a richiamare l’enzima verso il promotore.

Il core è maggiormente affine alle sequenze non promotrici, quindi scorre

 velocemente lungo il DNA e sintetizza legami.

L’allungamento prosegue fin quando non si arriva al segnale di terminazione

 della trascrizione che determina lo stacco dell’RNA polimerasi.

L’RNA si stacca dal complesso e il core viene liberato dal DNA.

PRIBNOW: è il primo che ricerca il promotore.

Stabilizza un complesso chiuso non fornendo ribonucleotidi (non può partire la

trascrizione). Inserisce una esonucleasi che rompe il

DNA fin quando non incontra l’enzima (ingombro

sterico). Rimane quindi solo la sequenza promotore

che vado a sequenziare.

Pribnow trova 5 sequenze diverse nel promotore. Trova

all’interno delle sequenze promotrici una sequenza

conservata a -10 che è T A T A A T. Trova inoltre che la

trascrizione inizia sempre con A.

La regione -10 non è però sufficiente a definire un promotore di Coli, c’è altro.

Prendono le sequenze promotrici isolate, aggiungono l’oloenzima e deve formarsi

necessariamente il complesso chiuso. Non si forma, quindi quello che ha isolato

Pribnow non è tutto il promotore.

Si prendono 100 geni di cloni e si clonano le sequenze che vanno dall’inizio di

trascrizione verso l’indietro. Allineano le sequenze e osservano cosa c’è in comune.

PROMOTORE DI COLI:

L’inizio di trascrizione non è necessariamente A ma basta che sia una purina.

 C’è una sequenza -10: è la sequenza che più serve per la formazione del

 complesso aperto. Se ho una mutazione si forma il complesso chiuso ma si

forma difficilmente il complesso aperto. Il

complesso chiuso si dissocia anche prima di iniziare

la trascrizione. È estremamente ricca di nucleotidi

che formano due legami idrogeno quindi si facilita

la formazione del complesso aperto e la

denaturazione del DNA (regione ricca in AT).

C’è una sequenza -35: è quella sequenza che

 maggiormente serve per la formazione del

complesso chiuso. È il primo punto di aggancio

riconosciuto da sigma. Se avviene una mutazione si

forma difficilmente il complesso chiuso.

La distanza ottimale che separa -10 e -35 è di

 16/18 paia di basi. Rafforzo il promotore, nel caso in

cui la distanza non sia proprio ottimale, mettendogli

accanto dei siti di legame per fattori trascrizionali che interagiscono con la RNA

polimerasi e la tengono legata al DNA.

A un promotore fatto in questo modo si lega l’oloenzima e si forma il complesso

chiuso.

FORZA DI UN PROMOTORE: numero di trascritti che iniziano dal promotore nell’unità di

tempo (senza considerare i trascritti abortivi). Dipende da:

1. Affinità della RNA polimerasi per il promotore.

2. Da quanto efficacemente si forma il complesso chiuso e da quanto facilmente si

passa al complesso aperto.

3. Da quanto facilmente avviene il promoter clearance.

La trascrizione basale non richiede l’intervento di fattori trascrizionali, a differenza di

quella regolata. Coli usa sostanzialmente una trascrizione basale. I suoi geni sono

trascritti tanto o poco in funzione solo del promotore (il genoma di Coli è infatti molto

compattato). Ci sono quindi promotori forti, che più si avvicinano alle consensus

(sequenze rappresentative), e promotori deboli che sono invece diversi dalle sequenze

consensus: la RNA polimerasi si lega malvolentieri. Nel caso di un promotore debole

durante la trascrizione deve essere aiutato, viene stimolato solo quando deve entrare

in funzione.

Dimostrazione: induco delle mutazioni UP a livello dei promotori e ne vedo l’efficacia.

IL FATTORE SIGMA: ha due subunità che si attaccano alle sequenze -35 e -10. La RNA

polimerasi ha poi una coda che interagisce con le sequenze per i fattori trascrizionali.

Nella trascrizione regolata ho un elemento repressore che lega una sequenza bersaglio

detta OPERATORE. Se è legato il repressore o è impedito il legame dell’RNA polimerasi

o la RNA polimerasi non riesce ad andare avanti. I parametri che determinano chi dei

due rimane legato sono l’affinità e la concentrazione delle due proteine. Nel caso

dell’attivazione,

l’attivatore si posiziona a

monte del promotore e

interagisce con la coda

della RNA polimerasi.

Gli attivatori di Coli, in

genere, aumentano la

possibilità di formazione

del complesso chiuso.

Esistono fattori

trascrizionali che

cambiano la geometria

della RNA polimerasi in

modo tale da aiutare il

promotore a denaturarsi in

-10.

In alcuni casi particolari vengono utilizzati fattori sigma che riconoscono sequenze a

-35 e a -10 diverse e si producono proteine che intervengono in situazioni estreme

(shock termico, stress). Come ho scoperto sperimentalmente questa cosa in vitro:

A. EMSA (Electrophoretic mobility shift assay)

Utilizzo un saggio che mi permette di visualizzare un cambiamento di mobilità

elettroforetica. Vogliamo vedere se un sigma diverso riconoscere il promotore classico

il complesso proteina-DNA migra più lentamente del DNA libero.

 Prendo DNA che contiene le sequenze -35 e -10 canoniche e lo rendo radioattivo

 (lo trasformo in una sonda).

Prendo due provette e metto uguale quantità di sonda.

 In una aggiungo la proteina sigma diversa; nell’altra non aggiungo nulla

 (controllo).

Incubo con tutte le dovute condizioni per far avvenire il legame.

 Eseguo un’elettroforesi: la proteina legata al DNA tenderà a migrare verso il

 polo positivo.

Osservo le bande: se ho due bande differenti vuol dire che la proteina è legata.

 Ho due bande perché il DNA a cui è legata la proteina viene rallentato rispetto

al DNA libero. Come controllo posso usare anche sigma 70 poiché so che lega.

Se voglio capire quale dei due sigma è più affine alla mia sonda metto in

 entrambe le provette del DNA freddo che non c’entra nulla con l’esperimento

(competitore aspecifico). La proteina più affine al DNA si legherà maggiormente

alla sequenza specifica e non al DNA freddo.

Se il competitore freddo è specifico avrò una diminuzione del segnale.

Ci dice se la proteina riconosce la sequenza che ho usato come sonda.

B. FOOTPRINTING: la proteina dove si lega rispetto al promotore. Si va a vedere

l’impronta che una proteina lascia sulla sonda quando si lega.

Ho una sonda e mi chiedo dove viene contattata. La sonda deve essere marcata ad

una sola estremità.

Metto la sonda in due provette, di cui una è il controllo.

 Nella seconda provetta aggiungiamo la proteina e faccio avvenire il binding.

 Aggiungo in entrambe le provette DNAsi, una endonucleasi (idrolizza legami

 fosfodiesterici all’interno della molecola).

La DNAsi taglia tutte le molecole in provetta. Dove incontrerà la proteina nella

 provetta due non taglierà.

Faccio una elettroforesi per separare filamenti che differiscono per un singolo

 nucleotide. L’elettroforesi della seconda provetta evidenzierà un buco che

corrisponde alla regione in cui è legata la proteina.

RNA POLIMERASI

Forma di chela di granchio che si conserva sia nei procarioti che negli eucarioti. Le

subunità beta sono quelle che formano la chela vera e propria: creano una cavità

esattamente delle dimensioni per far entrare una doppia elica di DNA. Il suo

funzionamento è dipendente dal magnesio, individuato dagli amminoacidi, dove si

trova il sito catalitico. La subunità alfa serve per l’assemblaggio e per il riconoscimento

del promotore. Omega si lega alla beta stabilizzandola e aiutandola a entrare nel

complesso del core. Abbiamo un canale per l’ingresso dei ribonucleotidi, un canale da

cui esce l’RNA e un canale di uscita del DNA. C’è poi un timone che

mantiene il DNA a singolo

filamento.

Durante la trascrizione, il

DNA forma dei

superavvolgimenti verso le

estremità, punti di grossa

tensione che devono essere

risolti da enzimi

(topoisomerasi).

ALLUNGAMENTO

Si ha un ulteriore cambio conformazionale che porta la RNA polimerasi ad ancorarsi

più saldamente allo stampo. L’enzima svolge il DNA di fronte e lo riavvolge dietro;

stacca l’RNA nascente dallo stampo mentre si muove lungo il filamento. Funziona da

correttore di bozze: l’ibrido di DNA e RNA ha una conformazione non regolare nel

momento in cui è introdotto un ribonucleotide errato.

TERMINAZIONE

Coli possiede con la stessa frequenza due terminatori in dipendenza dal gene:

Terminatori intrinseci o rho-indipendente: utilizza solo la RNA polimerasi. I

 terminatori sono costituiti da due elementi: una sequenza palindromica di 20

nucleotidi a cui segue un piccolo segmento di circa 8bp di A-T (nell’RNA avrò

una catena di U). Nell’RNA le sequenze palindromiche si avvolgono e si crea

un’ansa in corrispondenza della regione spaziatrice. Questa struttura crea un

problema nella continuazione della trascrizione e l’enzima rallenta (pausa di 60

secondi). La regione ricca in U destabilizza l’ibrido di due acidi nucleici e l’RNA e

la polimerasi si dissociano.

Terminatori rho dipendenti: serve un fattore proteico aggiuntivo. Il fattore rho

 legge una sequenza particolare, accompagna la RNA polimerasi e si lega al

punto dell’RNA in cui è trascritta la sua sequenza di riconoscimento. Quando si

aggancia alla sua sequenza, rho idrolizza ATP e fa distaccare RNA e RNA

polimerasi.

FRET: tecnica che mi consente di vedere se due proteine interagiscono in vivo. Sfrutta

uno scambio di energia che può avvenire solo tra molecole che sono molto vicine.

Marco le proteine con due fluorocromi: la luce emessa da una proteina deve essere

eccitatoria della seconda. Eccito la prima

 proteina con luce viola

emette luce blu.

La pongo vicino a una

 seconda molecola che

eccitata con luce blu

emette luce verde.

PRIMO CASO: non ho

 emissione di luce

verde no

interazione

SECONDO CASO: ho

 emissione di luce

verde le proteine

stanno interagendo.

REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI

L’adattamento alle differenti condizioni ambientali e fisiologiche si realizza tramite la

regolazione dell’espressione genica. Regolare l’espressione genica significa regolare la

quantità di prodotto funzionale (proteina). I geni che sono sempre espressi sono detti

costitutivi e in genere codificano per funzioni sempre necessarie alla cellula; i geni

soggetti a regolazione vengono espressi solo per specifiche necessità della cellula e in

risposta a specifici segnali. I punti in cui posso controllare l’espressione genica sono i

punti in cui posso cambiare qualcosa al fine di ottenere una proteina funzionale:

Regolazione dell’inizio di trascrizione: i più comunemente usati giocano sulla

 modulazione dell’interazione proteina-proteina o proteina-DNA. Per esempio

agisco sui fattori trascrizionali per influenzare la trascrizione (migliorata o

peggiorata).

Processamento dell’RNA

 Stabilità dell’RNA

 Sintesi proteica

 Modificazione della proteina

 Trasporto proteico

 Regolazione della degradazione del trascritto (vita media del trascritto) tramite

 i non coding RNA.

I meccanismi iniziali sono usati nella regolazione efficiente (risparmio di energia)

mentre quelli finali sono per la regolazione rapida.

Possiamo avere degli attivatori o dei repressori che si legano a siti specifici:

Regolazione positiva: il promotore ha una sequenza tale per cui la RNA

 polimerasi forma difficilmente il complesso chiuso. Aggiungo un fattore

trascrizionale che aiuti la proteina a legarsi correttamente.

Regolazione negativa: il repressore si lega e la RNA polimerasi non si può

 legare.

Ho anche molecole effettrici che si legano agli attivatori o ai repressori in modo tale da

cambiare le sorti della trascrizione. L’attivatore o il repressore sono regolati

allostericamente tramite gli effettori che li rendono in grado di legarsi o meno.

RNA MESSAGGERI POLICISTRONICI E OPERONI

I batteri hanno raggruppato i geni tra loro correlati funzionalmente così da poterli

regolare nello stesso modo più facilmente. i promotori batterici sono spesso posizionati

a molte di molti geni che operano in un unico pathway metabolico. La trascrizione

produce un rna messaggero policistronico. Un OPERONE è un’unità di espressione e

regolazione genica batterica, comprendente geni strutturali ed elementi di controllo

(tra cui il promotore).

Operone Lattosio:

Si segue la curva di crescita di Coli in un mezzo che contiene sia glucosio che lattosio.

Si ha una prima crescita esponenziale in cui Coli utilizza glucosio; c’è poi un momento

di stallo di circa un’ora in cui il glucosio è esaurito; riprende la crescita esponenziale

utilizzando il lattosio. Quello che Coli fa nel momento di stallo è regolare la propria

espressione genica per tradurre gli enzimi necessari al metabolismo del lattosio.

Si scopre che quando Coli stalla inizia la sintesi di tre proteine regolate da diversi geni:

Lac Z beta galattosidasi: scinde lattosio in glucosio e galattosio

 

Lac Y galattoside permeasi: si inserisce nella membrana della cellula e

 

permette l’ingresso del lattosio.

Lac A transacetilasi: facilita la rimozione di galattosidi tossici importati

 

insieme al lattosio.

Lac I gene repressore che ha un proprio promotore. È un gene costitutivo che

 

viene sempre scritto e tradotto. In assenza di lattosio Lac I produce un

repressore che si lega all’operatore e impedisce il legame della RNA polimerasi.

In presenza di lattosio questo si lega al repressore che cambia conformazione,

perde affinità per l’operatore e l’RNA polimerasi può trascrivere.

L’analisi dei mutanti ha permesso di capire il meccanismo con cui lavora l’operone Lac

e come funzionano Lac I (regolatore) e Lac O (operatore).

Organismo aploide con fenotipo mutante Lac I: non viene prodotto il repressore,

 è consentita l’espressione dei geni Lac.

Se a un merodiploide (organismo aploide con una porzione di cromosoma

 diploide) aggiungo un plasmide che porta Lac I funzionale (wild-type) viene

prodotto il repressore che reprime i geni Lac di entrambi i cromosomi. Il

repressore agisce in trans.

Se muta l’operatore, il repressore non si lega permettendo l’espressione dei

 geni Lac.

Se aggiungiamo un plasmide con operone Lac funzionale, la mutazione

 dell’operatore permette l’espressione dei geni Lac sullo stesso cromosoma

anche se è presente un operatore wild-type sull’altro cromosoma (i geni non si

esprimono). L’operatore agisce in cis.

In genetica gli elementi che operano in cis sono quelli che devono essere fisicamente

collegati per avere un effetto; gli elementi che operano in trans possono agire anche

quando non sono fisicamente collegati, sintetizzano un prodotto diffusibile.

Controllo dell’operone Lac

A. Il controllo dell’operone consta di due elementi: un repressore proteico (il

repressore Lac, sintetizzato dal gene Lac I) e una sequenza di DNA detta

operatore (Lac O) a cui si lega il repressore. Se non c’è lattosio, i geni Lac non

vengono trascritti perché il repressore è legato al sito operatore e questo

legame impedisce l’attacco della RNA polimerasi. Quando invece è presente

lattosio, viene prodotta una piccola quantità di allolattosio (isomero del lattosio)

il quale funziona da induttore dell’operone Lac: l’allolattosio si lega al repressore

determinandone la perdita di affinità e la dissociazione dall’operatore. Con il

distacco del repressore, l’operone si attiva perché l’RNA polimerasi può iniziare

a trascrivere.

B. Un altro fattore che influenza l’espressione dei geni Lac è la disponibilità di

glucosio, la principale fonte energetica di E. Coli. Quando è presente glucosio

entra in gioco un meccanismo di regolazione noto come repressione da

catabolita. In presenza di glucosio, quindi, l’operone Lac non viene espresso.

L’effetto del glucosio sull’operone è mediato dal cAMP e dalla sua proteina

recettore CRP. Quando manca glucosio, il complesso CRP-cAMP si lega ad una

regione vicina al promotore stimolando la trascrizione.

La regolazione del lac-operone avviene a due livelli:

Il repressore Lac opera una regolazione negativa. L’operone è inducibile in

 quanto il repressore viene staccato dall’induttore, l’allolattosio dipende dalle

concentrazioni di lattosio.

Il complesso cAMP-CAP opera una regolazione positiva, inducendo livelli di

 trascrizione più alti dipende dalla concentrazione di glucosio.

Operone Triptofano:

Contiene i cinque geni che codificano gli enzimi necessari a sintetizzare il

corrispondente amminoacido. È controllato negativamente dal repressore Trp e il

triptofano stesso agisce come molecola effettrice (corepressore) per il repressore. La

repressione avviene quando l’amminoacido triptofano è in eccesso. È una regolazione

diversa da quella negative dell’operone Lac, in cui il repressore lega l’operatore

quando non c’è l’induttore allolattosio. Oltre alla regolazione negativa del

repressore, c’è un altro sistema di

controllo che è l’attenuazione. È un

meccanismo di regolazione che entra in

gioco una volta che è allentata la

repressione ed è iniziata la trascrizione:

la trascrizione inizia normalmente ma

viene interrotta prima che i geni

dell’operone siano stati trascritti.

L’attenuazione è regolata dalla

concentrazione di triptofano. In caso di

basse concentrazioni di triptofano, la

RNA polimerasi scorre lungo

l’attenuatore e in questo modo i geni

strutturali vengono trascritti; in caso di

alte concentrazioni di tirptofano,

l’attenuatore causa la terminazione

prematura della trascrizione e i geni

strutturali non vengono trascritti.

Il meccanismo dell’attenuazione si basa

su una regione detta sequenza leader

(Trp L) che precede il codone di inizio del primo gene. All’interno della sequenza leader

ci sono quattro regioni di regolazione, numerate da 1 a 4. Le regioni 3 e 4, nel

trascritto RNA, possono appaiare le proprie basi per formare un terminatore, una

struttura a forcina ricca di legami GC seguita da una serie di residui di U. La

formazione del terminatore porta l’RNA polimerasi a terminare prematuramente la

trascrizione e a staccarsi dal DNA prima che i geni dell’operone possano essere

trascritti. La regione 3 può però appaiarsi anche con la regione 2: in questo modo il

terminatore (3-4) non si può formare, si forma una forcina che però non interrompe la

trascrizione. L’appaiamento delle regioni viene

stabilito dalla regione di regolazione

1 e dalla disponibilità di triptofano:

la regione 1 codifica per un peptide

leader di 14 amminoacidi, di cui

due sono triptofano. Il peptide

leader non ha alcuna funzione

cellulare, la sua sintesi è un puro

strumento di regolazione

dell’operone. Questo peptide viene

tradotto non appena l’RNA leader è

trascritto. Quando c’è molto

triptofano, anche la concentrazione

trp

di Trp-tRNA è alta. Questo

permette alla traduzione di

procedere velocemente oltre i due

codoni trp della sequenza 1 e nella

sequenza 2 prima che la sequenza

3 venga trascritta. In questa

situazione il ribosoma occupa la

regione 2, impedendo il legame con

la regione 3 che può invece

appaiarsi alla 4 formando la forcina di terminazione. Al contrario, quando la

concentrazione di trp è bassa, il ribosoma si blocca sulla regione 1 a livello dei due

codoni trp. La regione 2 e la regione 3 possono quindi appaiarsi, non si forma la forcina

di terminazione e la trascrizione procede. La quantità di trascritti prematuri diminuisce

al diminuire della concentrazione di trp.

Risposta SOS

Sono meccanismi che intervengono in caso di danno al DNA causato da rotture o

mutazioni del cromosoma batterico. La risposta SOS richiede l’intervento di due

proteine regolatrici: RecA e il repressore LexA. I geni SOS codificano per proteine utili

alla cellula con DNA danneggiato.

Il repressore LexA inibisce la

trascrizione dei geni SOS (in situazioni

di non danno genomico) legandosi

vicino ai loro promotori. L’induzione

della risposta SOS richiede la

rimozione di LexA: questa si inattiva

catalizzando un autotaglio di un

legame peptidico. Questa reazione di

autotaglio è catalizzata da RecA. Un

pesante danno al DNA causa la

formazione di numerosi interruzioni a

filamento singolo, a cui si lega RecA

con elevata affinità. Avvenuto il

legame, si facilita l’autoinattivazione di LexA e quindi la possibilità di esprimere i geni

della risposta SOS.

TRASCRIZIONE EUCARIOTICA

Come per i batteri, il livello basale della trascrizione eucariotica è determinato

dall’effetto delle sequenze di regolazione sulla funzione dell’RNA polimerasi e sui

fattori di trascrizione associati. Il genoma eucariotico è impacchettato nella cromatina

che costituisce un blocco fisico per le RNA polimerasi e quindi la maggior parte dei

geni eucariotici è repressa nella sua condizione di default. Per l’attivazione di ogni

gene è necessario l’intervento di più proteine regolatrici e di conseguenza i promotori

sono molto più complessi e contengono molti siti di legame per le proteine regolatrici.

Inizialmente si pensava ci fossero due RNA polimerasi eucariotiche. L’ipotesi nasceva

dall’osservazione che i geni ribosomiali differiscono dagli altri geni nucleari per alcuni

aspetti:

1. Hanno una diversa composizione di basi

2. Sono ripetuti

3. Si trovano in un compartimento diverso chiamato nucleolo: contiene circa 1000

geni ribosomiali insieme a tutto ciò che serve per trascriverli

Nel 1969, grazie agli esperimenti di Roeder e Rutter, si scoprì che le RNA polimerasi

eucariotiche sono tre. Saggiando poi le tre proteine con α-amanitina (polipeptide

tossico) si sono determinate le caratteristiche peculiari di ciascuna polimerasi:

1. RNA pol I: rimane attiva anche ad alte concentrazioni di tossina. Trascrive geni

per gli RNA ribosomali 28S, 5,8 S e 18S.

2. RNA pol II: viene fortemente inibita dall’amanitina poiché la tossina si lega in

posizione tale da ridurre la flessibilità della molecola necessaria alla

traslocazione dell’enzima lungo il DNA substrato. Trascrive i geni codificanti per

proteine (mRNA) e i geni per i piccoli RNA nucleari.

3. RNA pol III: ad alte concentrazioni di tossina anche questa viene inibita.

Trascrive geni per i tRNA, RNA ribosomali 5S e piccoli RNA nucleolari e

citoplasmatici.

Hanno subunità che ricordano quelle procariotiche. Condividono una parte del

complesso enzimatico con la polimerasi procariotica a cui si sono andate sommando

subunità che differiscono a seconda della RNA polimerasi che stiamo osservando.

L’unica grossa differenza tra procariotiche e eucariotiche è che nella polimerasi II

eucariotica è presente una coda carbossiterminare (CTD) importante nella regolazione

dell’inizio di trascrizione dei geni di classe II (RNA messaggeri) devono essere

fortemente regolati.

TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI

Le RNA polimerasi eucariotiche sono incapaci da sole di legarsi ai rispettivi promotori.

Per poter riconoscere il promotore devono essere aiutate da fattori di trascrizione

(negli eucarioti non c’è trascrizione basale). Sono necessari fattori generali

trascrizionali e fattori di trascrizione gene specifici. Tutti i geni si avvalgono dei fattori

generali, mentre quelli geni specifici regolano in modo più fine la trascrizione di

determinati geni.

Ciclo di trascrizione:

1. RNA polimerasi riconosce il promotore aiutata dai fattori trascrizionali.

2. Si forma la bolla di trascrizione.

3. Il CTD viene fosforilato e abbiamo una fase di inizio abortiva.

4. Complesso aperto e fase di allungamento.

5. Fase di terminazione.

6. Distacco dal promotore.

Ogni passaggio è molto complicato perché richiede l’intervento di moltissime proteine.

In vitro è relativamente semplice avviare la trascrizione, in vivo è più difficile perché

sono presenti i nucleosomi che rendono difficile il riconoscimento del promotore

(devono intervenire molte più proteine).

FATTORI TRASCRIZIONALI E DOMINI DI BINDING AL DNA

Il riconoscimento del DNA da parte di un fattore trascrizionale avviene quasi sempre

tramite le catene laterali di alcuni amminoacidi di un’alfa elica denominata elica di

riconoscimento.

Si isola la regione di binding di n fattori trascrizionali e la si confronta. Non sono tutti

uguali ma possono essere racchiusi in famiglie simili per struttura ma non per

sequenza.

Le tre strutture principali dei siti di binding sono:

Motivo elica-giro-elica: i regolatori batterici in

 genere presentano il motivo elica-giro-elica per

presentare l’elica di riconoscimento al DNA e

anche molte proteine regolatrici eucariotiche

interagiscono in questo modo. Si compone di 60

aa, necessari e sufficienti che continuano a

legare la sequenza di DNA. Non hanno

conservazione di sequenza ma di struttura: due

alpha eliche antiparallele una regione flessibile

legata da un’alpha elica (giro), che è

perpendicolare alla struttura. L’homeobox deve

essere molto affine alla sequenza, ma poco

affine al DNA → ha una regione con affinità

generica, bassa, per il DNA e una regione per

un legame molto specifico (elica III). L’elica III si

infila nel solco maggiore e fa legame sequenza

specifico. Per capire chi è specifico a cosa si fa un

esperimento di swapping, cioè si cambiano le varie

eliche con eliche di diversa provenienza. L’elica III,

una volta sostituita, va a legarsi alla regione propria

della nuova.

Zinc finger, struttura con tante cisteine e istidine in

 una struttura che le tiene alla stessa distanza. È

stato scoperto sul fattore TFIIA. È formato una

struttura ripetitiva da 7-11 atomi di zinco per

molecola. Si forma un dominio con due beta shift

antiparalleli e un’alpha elica tenuti vicino dai residui di cisteina e istidina che

coordinano un atomo di zinco. Le beta shift reagiscono in maniera aspecifica

presentando l’elica nella giusta posizione e l’alpha elica interagisce in maniera

specifica con il solco maggiore e le basi del DNA. Lo zinco è fondamentale per

mantenere unita la struttura: ciascun dito di zinco riconosce tre basi (poco

specifica) → servono dai tre zinc finger in su per far funzionare il binding.

Multi cysteine zinc finger: due dita di zinco

 costituiscono il dominio. Non ha contatti

evolutivi con il cysteine zinc. Originariamente è

stato ritrovato nei membri della famiglia dei

recettori nucleari. Lo zinco è coordinato da

quattro residui di cisteina ed è fondamentale

per il binding. Una regione ad elica di un dito è

fondamentale per

il riconoscimento

sequenza-specifico

e si lega al solco

maggiore del DNA.

Altre regioni nel

primo o nel

secondo dito

determinano la

distanza tra i due

siti palindromici o

ripetuti

riconosciuti.

Leucine zipper

 (bZIP): è un’alfa elica anfipatica (sia

idrofobica che idrofila) con una serie di

residui amminoacidici idrofobici

concentrati su un lato dell’elica. È

presente un residuo di leucina ogni

sette posizioni per formare una

superficie idrofobica su un lato dell’elica, il punto in cui dimerizzano due

subunità identiche. Mutazioni nelle leucine zipper aboliscono il legame al DNA e

la dimerizzazione. Mutazioni nel dominio basico aboliscono il legame al DNA ma

non la dimerizzazione. Esperimenti di swapping mostrano come il dominio

basico sia importante per la specificità di sequenza, mentre non lo è il leucine

zipper. Se si fa dimerizzare artificialmente il solo dominio basico, questo lega il

DNA con la corretta specificità in assenza del leucine zipper. Quindi il leucine

zipper è importante per il legame al DNA ma non è il dominio di binding.

DOMINI DI REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE

I domini di attivazione sono maggiormente studiati di quelli di repressione poiché allo

stato di default il DNA è spento. I tre domini di attivazione più comuni sono GAL4 acid

domain, Sp1 glutamine-rich domain e B. CTF/NFI prolin-rich domain.

Definisco dominio di attivazione una sequenza polipeptidica che attiva la trascrizione

quando fusa con un motivo di legame al DNA. Non hanno una struttura ben definita

ma hanno alcune caratteristiche comuni:

Alcuni sono molto acidi contengono molto aspartato e glutammato. Facendo

 

una mutagenesi in cui progressivamente si tolgono residui amminoacidi acidi si

è dimostrato che riducendo la carica si perde anche la capacità di attivatori.

Alcuni sono ricchi di glutammina

 Alcuni sono ricchi di prolina

In soluzione sono spesso destrutturari e assumono una conformazione solo grazie

all’interazione con un coattivatore. ESEMPIO: il dominio di attivazione di una proteina

virale (VP16) deve interagire con un TAF. VP16 è carico negativamente, il TAF è carico

positivamente; quando interagiscono in maniera aspecifica (grazie alla carica) la

proteina virale cambia conformazione e assume una struttura ad alfa-elica. Una volta

assunta la struttura, su VP16 ci sono tre aminoacidi che interagiscono in modo

altamente specifico con il TAF.

In generale i domini di attivazione sono superfici adatte a mediare interazioni proteina-

proteina attraverso le quali può avvenire il reclutamento dei diversi componenti del

macchinario trascrizionale. Assumono una struttura definita in seguito all’interazione

con un coattivatore. Un attivatore trascrizionale può funzionare come rimodellatore

della cromatina, ripulisce la cromatina rendendo libera la TATA. Gli attivatori possono

quindi aiutare a pulire dalla cromatina, possono aiutare a formare il complesso chiuso

e aperto.

Esistono anche i repressori che hanno un dominio di binding e un dominio di

repressione come per gli attivatori. Se si lega il repressore non si può legare

l’attivatore e viceversa. Se il repressore interagisce con l’attivatore, quest’ultimo non

può funzionare perché non può comunicare con i TAF.

Se il fattore trascrizionale chiude la cromatina anziché aprirla, il gene è spento.

PROMOTORE DI CLASSE II

La maggior parte dei promotori si trova a monte del gene da trascrivere.

 Ci si aspettavano delle sequenze consensus per trovarle prendo un tot di

 

geni, ne sequenzio la sequenza all’inizio di trascrizione, le allineo e guardo cosa

c’è in comune.

Normalmente c’è una regione vicino all’inizio di trascrizione che contiene il core

 promoter fondamentale per la trascrizione e siti di binding per fattori

trascrizionali.

I promotori sono dotati anche di sequenze enhancer/silencer, sequenze che

 possono amplificare/silenziare di molto la trascrizione e che possono essere

localizzati anche lontano dal promotore.

CORE PROMOTER (-40 +50):

Elemento centrale del promotore; senza il core promoter non c’è trascrizione.

 Lega e controlla l’assemblaggio del complesso di pre-inizio (complesso chiuso).

 Posiziona l’inizio di trascrizione e stabilisce la direzione. Se allontano il core

 promoter dal gene, l’inizio di trascrizione si sposta di conseguenza. Se giro il

core promoter, la trascrizione avviene nel senso opposto.

Risponde agli attivatori o ai repressori distali. A monte del core inserisco un

 complesso per il fattore trascrizionale che andrà ad influenzare la trascrizione.

Per dimostrare che il core promoter risponde al fattore trascrizionale, tolgo il

core promoter dalla sequenza non ho trascrizione.

Ha una o più sequenze consenso tra -40 e + 50. La principale è la TATA box che

 serve a formare il complesso chiuso. È presente su molti promotori di classe II

intorno a -25. È il sito di legame della proteina TBP (Tata binding protein) che

porta la RNA polimerasi sul promotore, stabilisce il punto di inizio della

trascrizione. Se non c’è la TATA box ci sono altre sequenze.

Altri elementi sono l’initiator che sta a monte della trascrizione, il DPE che sta a

 valle della trascrizione.

La TATA BOX è sufficiente per funzionare da core promoter. Quando ho sia TATA che

INR la trascrizione è

aumentata.

Avendo due siti di legame

per proteine trascrizionali

è più probabile che la RNA

polimerasi stia legata per

un tempo sufficiente a

formare il complesso

aperto.

Per capire chi domina giro

la TATA box e giro INR.

Scopro che la TATA box è

l’elemento più forte che

determina la direzione e il punto di inizio.

APPARATO TRASCRIZIONALE IN VITRO

RNA polimerasi II

 TFIIA: la trascrizione avviene anche senza questo fattore. Quando è presente,

 conferisce ulteriore stabilità al complesso e può essere importante in siti

promotori che non hanno sequenze consenso e si legano quindi debolmente

alla TBP.

TFIID: TBP + TAFs (altre undici proteine associate a TBP, dimostro questa cosa

 con la FRET o con ritardo elettroforetico o con immunoprecipitazione). Sul

nostro promotore, in vivo, si lega tutto il complesso TFIID. I TAFs vengono

definiti coattivatori: proteine che aiutano un fattore trascrizionale a svolgere il

suo ruolo di attivatore. Non sono fattori trascrizionali perché non si legano al

DNA ma al fattore trascrizionale stesso. TFIID serve ad iniziare la trascrizione

su quei promotori che non hanno la TATA box.

TFIIB: ama comunicare con TBP e DNA. Lega il DNA sono dopo l’avvenuto

 legame di TBP. Unisce TFIID al complesso d’inizio.

TFIIE: necessario per il legame di TFIIH.

 TFIIF: legato alla RNA polimerasi.

 TFIIH: complesso di nove proteine di cui una ha attività elicasica.

 Complesso di coattivatori noto come mediatore: il mediatore funge da tramite

 tra i fattori di trascrizione specifici legati ai promotori e agli enhancer a monte

e il complesso della polimerasi e i fattori trascrizionali generali legati al core

promoter.

È stato scoperto il meccanismo isolando i diversi componenti e aggiungendone uno

per volta. Si descrive così un modello a step della trascrizione; probabilmente quello

che succede in vivo è che c’è un intero oloenzima che viaggia per la cellula a cercare il

promotore.

1. Il core promoter deve essere riconosciuto in maniera specifica dalla TBP che si

lega esattamente sulla TATA box (dimostrato tramite footprinting). Ho

riconosciuto il promotore. In questo legame TBP è aiutata dai TAF. Dopo il

legame di TFIID al promotore possono associarsi anche gli altri fattori

trascrizionali.

2. TBP non basta per iniziare la trascrizione. Interviene nel complesso TFIIB, in

contatto sia con TBP che con il DNA.

3. La RNA polimerasi ancora non si lega, aggiungo RNA polimerasi assemblata a

TFIIF. Per ultimi si associano TFIIE e TFIIH. Si forma così il complesso di inizio

chiuso.

4. Per passare a complesso aperto e denaturare il DNA, solo nei geni di classe II

devo sfruttare idrolisi di ATP. Nel passaggio a complesso aperto interviene TFIIH

che con la propria attività elicasica denatura il DNA, per legarsi però ha bisogno

di TFIIE.

5. Si passa così a complesso aperto, l’RNA polimerasi inizia a trascrivere e

polimerizzare i primi legami fosfodiesterici. Spesso i primi trascritti sono

abortivi. Abbiamo bisogno per proseguire del distacco dell’enzima dal

promotore: TFIIH ha una subunità con attività chinasica, proteina che fosforila.

TFIIH fosforila la coda dell’RNA polimerasi II in modo tale che perda affinità per

le altre proteine trascrizionali, si dissocia, perde affinità per il promotore e

prosegue con la fase di allungamento controllata da fattori di allungamento.

ALLUNGAMENTO

Dopo che la coda dell’RNA polimerasi viene fosforilata, l’enzima si distacca dal sito

promotore e può scorrere lungo il DNA substrato. A questo punto intervengono nella

regolazione i fattori di allungamento che:

Sopprimono le pause della trascrizione date da un rallentamento dell’attività

 dell’RNA polimerasi

Stimolano l’attività autocorrettiva di idrolisi delle basi in appaiamento errato

 Richiamano complessi proteici che provvedono alla maturazione post-

 trascrizionale dell’mRNA

Modificano la struttura della cromatina

TERMINAZIONE DELLA TRASCRIZIONE

Le tre RNA polimerasi impiegano diverse strategie per terminare la trascrizione.

La Pol III pone fine alla trascrizione in corrispondenza di sequenze ricche di T con il

semplice ausilio di qualche fattore proteico. La Pol I conclude quando raggiunge un sito

terminatore individuato da specifici fattori proteici.

Il caso della Pol II è il più complesso e richiede un set di proteine e specifiche sequenze

nell’RNA. L’estremità 3’ presenta una sequenza ricca di A, detta segnale di

poliadenilazione. La terminazione da parte della Pol II è accoppiata al processo di

maturazione dell’estremità 3’ dei trascritti precursori di mRNA.

Il complesso di allungamento riconosce il sito di poliadenilazione e cambia

conformazione. L’m-RNA viene tagliato all’altezza della coda di poli(A). Una

esonucleasi si associa all’RNA trascritto rimanente e lo degrada. L’RNA polimerasi si

dissocia dal DNA e la trascrizione si conclude.

PROMOTORI DI CLASSE I

Si tratta dei promotori dei geni che codificano per rRNA. La trascrizione di questi geni

avviene nel nucleolo e comincia quando la Pol I e i fattori di trascrizione confluiscono

sul sito promotore. Il promotore presenta:

1. Core promoter: sequenza centrale essenziale per l’accurato inizio di

trascrizione.

2. Elemento di controllo a monte (UCE)

Come avviene l’inizio di trascrizione:

1. UBF (fattore di legame a monte) si lega all’UCE.

2. Interviene poi il fattore umano di selettività SL1

che si compone di TBP e TAF.

3. A questo punto a SL1 si può legare la Pol I e la

trascrizione può avere inizio.

PROMOTORI DI CLASSE III

I promotori della Pol III si trovano all’interno dei geni di cui controllano l’espressione.

Sono regioni fortemente sensibili a mutazioni. Esistono tre tipi diversi di promotori di

classe III: L’inizio di trascrizione è mediato da

TFIIIC che si lega al promotore interno

e attira TFIIIB. A questo punto viene

reclutata la polimerasi.

Principi unificanti della trascrizione

eucariotica:

1. Un fattore di assemblaggio riconosce un sito di legame specifico nel promotore

(TFIID, TFIIIC, UBF); questa proteina recluta altri componenti del complesso di

preinizio.

2. TBP in tutti i promotori aiuta il reclutamento degli altri fattori e della RNA

polimerasi; ha un ruolo di organizzazione dei complessi che si collocano sul

promotore.

3. La specificità di TBP è regolata dai TAF.

PROCESSAMENTO DELL’RNA

Raramente il trascritto primario è il prodotto finale (ad eccezione degli RNA batterici):

deve pertanto subire un processamento da enzimi specializzati in modo tale da

diventare una molecola matura e biologicamente funzionale. al termine del

processamento, che avviene nel nucleo, il trascritto maturo viene trasportato nel

citoplasma per poi essere tradotto in proteina dai ribosomi. Negli eucarioti il

processamento di RNA di classe II ha spesso un ruolo regolativo, mentre per gli rRNA e

i tRNA le modificazioni migliorano le funzioni delle stesse molecole.

I processamenti che il trascritto primario subisce sono:

Capping: un cappuccio protettivo costituito da una guanosina modificata viene

 aggiunto all’estremità 5’.

L’estremità 3’ è invece modificata dal taglio e dall’aggiunta di una catena di

 residui adenilati che creano una cosa di poli(A).

Ciascun trascritto primario di m-RNA contiene regioni non codificanti dette

 introni che interrompono le regioni codificanti dette esoni. Gli introni vengono

rimossi durante il processo di splicing e gli esoni vengono in questo modo uniti

tra loro mediante legami covalenti in modo da formare una sequenza continua

che codifica un polipeptide.

Processamento degli rRNA procariotici

Il trascritto primario di un rRNA batterico

contiene sequenze per tutti e tre gli rRNA

(16S, 23s e 5S) necessari per la formazione

di un ribosoma funzionale e per uno o due

tRNA. Il processamento coinvolge

ribonucleasi che tagliano il trascritto

primario in frammenti e esonucleasi che

rimuovono le estremità non codificanti dei

frammenti formati.

Processamento degli rRNA eucariotici Il trascritto primario viene

processato in modo da formare

rRNA 18S, 28S e 5.8S. Il

trascritto primario si compone

di grandi cluster di operoni

ripetuti in tandem e contiene

centinaia di copie di ciascun

non

gene separati da

transcribed spacer (NTS).

Processamento dei tRNA

Gli RNA transfer, le molecole che trasportano gli amminoacidi durante la sintesi

proteica, sono coordinatamente espressi in risposta alle esigenze metaboliche. In

alcuni casi più t-RNA sono sintetizzati come un singolo trascritto primario e sono

separati tramite taglio enzimatico. Anche gli RNA sintetizzati da soli derivano da un

trascritto primario più lungo che subisce delle modificazioni:

L’estremità 5’ viene modificata dall’endonucleasi RNasi P che rimuove alcuni

 nucleotidi.

L’estremità 3’ viene invece modificata da più enzimi, tra cui l’RNasi D, che

 rimuovono nucleotidi anche in questo caso.

Negli eucarioti alcuni trascritti tRNA contengono introni che devono essere

 rimossi: questi vengono sottoposti a splicing attraverso un meccanismo ATP-

dipendente.

Un’endonucleasi

riconosce e taglia i

legami fosfodiesterici nel

sito di splicing

dell’introne da

rimuovere. L’RNA ligasi

unisce i due esoni per

completare la reazione.

Spesso i precursori degli

 RNA transfer subiscono

un ulteriore

processamento post

trascrizionale.

All’estremità 3’ viene

aggiunto il trinucleotide

CCA dall’enzima tRNA nucleotidiltransferasi. La creazione della sequenza di

nucleotidi è indipendente dallo stampo.

L’ultimo tipo di processamento è la modificazione chimica si alcune basi

 attraverso metilazione, deamminazione o riduzione. Queste modificazioni, che

possono comprendere anche la rimozione e la sostituzione di una base, sono

importanti per la stabilità strutturale del tRNA o per il riconoscimento da parte

di altri enzimi.

Processamento mRNA batterico

Nei batteri, gli mRNA sono

spesso tradotti in proteine

contemporaneamente alla loro

trascrizione e normalmente

senza alcun tipo di modificazione

post trascrizionale. Poiché i

batteri sono privi di nucleo, la

trascrizione e la traduzione

avvengono nello stesso

compartimento e sono processi

accoppiati.

Processamento mRNA eucariotico

Negli eucarioti la trascrizione avviene nel nucleo e gli mRNA devono essere poi nel

citoplasma affinché avvenga la traduzione. Gli mRNA devono pertanto essere protetti

da una prematura degradazione attraverso alcune modificazioni:

1. Capping all’estremità 5’: gli acidi nucleici sintetizzati dalla RNA Pol II sono

sensibili alla degradazione delle estremità. All’estremità 5’ viene aggiunto un

cappuccio, un residuo di 7-metilguanosina, tramite un insolito legame 5’,5’-

trifosfato. Il cappuccio è formato dalla condensazione di una molecola di GTP

con il trifosfato al 5’ del trascritto. La guanina viene successivamente metilata

in posizione N7 e ulteriori gruppi metilici sono aggiunti al 2’OH del primo e del

secondo nucleotide adiacente. I gruppi metilici derivano da S-

adenosilmetionina. L’aggiunta del cap avviene ad opera della guaniltransferasi,

un enzima associato al CTD dell’RNA Pol II e che assicura che a ciascun

trascritto venga aggiunto il cap.

Nel 1970, gli esperimenti condotti da Shatkin hanno mostrato che il cappuccio

al 5’ ha un ruolo cruciale anche per il legame dell’mRNA al ribosoma.

Utilizzando m-RNA isolati da reovirus, un virus umano che causa infezioni allo

stomaco, egli scoprì che solo gli mRNA dotati di cap al 5’ sono in grado di

associarsi ai ribosomi. Shatkin usò la RNA Pol del reovirus per sintetizzare m-

32 3

RNA marcati con [ P] GTP e [ H] metil-S-adenosilmetionina. Alcuni trascritti

ottenuti contenevano un cappuccio di 7-metilguanosina (ed erano quindi

32 3

marcati sia con P che con H) mentre i restanti ne erano privi (e quindi erano

32

marcati solo con P). Gli mRNA vennero poi incubati con i ribosomi. Per

separare i complessi dagli mRNA liberi vennero poi posti i campioni su un

gradiente di saccarosio e centrifugati. Ciascuna frazione venne poi analizzata

32 3

per il suo contenuto di P e H. Il risultato fu che gli mRNA dotati di cappuccio

32

(contenenti sia P

3

che H) si trovavano

nella parte di

gradiente più densa,

dove erano presenti i

ribosomi. Al

contrario, quelli

senza cappuccio e

32

marcati solo con P

migravano

esclusivamente nella

parte alta del

gradiente. Il

cappuccio al 5’ interagisce con il complesso di legame del cappuccio (CBC), un

complesso proteico che recluta gli mRNA dotati di cappuccio sui ribosomi per

iniziare la traduzione.

2. Aggiunta della coda di poli(A)

all’estremità 3’: analogamente a quello

che succede al 5’, anche l’estremità 3’

deve essere protetta dalla degradazione.

L’mRNA contiene un segnale di

poliadenilazione nella sequenza trascritta

dalla RNA Pol II. Un enzima associato al

CTD della polimerasi taglia il trascritto

dopo il segnale di poliadenilazione e

l’mRNA viene poliadenilato da fattori

associati al CTD. La coda di poli(A) al 3’

serve come sito di legame per specifiche

proteine che contribuiscono a proteggere

il trascritto da una degradazione

prematura. La coda è aggiunta dalla

poliadenilato polimerasi (PAP) e a questa

si lega la proteina di legame della cosa di

poli(A) (PABP).

3. Splicing: la sequenza codificante di un gene è una serie di codoni a tre

nucleotidi che specificano la sequenza lineare degli amminoacidi presenti nel

prodotto polipeptidico. In genere nei fagi e batteri questa sequenza è continua;

negli eucarioti invece la sequenza codificante (esoni) è interrotta da sequenze

non codificanti dette introni.

Alcuni esperimenti di radiomarcatura hanno dimostrato come la maggior parte

dell’mRNA dei

trascritti

primari venga

degradato

prima che il

trascritto esca

dal nucleo. Una

prima evidenza

la si ebbe

tramite

l’ibridizzazione

del DNA

cromosomico

con il

corrispondente

mRNA: venivano mostrate regioni complementari appaiate interrotte da regioni

di solo DNA che sporgevano all’esterno formando delle anse e che quindi non

erano appaiate all’mRNA. Venne così dimostrato che delle regioni all’interno

dell’mRNA erano state rimosse.

Tramite l’utilizzo della northern e l’R-looping venne dimostrato che gli introni

vengono trascritti e che la loro rimozione non è casuale ma avviene seguendo

una specifica sequenza. Viene eseguita una northern di RNA nucleare con una

sonda specifica che identifica distinti precursori dell’mRNA maturo e si segue

poi l’ordine con cui gli introni sono stati rimossi dal trascritto primario.

L’introne, all’estremità 5’ ha una sequenza detta sito di splicing 5’ o sito

donatore; all’estremità 3’ ha il sito di splicing 3’ o sito accettore; infine possiede

un residuo interno di A detta punto di ramificazione.

La reazione di splicing consiste di due successive reazioni di

transesterificazione: nel primo passaggio il 2’-OH del punto di ramificazione

attacca il fosfato al sito di splicing 5’. Successivamente il 3’-OH dell’esone

rilasciato attacca il fosfato al sito di splicing 3’, congiungendo così i due esoni e

separandoli dall’introne che verrà in seguito degradato. La tranesterificazione di

per sé non richiede energia e non ne fornisce; il processo di splicing richiede

consumo di ATP per l’assemblaggio e il funzionamento dell’apparato di splicing.

Queste reazioni sono

catalizzate da

ribonucleoproteine (RNP)

costituite da proteine e

RNA non codificante che

si appaiano con l’mRNA ai

siti di splicing 5’ e 3’ e al

sito di ramificazione

posizionando in questo

modo anche le proteine

associate al complesso.

La maggior parte degli

introni viene rimossa

dallo spliceosoma, un

complesso di cinque

piccole

ribonucleoproteine

nucleari (snRNP) e

centinaia di ulteriori

proteine chiamate SR.

Al centro di ogni snRNP

c’è un piccolo RNA

nucleare (snRNA, indicati

con la lettera U). Questi

RNA riconoscono il sito di

splicing al 5’ e il punto di

ramificazione, li

avvicinano e aiutano o

catalizzano il raglio e la

giunzione.

Come avviene l’assemblaggio dello spliceosoma:

1. U1 si lega al sito di splicing 5’ riconoscendo la sequenza GU e U2AF al sito di

splicing 3’

2. U2 si lega al punto di ramificazione e viene legato da U4 e U6

3. U5 lega l’esone a valle

4. U1 e U2 si avvicinano formando un loop

5. U6 spiazza U1 e U4 che si staccano dal complesso.

6. A questo punto U6 e

U2 catalizzano il

legame tra il punto di

ramificazione e il sito

di splicing 5’

7. Il complesso U2-U5-

U6 catalizza il legame

tra l’estremità libera

dell’esone a monte e

l’estremità 5’

dell’esone a valle,

portano all’escissione

dell’introne

Le proteine SR, associate al complesso di splicing, si legano agli enhancer esonici di

splicing e interagiscono con le componenti del complesso di splicing in modo da

reclutarle in prossimità dei siti di splicing. Queste proteine sono coinvolte anche nella

regolazione dello splicing alternativo.

Splicing alternativo

Un tipico gene umano consiste di 8-10 esoni che possono essere uniti in disposizioni

diverse secondo un processamento detto splicing alternativo. Almeno il 60-70% dei

geni umani è sottoposto a splicing alternativo e questo rappresenta un mezzo versatile

per regolare l’espressione genica. Lo splicing alternativo è un processo nel quale gli

esoni, nel trascritto primario derivante da un singolo gene, sono uniti insieme in

combinazioni diverse in modo tale da produrre mRNA maturi diversi che codificano

quindi per diversi polipeptidi. Certi esoni vengono selezionati per essere inclusi mentre

altri no, ma l’ordine degli esoni non cambia rispetto al trascritto primario.

I meccanismi di splicing alternativo sono determinati dalle sequenze di splicing

all’interno dell’introne e dalle sequenze limite tra introne ed esone che svolgono un

ruolo importante nel determinare se un esone verrà incluso o escluso nel trascritto

maturo. Esistono quindi elementi regolatori cis-agenti a cui si legano proteine trans-

agenti che regolano lo splicing. Gli elementi regolatori cis-agenti sono gli enhancer di

splicing degli esoni (ESE) e i silencer di splicing degli esoni (ESS). Le mutazioni

localizzate nelle regioni introniche come i siti di splicing al 5’ e 3’ sono causa frequente

di malattie genetiche.

Modificazione o editing dell’RNA

Come lo splicing, l’editing dell’RNA può aumentare la capacità di sintesi del genoma

attraverso la creazione di un mRNA non direttamente codificato dal DNA. esistono due

tipi di editing:

Inserzione o delezione di un nucleotide: è un meccanismo che utilizza un RNA

 guida come stampo.

Modificazione di una base che viene sostituita da una differente.

Le reazioni di editing sono catalizzate dall’editosoma, un complesso di almeno 16

proteine. Nei mammiferi esiste solo l’editing di una base da C a U o da A a I (inosina).

Gli effetti dell’editing comportano la sostituzione di un amminoacido nel prodotto

proteico o la creazione/eliminazione di codoni di inizio e di stop.

Molti pre-mRNA sono modificati dall’adenosina deamminasi che agisce sull’RNA

(ADAR), un enzima che catalizza la conversione dell’adenosina in inosina mediante la

rimozione di un gruppo amminico. Questo tipo di editing è molto frequente nei tessuti

cerebrali, soprattutto in trascritti di recettori e canali ionici (come per esempio il

canale del glutammato).

Al termine del processamento si forma quindi un trascritto maturo, pronto per essere

esportato nel citoplasma. I trascritti maturi sono poi tradotti in proteine dai ribosomi. Il

trasporto nel citoplasma è un processo attivo e solo determinati RNA legati al giusto

corredo proteico sono selezionati per il trasporto. Il corredo proteico è necessario per

differenziare i trascritti da esportare da quelli che devono invece rimanere nel nucleo o

devono essere degradati. Per esempio le proteine che si legano ai confini esone-esone

indicano che il trascritto ha subito un corretto splicing, mentre le proteine che si

legano agli introni indicano che il trascritto deve essere trattenuto nel nucleo.

TRADUZIONE: LA SINTESI PROTEICA

La sintesi proteica è il processo mediante il quale l’informazione contenuta nella

sequenza nucleotidica del trascritto maturo viene usata per generare la sequenza

amminoacidica di cui si compongono le proteine. Il codice genetico è la corrispondenza

tra ogni codone (tripletta di nucleotidi) e l’amminoacido da esso codificato ed è

universale in tutti gli organismi.

Ciascuno degli acidi nucleici conta quattro nucleotidi, mentre le proteine possono

contenere fino a 20 amminoacidi differenti. I nucleotidi devono quindi combinarsi in

modo differente per creare un codice. È necessario che i codoni si compongano di tre

nucleotidi, in modo tale da produrre 64 combinazioni sufficienti a codificare per 20

amminoacidi. Per spiegare come una sequenza di RNA codifica una sequenza di

amminoacidi, Crick nel 1955 ipotizzò l’esistenza di una molecola adattatrice capace di

riconoscere uno specifico codone e di trasportare l’amminoacido corrispondente. Non

molto tempo dopo, Zamecnick e Hoagland scoprirono che gli amminoacidi si univano

con legami covalenti ad una piccola molecola di RNA, che venne chiamata RNA

transfer (tRNA) e che rappresentava il 15% dell’RNA totale.

Componenti della traduzione

mRNA: costituita dai codoni che codificano per gli amminoacidi di cui si

 compone la proteina codificata dal gene trascritto.

tRNA: molecola che riconosce il codone e trasporta l’amminoacido

 corrispondente.

Amminoacil-tRNA sintetasi: enzima che attacca l’amminoacido al tRNA

 Amminoacidi

 Fonte energetica: ATP e GTP

 Fattori di inizio, allungamento e

 rilascio

Struttura dei t-RNA

Il t-RNA è una molecola di RNA relativamente

piccola e a singolo filamento. Si creano poi

degli appaiamenti intramolecolari tra le basi

del singolo filamento, la molecola si ripiega e

forma una determinata struttura

tridimensionale: all’estremità 3’ troviamo la

tripletta CCA, ad A si lega l’amminoacido.

Nella struttura bidimensionale, il tRNA

assume una conformazione a trifoglio in cui

sono distinguibili quattro bracci. Al braccio

opposto a quello a cui si lega l’amminoacido

(3’, CCA) vi è il braccio dell’anticodone, così

chiamato perché contiene l’anticodone, la

sequenza di tre nucleotidi che si appaia al

codone complementare nell’mRNA.

Sui due bracci laterali sono presenti nucleotidi modificati, determinanti nel legame tra

la molecola ribonucleica e l’amminoacido.

Il codice genetico è degenerato: ci sono infatti 64 possibili modi in cui i nucleotidi

possono combinarsi in sequenze ma ci sono solo 20 amminoacidi. Più codoni

codificano quindi per lo stesso amminoacido. La degenerazione del codice genetico ha

vantaggi in quanto permetter di assorbire mutazioni di singole basi riducendo il più

possibile gli effetti sul prodotto proteico.

Codoni da ricordare:

AUG metionina: codone di inizio.

 

UAA, UAG, UGA: codoni di stop.

Un tRNA può riconoscere quindi più codoni grazie a un legame più debole in terza

posizione. La terza base del codone infatti viene definita base oscillante in quanto

l’appaiamento tra codone e anticodone è più debole e non necessariamente canonico.

In alcuni casi l’anticodone contiene inosina che consente di formare legami idrogeno

con adenosina, citosina e uracile. Le prime due basi del codone si appaiano in modo

canonico secondo gli appaiamenti stabiliti da Watson e Crick, mentre la terza base non

segue un comportamento così rigido e si lega con una certa flessibilità.

L’inizio e la fine della traduzione dipendono dagli specifici codoni di inizio e di stop

che stabiliscono il frame di lettura con cui opererà il ribosoma durante la sintesi

proteica. Il codice genetico tampona la mutazione per sostituzione di singole basi:

quando la sostituzione di una base in un codone causa la sostituzione di un

amminoacido con un altro si parla di mutazione missenso. In molti casi però, data la

degenerazione del codice genetico, quello che si verifica è una mutazione silente:

nonostante la mutazione sul codone, si ottiene una tripletta che codifica per lo stesso

amminoacido e non si ha quindi una modificazione del prodotto proteico.

Il codice genetico viene letto senza sovrapposizione di codoni, senza intervalli e a

triplette.

Decifrazione del codice genetico

Utilizzando l’enzima polinucleotide fosforilasi era possibile sintetizzare stampi di RNA

che poi, in E. Coli, si verificarono capaci di codificare dei polimeri proteici. Questo tipo

di enzima non richiede uno stampo e utilizza ribonucleotidi difosfati per fabbricare

polimeri di RNA a sequenza casuale. In vitro l’enzima viene indotto a sintetizzare RNA

aggiungendo ribonucleotidi difosfati in eccesso. Utilizzando un unico nucleotide come

stampo, per esempio UDP, la polinucleotide fosforilasi sintetizza RNA poli(U). Per

determinare che tipo di prodotto proteico potesse essere diretto da un RNA poli(U),

aggiunsero l’acido nucleico a 20 miscele contenente tutti e 20 gli amminoacidi, l’unica

differenza consisteva in un amminoacido radioattivo. Alla fine dell’incubazione, le

miscele di reazione vennero trattare con un acido in modo tale da causare la

precipitazione delle proteine e separarle in questo modo dagli amminoacidi rimasti

liberi. I precipitati vennero raccolti e venne analizzata la loro radioattività. I risultati

mostrarono che poli(U) dirigeva la sintesi della polifenalanina e quindi il codone di

questo amminoacido doveva essere UUU.

La scoperta degli altri omopolimeri (codoni costituiti da tre basi uguali) procedette allo

stesso modo.

Per completare la decifrazione del codice genetico vennero poi creati artificialmente

codoni di mRNA. Questi venivano miscelati a ribosomi e a tRNA legati ad amminoacidi

marcati. Se il codone è corrispondente all’amminoacido, codone e anticodone si

appaiano e si legano ai ribosomi. In questo modo il complesso è separabile dagli

amminoacidi liberi tramite la filtrazione con nitrocellulosa.

Struttura dei ribosomi

I ribosomi batterici contengono circa il 60% di RNA ribosomiale e il 40% di proteine,

organizzati in due subunità non uguali denominate in funzione dei loro coefficienti di

sedimentazione (50S e 30S, il ribosoma assemblato ha coefficiente di sedimentazione

70S). La subunità maggiore contiene il centro peptidil-transferasico che catalizza la

formazione del legame peptidico tra due amminoacidi adiacenti. Contiene un rRNA 5S

e uno 23S. Le proteine contenute in questa subunità sono denominate da L1 a L36. La

subunità minore contiene invece il centro di decodificazione in cui i tRNA carichi

leggono il codice genetico appaiando il proprio anticodone al codone presente

sull’mRNA. Contiene solo un rRNA 16S. Le proteine contenute in questa subunità sono

denominate da S1 a S21. I ribosomi eucariotici si compongono anch’essi di sue

subunità: la maggiore di 60S (con rRNA 5S, 28S e 5.8S) e la minore di 40S (con rRNA

18S). il ribosoma assemblato ha come coefficiente di sedimentazione 80S. Gli rRNA

presenti nella subunità piccola hanno conservato la propria struttura nei tre regni degli

esseri viventi. Le due subunità (sia batteriche che eucariotiche) si uniscono a formare

un solco in cui passa l’mRNA durante la traduzione.

Poiché gli mRNA sono in genere molto lunghi (almeno 300 nucleotidi), durante la

traduzione possono essere presenti sul filamento più ribosomi a formare un polisoma o

poliribosoma. Siccome formano una particella dal peso molecolare molto alto, possono

essere velocemente visualizzati in estratti cellulari analizzandone la sedimentazione in

gradiente di saccarosio. La formazione dei polisomi permette a ciascuna molecola di

mRNA di funzionare da stampo per più copie della stessa proteina in una sola volta,

permettendo quindi un efficiente uso di ciascun trascritto.

Il ribosoma può legare contemporaneamente tre tRNA durante ogni ciclo di aggiunta di

amminoacidi al C-terminale di una catena polipeptidica crescente in quanto contiene

tre siti:

SITO A: zona di legame dell’amminoacil-tRNA, legato all’amminoacido

 SITO P: zona di legame del peptidil-tRNA, legato alla catena polipeptidica

 crescente

SITO E: zona di uscita occupata dal tRNA dopo che si è scaricato del proprio

 amminoacido

Tutti e tre i siti si estendono in entrambe le subunità del ribosoma e collegano il centro

di decodificazione della subunità piccola al centro peptidil-transferasico della subunità

grande. Il ribosoma, spostandosi di codone in codone, rende disponibile il sito A per il

legame del successivo tRNA che porta l’amminoacido corrispondente al codone che il

ribosoma legge nel centro di decodificazione. La formazione del legame peptidico, che

avviene nel sito P, è facilitata dalla vicinanza degli amminoacidi successivi e

dall’attivazione dell’amminoacil-tRNA. L’aggiunta dell’amminoacido alt-RNA richiede

idrolisi di ATP e quindi il costo energetico è già stato pagato.

Assemblaggio del ribosoma: Nomura e i suoi collaboratori alla fine degli anni Sessanta

dimostrarono che entrambe le subunità dei ribosomi possono essere frazionate nei

singoli componenti (rRNA e proteine) e poi ricostruite in vitro. Scoprirono che senza

RNA non si può assemblare il complesso ribosomale; nella piccola subunità le prime

proteine a legarsi all’RNA sono S4 e S8 e successivamente si legano tutte le altre.

I principali passaggi della traduzione:

L’associazione delle subunità ribosomiali all’inizio della sintesi proteica e il loro

distacco quando viene rilasciata la proteina completa sono fondamentali per il

processo di traduzione. Le subunità all’inizio sono separate e l’avvio della sintesi è

intrinsecamente

regolato

dall’assemblaggio dei ribosomi sull’mRNA insieme ai tRNA. La traduzione inizia con il

legame dell’mRNA e del tRNA iniziatore alla subunità piccola del ribosoma. Questa si

posiziona all’inizio della sequenza codificante e si lega la subunità grande, formando

così il ribosoma attivo. Inizia così la lettura della sequenza di codoni; man mano il t-

RNA corrispondente e l’amminoacido coovalentemente legato ad esso entra nei centri

di decodificazione (A) e peptidil-tranferasico (P) del ribosoma. Dopo la formazione del

legame peptidico tra il C-terminale del polipeptide nascente e l’amminoacido del tRNA

entrante, il ribosoma si sposta sul codone successivo. Quando incontra un codone di

stop, il ribosoma viene rilasciato e le subunità si distaccano, pronte ad iniziare la

traduzione di un nuovo trascritto.

Attivazione dell’amminoacido e caricamento del tRNA

L’attivazione dell’amminoacido è un passaggio fondamentale della traduzione. Il tRNA

è detto carico se ha legato il proprio amminoacido. Il caricamento è mediato da enzimi

2+

attivanti dipendenti da Mg noti come amminoacil-tRNA sintetasi. L’elevata energia di

questo legame è fondamentale per la formazione del legame peptidico. Inoltre il

caricamento deve essere molto preciso in quanto il ribosoma non è in grado di

riconoscere se nel sito A è entrato il tRNA corretto. Il caricamento di un t-RNA richiede

la formazione di un legame acilico tra il gruppo carbossilico di un amminoacido e

l’estremità ossidrilica 2’ o 3’ del t-RNA. Le amminoacil-tRNA sintetasi devono attivare

l’amminoacido prima di attaccarlo al tRNA. La reazione avviene in due passaggi nel

sito attivo dell’enzima.

1. Passaggio di adenilazione: il gruppo carbossilico dell’amminoacido reagisce con

il gruppo fosfato α dell’ATP per formare il 5’-amminoacil-AMP, con liberazione di

pirofosfato (PPi).

2. Passaggio di caricamento del t-RNA: il gruppo amminoacilico viene trasferito

dall’amminoacil-AMP al suo specifico tRNA. L’amminoacido può essere trasferito

o sul 2’-OH o sul 3’-OH dell’adenosina 3’ terminale del tRNA. Poiché la sua

idrolisi è favorita energeticamente, il legame tra l’amminoacido e il t-RNA

diventa trainante per la traduzione.

Esistono 20 amminocil-tRNA sintetasi; lo stesso enzima può però riconoscere e

caricare più di un tRNA in quanto più tRNA legano uno stesso amminoacido

(degenerazione del codice genetico). Le amminocil-tRNA sintetasi devono riconoscere

sia il tRNA che l’amminoacido. Il riconoscimento del tRNA avviene su due siti principali:

lo stelo accettore e l’ansa dell’anticodone. Gli enzimi utilizzano proprietà chimiche

come la carica, l’idrofobicità, la forma e la dimensione dei diversi amminoacidi per

riconoscerli. Le amminocil-tRNA sintetasi svolgono inoltre un’attività di correzione di

bozze nel caso in cui venga legato al tRNA un amminoacido sbagliata. L’enzima infatti

contiene un sito di correzione di bozze che si adatta perfettamente al tRNA caricato

dell’amminoacido corretto e riconosce quindi un eventuale legame sbagliato.

ESEMPIO: Valina e Isoleucina sono due amminoacidi che si differenziano per un gruppo

metilene. Dal momento che la valina è più piccola, l’isoleucina non può entrare nel sito

della Val-tRNA sintetasi in quanto ha delle dimensioni troppo grandi. Al contrario però

la valina può entrare nel sito dell’Ile-tRNA sintetasi e legarsi al tRNA. Il caricamento

scorretto viene però riconosciuto dal sito di correzione di bozze che riconosce l’errore e

idrolizza il legame.

INIZIO DELLA TRADUZIONE

È il passaggio più regolato della traduzione. L’inizio della traduzione comprende il

reclutamento della subunità piccola del ribosoma sull’mRNA, L’identificazione del

codone di inizio o codone start, l’associazione del tRNA iniziatore carico con l’mRNA e

il reclutamento della subunità grande del ribosoma per formare un ribosoma attivo. I

fattori d’inizio (detti IF nei batteri e eIF negli eucarioti) sono cruciali per aumentare la

fedeltà e la velocità di tutti i passaggi del processo. In tutti gli organismi la traduzione

inizia con il legame della subunità piccola del ribosoma a un m-RNA. Nei procarioti, il

5’-AUG iniziale è portato nella giusta posizione sul ribosoma dalla sequenza di Shine-

Dalgarno, chiamata anche sito di legame del ribosoma (RBS). Questa sequenza è un

segnale di 4-9 residui di purina, distanti 8-10 nucleotidi sul lato 5’ dal codone d’inizio.

La sequenza di Shine-Dalgarno si appaia con una sequenza complementare ricca di

pirimidine posta all’estremità 3’ dell’rRNA 16S della subunità piccola del ribosoma

(30S). Questa interazione mRNA-rRNA pone, nella subunità 30S, la sequenza 5’-AUG

iniziale dell’mRNA nella giusta posizione per l’inizio della traduzione (sito P).

Negli eucarioti, le modificazioni del cappuccio 5’ e della coda di poli(A) sugli mRNA

hanno tre scopi: proteggono le estremità dalla degradazione, facilitano il trasferimento

dell’mRNA dal nucleo al citosol e promuovono la traduzione grazie al legame di fattori

di inizio che collegano mRNA e ribosoma. L’estremità 5’ dell’mRNA su cui è posizionato

il 5’ cap lega eIF4E (proteina che lega il cappuccio) che a suo volte lega tre proteine

capaci di reclutare la subunità ribosomiale piccola sull’mRNA. Una volta associata

all’mRNA, la subunità piccola trova il codone di inizio 5’-AUG scandagliando l’RNA in

direzione 5’ 3’. Oltre al 5’ cap, sembra che la presenza di un nucleotide purinico tre

residui prima del codone di inizio e di un residuo G subito dopo il codone di inizio

aumenti la traduzione grazie al contatto con il tRNA iniziatore. Questa sequenza è

detta sequenza di Kozak. All’estremità 3’ dell’mRNA, la coda di poli(A) stimola

l’efficienza di traduzione favorendo il reinizio dopo il completamento di una catena

polipeptidica.

La sintesi proteica inizia all’estremità N-terminale e procede grazie all’aggiunta per

passaggi successivi di amminoacidi all’estremità C-terminale della catena

polipeptidica crescente. Il codone d’inizio 5’-AUG specifica un residuo di Met N-

terminale. Anche se la metionina ha solamente il codone AUG, tutti gli organismi

possiedono due tRNA per la metionina. Uno è usato esclusivamente quando AUG è il

codone di inizio della sintesi proteica, l’altro per codificare un residuo di metionina

interno al polipeptide. Un fattore di inizio lega specificatamente il tRNA iniziatore e lo

porta sul ribosoma permettendo in questo modo alle cellule di distinguere inizio e

allungamento.

Nei batteri, l’amminoacido incorporato in corrispondenza del 5’-AUG d’inizio è la N-

fMet

formilmetionina e arriva sul ribosoma come N-formilmetionil-tRNA che si forma in

Met

due reazioni successive. Dapprima la metionina viene attaccata al tRNA dalla Met-

tRNA sintetasi, poi un enzima transformilasi trasferisce un gruppo formilico sulla

metionina. In questo modo il tRNA carico in questa maniera non può inserirsi in

posizioni interne al polipeptide. Il gruppo formilico viene poi rimosso da una

deformilasi durante o dopo la sintesi proteica.

Negli eucarioti, i polipeptidi sintetizzati dai ribosomi iniziano con un normale residuo di

iMet

metionina; è il tRNA iniziatore (detto tRNA ) che ha una specifica sequenza nel

braccio dell’anticodone che viene riconosciuta da un fattore proteico di inizio. Sia negli

eucarioti che nei procarioti, spesso accade che le amminopeptidasi rimuovano l’intera

metionina N-terminale e a volte uno o due amminoacidi dalla catena polipeptidica di

nuova sintesi.

Fattori di inizio batterici

I ribosomi batterici hanno tre siti di legame per gli

amminoacil-tRNA: il sito A dell’amminoacile, il sito P del

peptidile e il sito E di uscita. L’inizio della sintesi del

polipeptide nei batteri richiede una serie di tre fattori

proteici d’inizio: IF1. IF2 e IF3. Ognuno di questi ha un

ruolo specifico nell’assemblaggio della subunità

ribosomiale piccola, con m-RNA e t-RNA correttamente

posizionati, e della subunità grande, in un processo

controllato dall’idrolisi di GTP. La formazione del

complesso d’inizio, composto da un ribosoma 70S attivo,

avviene in tre passaggi:

1. La subunità 30S lega due fattori d’inizio, IF1 e IF3.

IF3 impedisce il legame prematuro con la subunità

maggiore; IF1 si lega al sito A e, durante l’inizio,

blocca il legame del t-RNA. L’m-RNA lega poi la

subunità 30S grazie all’appaiamento delle basi della

sequenza di Shine-Dalgarno con l’r-RNA 16S. Il

codone d’inizio 5’-AUG è ora posto perfettamente nel sito P, unico sito in cui si

fMet

può legare fMet-tRNA .

2. Al complesso costituito dalla subunità 30S, dall’mRNA, da IF1 e IF3, si uniscono

fMet

IF2, legato al GTP e l’fMet-tRNA iniziatore. L’anticodone di questo tRNA può

appaiarsi con il codone di inizio dell’mRNA presente nel sito P.

3. Avviene un cambiamento conformazionale della subunità 30S induce il distacco

di IF3, permettendo l’associazione della subunità 50S. contemporaneamente il

GTP legato a IF2 viene idrolizzato e tutti e tre i fattori si disaccano dal ribosoma.

Questo produce un ribosoma 70S funzionale, detto complesso d’inizio, pronto

per la fase di allungamento.

Associazione dei ribosomi

Esperimento: si fa crescere coli in modo tale da marcare i suoi ribosomi. Lo trasferisco

in un mezzo leggero e assumo che non ci sia scambio tra subunità ho solo ribosomi

pesanti e ribosomi leggeri. Se ipotizzo uno scambio di subunità avrò anche la presenza

di ribosomi ibridi. IPOTESI CORRETTA. Si purificano quindi proteine associate ai

ribosomi che favoriscano lo scambio di subunità. Nel momento in cui purifico

inserendo IF3 vedo che i ribosomi si dissociano.

Fattori di inizio eucariotici

L’inizio della traduzione richiede almeno 12 fattori di inizio.

1. Prima che inizi la traduzione, le subunità sono tenute separate dai fattori d’inizio

eIF3 e eIF1A che impediscono l’associazione prematura delle subunità e

bloccano il legame del tRNA iniziatore al sito A del ribosoma. Un terzo fattore di

inizio, eIF1, si lega al sito E.

2. Il fattore che lega il GTP, eIF2, con le sue tre subunità eIF2α, eIF2β e eIF2γ, si

iMet

lega al GTP e al tRNA iniziatore carico, il Met-tRNA riconosciuto grazie a una

coppia di basi A=U nel braccio dell’anticodone, formando un complesso

ternario. In questa fase, alla subunità piccola del ribosoma, si associano eIF5 e

eIF5B, coinvolte nei passaggi di assemblaggio del ribosoma.

3. I tre fattori d’inizio eIF3, eIF1A e eIF1, mediano l’interazione tra il complesso

ternario e la subunità 40S formando il complesso di preinizio 43S.

4. Il legame del complesso di preinizio a un mRNA è mediato da un complesso

denominato eIF4F: questo contiene eIF4E che lega il cappuccio al 5’, eIF4A che è

un’ATPasi e una RNA elicasi, eIF4G che lega sia eIF4E che eIF3, fornendo un

collegamento tra il complesso 43S e l’mRNA. Inoltre eIF4G si lega alla proteina

che lega la coda di poli(A) (PABP), associata alla coda poli(A) al 3’ dell’mRNA.

Questo legame unisce le estremità 5’-3’ dell’mRNA che in questo modo si

circolarizza (per questo si rende necessaria l’attività elicasica di eIF4A).

5. Il complesso così formato (48S) scansiona l’mRNA alla ricerca del codone di

inizio. L’appaiamento delle basi tra il codone di inizio e l’anticodone del tRNA

iniziatore consente poi l’associazione della subunità 60S in modo da costituire la

forma attiva del ribosoma 80S. Poiché eIF1, eIF1A, eIF2 e eIF3 coprono alcune

parti della superficie della subunità 40S devono essere allontanati prima che la

subunità maggiore si associ. Questo processo avviene ad opera di eIF5,

attivatore della GTPasi, che stimola l’idrolisi del GTP legato a eIF2. Infine e-IF5B,

una GTPasi, idrolizza il GTP e induce il rilascio di diversi fattori di inizio. A questo

punto il complesso d’inizio è completo.

ALLUNGAMENTO

Nel secondo stadio della sintesi proteica, l’allungamento, il polipeptide nascente viene

allungato mediante l’attacco covalente di unità amminoacidiche successive, ciascuna

portata al ribosoma e posizionata correttamente dal suo tRNA che si appaia con il

corrispondente codone sull’mRNA. L’allungamento necessita proteine citosoliche note

come fattori di allungamento. Il legame di ogni amminoacil-tRNA in ingresso e il

movimento del ribosoma lungo l’mRNA sono facilitati dall’idrolisi del GTP ogni volta

che viene aggiunto un residuo al polipeptide crescente. I passaggi sono in genere gli

stessi in procarioti ed eucarioti, cambiano solamente i nomi di alcuni fattori di

allungamento.

Nei batteri l’allungamento richiede il complesso d’inizio, gli amminoacil-tRNA, i fattori

di allungamento EF-Tu, EF-Ts e EF-G e il GTP.

Le cellule utilizzano tre passaggi per aggiungere ciascun residuo amminoacidico:

1. Il corretto amminoacil-tRNA in ingresso lega il ribosoma con l’aiuto di EF-Tu.

L’amminoacil-tRNA si lega prima ad un complesso fatto da EF-Tu legato al GTP e

poi al sito A del ribosoma 70S. Il GTP viene idrolizzato e il complesso EF-Tu-GDP

viene rilasciato dal ribosoma poiché perde affinità per l’amminoacil-tRNA. Il

complesso EF-Tu-GTP viene rigenerato da un complesso che coinvolge EF-Ts e

GTP. L’estremità dell’amminoacil-tRNA è però ancora lontana dal sito attivo di

formazione del legame peptidico. Le interazioni codone-anticodone nel

ribosoma ruotano il tRNA in una posizione opportuna per reagire con la catena

polipeptidica crescente in un processo detto di accomodamento. Gli

amminoacil-tRNA scorretti si staccano dal sito A in questa fase. La correzione da

parte del ribosoma, come abbiamo già detto, riguarda solo l’appaiamento

codone-anticodone, l’identità dell’amminoacido attaccato al tRNA non viene

controllata.

2. A questo punto viene formato un legame peptidico tra i due amminoacidi legati

dai loro tRNA ai siti P e A del ribosoma. La formazione del primo legame

peptidico avviene grazie all’enzima peptidil-transferasi che fa parte dell'rRNA

23S della subunità maggiore del ribosoma.

3. Dopo la formazione del legame peptidico, il ribosoma si sposta di un codone

verso l’estremità 3’ dell’mRNA in un processo chiamato traslocazione. Questo

movimento sposta l’anticodone del dipeptil-tRNA dal sito A al sito P e sposta il

tRNA scarico dal sito P al sito E, dove viene liberato nel citosol. Il terzo codone si

trova ora in corrispondenza del sito A, pronto per legare l’anticodone

corrispondente. Il movimento del ribosoma lungo l’mRNA richiede energia

fornita dall’idrolisi di GTP da parte della GTPasi EF-G. Questo fattore si lega sulla

subunità maggiore a lato del sito A, spostando il peptidil-tRNA. Dopo l’idrolisi del

GTP, la struttura di EF-G-GDP cambia in modo da prendere contatti con la

subunità piccola e indurre la traslocazione del tRNA dal sito A al sito P.

Negli eucarioti, il ciclo di allungamento è simile a quello batterico. I fattori di

allungamento coinvolti sono eEF1α, eEF1β e eEF2, analoghi a EF-Tu, EF-Ts e EF-G.

Il tutto deve essere controllato a livello della qualità. Ci sono momenti di rallentamento

in cui si esegue il controllo. Coli, quando è presente un errore, accelera la sintesi

introducendo nuovi errori per arrivare velocemente al codone di stop e degradare la

catena errata. L’appaiamento codone-anticodone deve essere corretto: avviene il

controllo di qualità. Se l’appaiamento è scorretto, il sistema non è perfettamente

inserito nella tasca, l’idrolisi si rallenta e statisticamente ho una elevata probabilità

che il tutto si dissoci prima dell’idrolisi.

TERMINAZIONE

Il completamento del polipeptide è segnalato da uno dei tre codoni dell’mRNA (UAA,

UAG, UGA) che agiscono come codoni di terminazione o codoni di stop. Non appena il

prodotto della traduzione viene rilasciato, i ribosomi e i fattori associati diventano

disponibili per un altro ciclo di traduzione.

L’allungamento continua fin quando il ribosoma aggiunge

l’ultimo amminoacido codificato dall’mRNA. La terminazione è

segnalata dalla presenza di un codone di stop. Le mutazioni in

un anticodone di un tRNA che consentono di inserire un

amminoacido in corrispondenza di un codone di terminazione

sono generalmente dannose per la cellula.

Nei batteri, una volta che un codone di terminazione ha

occupato il sito A di un ribosoma, tre fattori di rilascio RF-1,

RF-2 e RF-3 contribuiscono a svincolare l’ultimo legame

peptidil-tRNA, rilasciare dal sito P il polipeptide libero e

l’ultimo tRNA ora scarico e separare il ribosoma nelle due

subunità, pronte a riniziare un nuovo ciclo. RF-1 e RF-2 sono

simili tra loro e sono denominati fattori di rilascio di classe I;

RF-3 agisce in modo diverso ed è detto fattore di rilascio di

classe II. RF-1 e RF-2 riconoscono i codoni di terminazione

(UAG e UAA, UGA e UAA) e legano il ribosoma allo stesso

modo di un tRNA. Questi si legano sul codone di stop e

inducono la peptidil-transferasi a trasferire il polipeptide

crescente su una molecola d’acqua invece che su un

amminoacido. RF-3, una GTPasi, catalizza il distacco di RF-1 e

RF-2 dal ribosoma in seguito al rilascio della proteina. RF-3 è

più affine al GDP che al GTP, si lega al ribosoma in forma RF-3-

GDP che è però poco affine al

ribosoma; una volta rilasciato il

polipeptide ad opera di RF-1 o RF-2 avviene un cambio di

conformazione del ribosoma che induce lo scambio di

GDP e GTP. RF-3-GTP è molto affine al ribosoma e induce

lo stacco di RF1 e RF2 interagendo con la subunità

maggiore. Questa interazione stimola l’idrolisi di GTP e

anche RF-3-GDP si dissocia.

Dopo il rilascio del polipeptide e dei fattori di

terminazione, il ribosoma rimane legato all’m-RNA e

contiene il t-RNA scarico. Il processo di riciclo del

ribosoma rimuove m-RNA, t-RNA e separa le due

subunità. Il fattore di riciclo del ribosoma RRF si lega al

sito A del ribosoma e recluta EF-G per stimolare il rilascio

dei t-RNA scarichi presenti nel sito P e nel sito E in un

processo che simula l’allungamento. RRF si adatta ai siti

di legame per t-RNA. L’idrolisi di GTP da parte di EF-G

porta alla traslocazione di RRF nel sito P e al distacco dei

t-RNA. A questo punto il ribosoma rilascia RRF e EF-G. IF-3

si lega alla subunità piccola e smonta il ribosoma

inducendo anche lo stacco dell’m-RNA.

Negli eucarioti un solo fattore di rilascio eRF-1 riconosce tutti e tre i codoni di

terminazione. Un secondo fattore eRF-3 catalizza il distacco GTP-dipendente di eRF-1

dal ribosoma. Negli eucarioti inoltre non è presente un fattore di riciclo dei ribosomi.

La maggior parte degli antibiotici agisce sul macchinario della sintesi proteica.

Gentamicine: permettono negli eucarioti di superare dei codoni di stop prematuri (la

sintesi proteica si arresta precocemente). Introducendo un tRNA su un codone di stop

prematuro riusciamo a superare una mutazione, processo favorito dalle gentamicine

(processo di read through). Si deve usare una concentrazione molto alta che diventa

tossica per i reni.

Occasionalmente, gli mRNA con codoni di stop prematuri

(tronchi) o privi del tutto di codoni di stop (mRNA non stop)

derivano da errori nella replicazione del DNA o nella

trascrizione. Questi mRNA difettivi possono portare alla

produzione di proteine non funzionali o addirittura tossiche.

Gli mRNA tronchi o non stop si formano quando la

trascrizione del DNA termina prematuramente o quando

causa di una mutazione un mRNA è privo di codone di stop.

Le proteine tronche prodotte dagli mRNA incompleti

possono costituire un disastro per la cellula; il ribosoma

risolve questo problema con un processo che riconosce e

rimuove l’mRNA difettoso. Quando un ribosoma raggiunge

l’estremità 3’ di un mRNA tronco si arresta, incapace di

reclutare il giusto tRNA o i fattori di rilascio. Nei batteri e

negli organelli eucariotici questo problema viene risolto

grazie a un RNA di 457 nucleotidi detto tmRNA. La sua

Ala

estremità 5’ imita quella del t-RNA carico di alanina tRNA

e viene caricato quindi con alanina dall’Ala-tRNA sintetasi. Il

tmRNA caricato di alanina si lega al sito A del ribosoma

insieme a EF-Tu-GTP e l’alanina si lega alla catena

polipeptidica crescente. Il tmRNA prende poi il posto

dell’mRNA nel solco tra le due subunità ribosomiali,

allontanando la molecola tronca e dirigendo esso stesso la

sintesi proteica di 10 amminoacidi prima di incontrare un

codone di stop. Questa sequenza di 10 amminoacidi

costituisce un segnale cellulare che porta alla degradazione della proteina finale ad

opera di una proteasi.

DECADIMENTO MEDIATO DELL’mRNA

Negli eucarioti, la risposta a

mRNA non stop avviene in un

altro modo. Poiché gli mRNA

eucariotici contengono una coda

di poli(A) 3’, un mRNA senza

codone di stop viene tradotto

lungo la coda, formando una

serie di residui di lisina sul C-

terminale (AAA codifica per la

Lys). Il ribosoma bloccato

all’estremità 3’ dell’mRNA non

stop lega la proteina Ski7

(connessa a eRF-3) che dà l’avvio

al decadimento dell’mRNA non

stop. Ski7 induce il distacco del

ribosoma e la degradazione

dell’mRNA non stop reclutando la

ribonucleasi esosomica che taglia

in direzione 3’5’. Il polipeptide difettoso viene degradato da una proteasi che

riconosce l’etichetta poli(Lys). Un processo noto come decadimento

dell’mRNA mediato dal nonsenso è il

processo invece che permette agli

eucarioti di degradare un mRNA che

contiene un codone di stop

prematuro. Questo processo agisce

nel nucleo attraverso l’apparato di

splicing, prima che il trascritto venga

esportato nel citosol. Nello splicing

del pre-mRNA il sito di ciascun introne

escisso è marcato dalla presenza di

un complesso di giunzione dell’esone

(EJC), posto sul lato 5’ del confine

esone-esone. Nel primo ciclo di

traduzione il ribosoma, muovendosi

lungo il trascritto, rimuove gli EJC. Se

s’imbatte in un codone di stop

prematuro, il ribosoma viene


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8 mesi fa


DESCRIZIONE APPUNTO

Tecniche nello studio di DNA/RNA, estrazione di acidi nucleici e proteine, tecniche immunorelate, elettroforesi e blotting, sequenziamento Sanger e New generation sequencing. Meccanismi molecolari di trascrizione, traduzione e replicazione. Fattori di trascrizione, geni, domini di binding e di attivazione. Epigenetica, metilazione del DNA e struttura della cromatina. Organismi modello nello studio della biologia, topi knock-out e transgenici e silenziamento genico.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie mediche
SSD:
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher francescaputti di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Landsberger Nicoletta.

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