Biologia molecolare

BIOLOGIA MOLECOLARE

Flusso dell’informazione genetica dal DNA alle proteine: DNA trascrizione mRNA

 

traduzione PROTEINE

 

Che cos’e la biotecnologia?

Biologia: scienza della vita, ovvero studio di ciò che sostanzialmente è vitale, studio di

come funziona il mondo vivente.

Biotecnologie: è l’applicazione delle conoscenze biologiche per produrre dei beni o dei

servizi.

La biotecnologia è l’applicazione tecnologica che si serve dei sistemi biologici, degli

organismi viventi o di

derivati di questi, per produrre o modificare prodotti o processi per un fino specifico.

In altre parole: è un ramo della biologia che utilizza gli esseri viventi o le conoscenze

che derivano dalla biologia.

MATERIALE GENETICO: gli acidi nucleici trasmettono l’informazione genetica.

La vita si sviluppa a partire dall’RNA ma avviene poi un passaggio al DNA in quanto la

struttura a doppia elica ha una maggiore stabilità (vantaggio). Si era convinti che

l’informazione genetica fosse trasmessa tramite le proteine poiché il DNA è una

molecola troppo semplice, un polimero composto dalla sola ripetizione di quattro basi.

Si eseguono quindi diversi esperimenti:

GRIFFITH: parte dal presupposto che esiste una molecola depositaria

 dell’informazione genetica. Griffith studia un vaccino della polmonite utilizzando

Streptococco.

due ceppi di

Il ceppo R, che genera colonie rugose, è benigno, non è dotato di capsula

polisaccaridica protettiva e il sistema immunitario della cavia in cui viene

iniettato riesce a degradarlo.

Il ceppo S, virulento e liscio, contiene nel genoma le informazioni per l’involucro

polisaccaridico (che conferisce la forma liscia) che lo isola dal riconoscimento

immunitario. Griffith aveva trovato che il batterio virulento, anche quando

ucciso dal calore, era in grado di trasformare il batterio benigno in un batterio

virulento vivo. Suggerì quindi che il materiale genetico codificante la capsula

rimanesse intatto anche dopo l’uccisione del batterio virulento e che potesse

entrare in un’altra cellula per ricombinare il suo materiale genetico.

CONTROLLO

POSITIVO

CONTROLLO NEGATIVO

PRIMA PROVA

SECONDA PROVA

Effettua poi un prelievo di sangue dalla cavia in cui erano state iniettate

entrambi i tipi di cellule e trova delle colonie di Streptococco S. l’informazione

per la produzione dell’involucro è così passata dalle cellule morte a quelle vive.

C’è un PRINCIPIO TRASFORMANTE.

AVERY: conclude che il DNA è il principio trasformante. Crea una coltura di

 cellule S ed esegue diverse estrazioni e aggiunge alle diverse provette cellule R.

I risultati ottenuti piastrando le cellule e facendo crescere colonie furono:

1. PROTEINE

cellule R



2. DNA 

cellule R +

COLONIE

DI

CELLULE S

3. RNA 

cellule R

4. LIPIDI 

cellule R

5. POLISACCA

RIDI 

cellule R

6. LIQUIDO

(CONTROLLO NEGATIVO) cellule R



Da questo si conclude che è il DNA il principio trasformante.

Cosa succede a livello molecolare? S

Le cellule S contengono il gene cap che codifica per il

rivestimento polisaccaridico.

Con il calore si ha la rottura della cellula.

Si rompono anche le molecole di DNA. S

Quando avviene il contatto con le cellule R, il gene cap , in alcune

R

cellule, va a sostituire con un doppio crossing-over il gene cap

che non codifica per nessun rivestimento.

Al termine ottengo alcune cellule che hanno sviluppato la capacità di generare il

rivestimento e che non sono quindi eliminabili dal sistema immunitario.

Il mondo scientifico rifiuta però l’esperimento di Avery.

CHASE E HERSEY: utilizzano un virus, un organismo che ha al suo interno solo

 DNA e proteine in modo tale da discriminarne definitivamente uno.

Crescono due colonie in terreni differenti:

1. Il primo contiene ZOLFO 35, marcatore di PROTEINE

2. Il secondo contiene FOSFORO 32, marcatore di DNA

Iniettano poi un batterio ospite, E. Coli, con fagi derivati da uno dei due terreni e

centrifugano in modo tale da terminare l’infezione, eliminare tutto il materiale

del fago rimasto fuori dal batterio e ottenere sul fondo delle due provette un

pellet batterico.

Analizzo poi la radioattività delle due provette:

1. La provetta con virus marcato con ZOLFO 35 riscontra radioattività solo

nella fase contenente i capsidi dei virus.

2. La provetta con FOSFORO 32 segna radioattività anche nel pellet

batterico essendo che i virus trasmettono il DNA all’interno del batterio



è appunto il DNA il fattore trasformante.

TRASFORMAZIONE BATTERICA metodo utilizzato da Chase e Harsey. Si introduce



DNA estraneo circolare (plasmide) in un batterio. Non è possibile inserire un DNA

lineare perché il batterio lo riconosce come estraneo

e ne degrada le estremità. Solo i virus possono

infettare un batterio con il proprio DNA lineare. Si

differenzia dalla trasfezione che è il processo con cui

introduco DNA estraneo non in un batterio ma in

una cellula.

Come avviene la trasformazione batterica:

Sviluppo della fase di competenza: isolamento del frammento di DNA e del

 plasmide.

Legame del DNA trasformante alle cellule competenti.

 Ingresso del DNA trasformante.

 Integrazione del DNA (ricombinazione): avviene attraverso uno shock termico.

 Espressione del DNA trasformante nella cellula in cui viene iniettato il plasmide

 ricombinante.

ACIDI NUCLEICI

Gli acidi nucleici sono polimeri lineari di nucleotidi. NUCLEOTIDE = zucchero + base

azotata + fosfato.

Dna: zucchero 2-deossiribosio, in posizione 2’ non c’è un ossidrile.

Rna: zucchero ribosio. Base azotata: composta da uno (pirimidine: citosina, timina e

uracile) o due anelli aromatici (purine: guanina, adenina).

I diversi nucleotidi sono uniti da un legame fosfo-diesterico:

legame che impegna l’ossidrile 3’ di un nucleotide e il

carbonio in posizione 5’ dell’altro nucleotide. Si formano due

legami esteri.

Le basi possono essere modificate dopo la sintesi del DNA/RNA:

DNA: METILAZIONE di CITOSINA, ADENOSINA.

 RNA è molto più modificato.



Nucleosidi: base + zucchero.

Nomenclatura dei fosfati: il fosfato alfa è quello direttamente legato allo zucchero e

che forma lo scheletro degli acidi nucleici. Per rilevare la sintesi dovrò marcare il

fosfato alfa. Il fosfato alfa è quelli che forma lo scheletro degli acidi nucleici.

CHARGAFF: specifica la composizione nucleotidica del DNA.

 Purifica il DNA da un certo numero di cellule diverse specie in maniera tale da

ridurre il contenuto ai singoli nucleotidi e a separarli. Esegue una cromatografia

su strato sottile per verificare la quantità dei diversi nucleotidi nelle diverse

specie.

CONCLUSIONI:

I quattro nucleotidi non sono presenti in eguale quantità.

o Le specie hanno una diversa composizione in nucleotidi caratteristica.

o Il DNA preparato da diversi tessuti e organi dello stesso organismo ha sempre

o la stessa composizione in basi e non cambia con l’età, lo stato di nutrizione o

l’ambiente.

Il numero di A è uguale al numero di T; il numero di G è uguale al numero di C.

o Il rapporto purine-pirimidine è 1:1.

o WATSON E CRICK: lavorano partendo dalle scoperte di Chargaff, Wilkins e

 Franklin (che utilizzarono la tecnica della diffrazione ai raggi X per analizzare le

fibre di DNA) e arrivano ad importanti scoperte sulla molecola di DNA.

DNA

Il DNA ha una struttura a doppia elica destrogira con uno scheletro esterno carico

negativamente (la carica è determinata dalla presenza dei gruppi fosfato). I due

filamenti sono antiparalleli. Le basi stanno all’interno, non sono accessibili alla

soluzione (sono idrofobiche). La doppia elica è molto regolare, con un diametro di 2

nm e un passo (distanza tra due punti nella stessa posizione) di 3,4 nm o 10,5 coppie

di basi. La regolarità è mantenuta dall’accoppiamento delle basi, una purina e

pirimidina (legami idrogeno e interazioni idrofobiche). A e T fanno due legami

idrogeno, G e C ne fanno tre. Si creano un solco maggiore e un solco minore. Quando

una proteina interagisce con il DNA in maniera sequenza specifica (interagisce con le

basi) tende a interagire nel solco maggiore perché la alfa-elica della proteina ha

esattamente le dimensioni per insinuarsi in questo solco. La molecola è molto stabile,

se voglio denaturarla innalzo la temperatura o utilizzo una soluzione basica in quanto

la repulsione elettrostatica è destabilizzante per la struttura.

La complementarietà della doppia elica ne garantisce, oltre alla stabilità, la

duplicazione in due molecole figlie. I due filamenti si aprono e vengono copiati

dall’enzima necessario seguendo la complementarietà delle basi.

STRUTTURE ALTERNATIVE DEL DNA:

Quella di Watson e Crick è la conformazione B

 Conformazione A: doppia elica con diametro più

 ampio, con un passo di 2,5 nm. La troviamo in

presenza di alcol e quindi in un ambiente povero di

acqua. Tipica struttura del RNA nelle regioni a doppio

filamento e durante la trascrizione (DNA appaiato con

RNA).

Forma Z, levogira e più slanciata: ha un diametro di

 1,8 nm. Si forma quando la sequenza è ricca in G e C

oppure in condizioni di alte concentrazioni di sale.

Esiste una piccola frazione di DNA in questa forma.

RNA Contiene uracile al posto di timina e ribosio al posto di deossiribosio.

 È a singolo filamento anche se forma regioni a doppio filamento.

 Le molecole sono molto più corte di quelle di DNA; portano l’informazione di uno

 o pochi geni.

Breve vita media (molto instabile in quanto è a singolo filamento).

 Può contenere basi insolite, modificate e non presenti nel DNA.

 Eccezioni date da virus con genomi a RNA a doppio o singolo filamento.



Può assumere diverse conformazioni in quanto le basi possono ruotare e ripiegarsi

liberamente attorno al legame fosfodiesterico e le basi possono impiegarsi in

appaiamenti non tradizionali. L’ossidrile in 2’ (non presente nel DNA) impedisce la

formazione di una doppia elica di tipo B (conformazione standard del DNA), favorendo

invece la conformazione A con il solco maggiore più stretto e profondo e quello minore

più largo e accessibile. La presenza dell’OH in posizione 2’ rende la molecola di RNA

molto reattiva l’RNA può avere funzione catalitiche.



DENATURAZIONE E IBRIDAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI

Le soluzioni di DNA a doppio filamento isolato sono molto viscose a ph 7 e a

temperatura ambiente. Quando queste soluzioni vengono sottoposte a condizioni

estreme di ph e temperatura (superiore agli 80°C) la viscosità diminuisce

bruscamente, segno del fatto che il DNA è andato incontro a un cambiamento fisico:

questo cambiamento è detto denaturazione (processo che può essere subito anche

dall’RNA). Con la denaturazione si ha la distruzione dei legami idrogeno tra le basi

appaiate e questo porta la doppia elica a disgregarsi in due filamenti singoli (non

avviene pertanto la distruzione dei legami fosfodiesterici). Dopo la denaturazione, se

la temperatura scende, la molecola a doppia elica si riforma (processo di rinaturazione

o annealing delle basi). La denaturazione può essere totale o parziale. Nel caso di

denaturazione completa, la rinaturazione avverrà in tempi più lunghi in quanto le

sequenze complementari dei due filamenti devono prima cercarsi e, grazie a collisioni

casuali, formano un breve tratto a doppia elica. Successivamente le rimanenti basi si

appaiano più velocemente. Ho un campione con DNA a una certa concentrazione e

con una certa assorbanza (260 nm). Scaldo la provetta e man mano l’assorbanza

aumenta fin quando non ho la denaturazione completa. L’assorbanza aumenta in

correlazione con la denaturazione in quanto la stretta interazione tra le basi della

doppia elica scherma l’assorbimento dei raggi UV (effetto ipocromico). Il filamento

singolo di DNA ha un’assorbanza superiore del 40% (effetto ipercromico). Se lascio poi

riposare il campione a temperatura ambiente mi si riformerà la doppia elica e il valore

dell’assorbanza sarà nuovamente quello iniziale. La transizione dal DNA a doppio

filamento alla forma a singolo filamento può quindi essere rilevata seguendo

l’assorbimento della luce UV.

Come faccio a visualizzare la denaturazione e la rinaturazione?

Per stimare la concentrazione di DNA utilizzo lo spettrofotometro una lunghezza



d’onda attraversa una soluzione contenente DNA e quando incontra DNA viene

modificata. In base alla modificazione calcolo la concentrazione di DNA. Il valore dato

dalla macchina è l’assorbanza, con una formula matematica risalgo alla

concentrazione (Legge di Lamber-Beer A = c l ε).



Se dopo aver denaturato il campione lo pongo a 0°C (la temperatura non scende

gradualmente, ma viene abbassata rapidamente) non riesce a rinaturarsi

regolarmente. Le molecole si dispongono secondo il gomitolo statistico in cui il DNA

forma alcune regioni a doppio filamento random perché ha scaricato energia. La

regione a doppio filamento può derivare da un ripiegamento del filamento stesso o

dall’appaiamento con una regione complementare di un altro filamento. In questa

situazione, come assorbe il DNA? Con un’assorbanza maggiore del valore iniziale ma

minore del singolo filamento (situazione intermedia).

IBRIDAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI: IL CONCETTO DI SONDA

Prendiamo due molecole identiche che si differenziano solo per due sequenze. Scaldo

e denaturo. Riscendo con la temperatura ad un valore vicino a quello iniziale posso



formare degli ibridi tra i due filamenti (duplex ibridi) con delle regioni di mismatch.

Non necessariamente ho un perfetto appaiamento.

Tutto questo introduce in concetto di SONDA, fondamentale negli esperimenti di

biologia molecolare. La sonda è una molecola, spesso marcata e riconoscibile, a

singolo filamento e aggiunta in largo eccesso in maniera tale che trovi la propria

sequenza complementare. Deve essere in largo eccesso in modo tale che venga

favorito l’appaiamento con la sonda. Quando ho denaturato aggiungo la sonda e

scendo con la temperatura in modo tale da rinaturare. La sonda in largo eccesso avrà

maggiore probabilità di incontrare il suo complementare.

PROTEINE

Macromolecole composte da amminoacidi che formano una lunga catena lineare che si

ripiega su se stessa in strutture tridimensionali. Le proteine sono le macromolecole da

cui dipendono tutte le attività della cellula.

AMMINOACIDI Ogni amminoacido contiene un carbonio

centrale (detto carbonio alfa) a cui sono

legati un gruppo amminico, un gruppo

carbossilico e una catena laterale che è

quella che caratterizza ciascun

amminoacido. Il legame peptidico avviene

tra il gruppo carbossilico di un amminoacido

e il gruppo amminico dell’amminoacido

successivo (con liberazione di una molecola

d’acqua).

CONFORMAZIONE DELLA PROTEINA:

Ogni proteina assume un’unica conformazione anche se ne potrebbe

 teoricamente assumere un numero enorme. Le informazioni per quella

conformazione specifica sono contenute nella sequenza amminoacidica di cui si

compone la proteina. Se denaturiamo una proteina (65°) è difficile che essa

ritorni nella sua conformazione iniziale assunta durante la sintesi peptidica. Non

siamo capaci di prevedere con assoluta certezza la conformazione di una

proteina, ma possiamo fare delle ipotesi nel caso in cui si abbia a che fare con

proteine di struttura primaria simile.

Il folding, il ripiegamento, è prevalentemente influenzato dal comportamento

 della proteina in ambiente acquoso e quindi dalla natura degli amminoacidi i

residui idrofobici tendono a stare all’interno, mentre quelli polari tendono a

stare verso l’esterno in modo tale da poter interagire con l’acqua.

La struttura finale di una proteina è mantenuta da legami deboli non covalenti

 (interazioni idrofobiche, legami idrogeno, interazioni ioniche, forze di Van der

Waals). Significa quindi che le proteine perdono facilmente la propria struttura.

LIVELLI STRUTTURALI

1. PRIMARIA: sequenza di amminoacidi legati da legame peptidico in cui il gruppo

carbossilico di un amminoacido interagisce con il gruppo amminico

dell’amminoacido successivo. L’ordine degli amminoacidi è scritto nel gene che

codifica per la tale proteina.

2. SECONDARIA: alfa elica (10-15 residui) e foglietto beta (3-10 residui). Ogni

proteina ha circa 1/3 di ogni struttura, il resto è disordine proteico che connette

le diverse strutture secondarie. Nell’alfa elica i legami peptidici sono paralleli

all’asse dell’elica e si formano legami idrogeno intracatena. I gruppi R degli

amminoacidi sono rivolti verso l’esterno dell’elica. Nel foglietto beta i gruppi R

sporgono perpendicolarmente all’asse del foglietto e si formano legami idrogeno

tra foglietti adiacenti (paralleli o antiparalleli).

3. TERZIARIA: definita dall’orientamento tridimensionale delle strutture secondarie

e delle anse che le connettono: la proteina si ripiega nello spazio, fatto reso

possibile dai legami deboli. Esistono anche legami covalenti nella struttura

terziaria, sono molto pochi. Un esempio è il ponte disolfuro tra due cisteine. La

struttura terziaria che una catena polipeptidica assume dopo l’avvolgimento è

quella con la più bassa energia, ovvero la struttura più stabile dal punto di vista

termodinamico. Questo è determinato già dalla sequenza amminoacidica della

struttura primaria.

4. QUATERNARIA: struttura assunta da proteine composte da diverse subunità che

possono essere ugu