Biologia molecolare

REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI

L’adattamento alle differenti condizioni ambientali e fisiologiche si realizza tramite la

regolazione dell’espressione genica. Regolare l’espressione genica significa regolare la

quantità di prodotto funzionale (proteina). I geni che sono sempre espressi sono detti

costitutivi e in genere codificano per funzioni sempre necessarie alla cellula; i geni

soggetti a regolazione vengono espressi solo per specifiche necessità della cellula e in

risposta a specifici segnali. I punti in cui posso controllare l’espressione genica sono i

punti in cui posso cambiare qualcosa al fine di ottenere una proteina funzionale:

Regolazione dell’inizio di trascrizione: i più comunemente usati giocano sulla

 modulazione dell’interazione proteina-proteina o proteina-DNA. Per esempio

agisco sui fattori trascrizionali per influenzare la trascrizione (migliorata o

peggiorata).

Processamento dell’RNA

 Stabilità dell’RNA

 Sintesi proteica

 Modificazione della proteina

 Trasporto proteico

 Regolazione della degradazione del trascritto (vita media del trascritto) tramite

 i non coding RNA.

I meccanismi iniziali sono usati nella regolazione efficiente (risparmio di energia)

mentre quelli finali sono per la regolazione rapida.

Possiamo avere degli attivatori o dei repressori che si legano a siti specifici:

Regolazione positiva: il promotore ha una sequenza tale per cui la RNA

 polimerasi forma difficilmente il complesso chiuso. Aggiungo un fattore

trascrizionale che aiuti la proteina a legarsi correttamente.

Regolazione negativa: il repressore si lega e la RNA polimerasi non si può

 legare.

Ho anche molecole effettrici che si legano agli attivatori o ai repressori in modo tale da

cambiare le sorti della trascrizione. L’attivatore o il repressore sono regolati

allostericamente tramite gli effettori che li rendono in grado di legarsi o meno.

RNA MESSAGGERI POLICISTRONICI E OPERONI

I batteri hanno raggruppato i geni tra loro correlati funzionalmente così da poterli

regolare nello stesso modo più facilmente. i promotori batterici sono spesso posizionati

a molte di molti geni che operano in un unico pathway metabolico. La trascrizione

produce un rna messaggero policistronico. Un OPERONE è un’unità di espressione e

regolazione genica batterica, comprendente geni strutturali ed elementi di controllo

(tra cui il promotore).

Operone Lattosio:

Si segue la curva di crescita di Coli in un mezzo che contiene sia glucosio che lattosio.

Si ha una prima crescita esponenziale in cui Coli utilizza glucosio; c’è poi un momento

di stallo di circa un’ora in cui il glucosio è esaurito; riprende la crescita esponenziale

utilizzando il lattosio. Quello che Coli fa nel momento di stallo è regolare la propria

espressione genica per tradurre gli enzimi necessari al metabolismo del lattosio.

Si scopre che quando Coli stalla inizia la sintesi di tre proteine regolate da diversi geni:

Lac Z beta galattosidasi: scinde lattosio in glucosio e galattosio

 

Lac Y galattoside permeasi: si inserisce nella membrana della cellula e

 

permette l’ingresso del lattosio.

Lac A transacetilasi: facilita la rimozione di galattosidi tossici importati

 

insieme al lattosio.

Lac I gene repressore che ha un proprio promotore. È un gene costitutivo che

 

viene sempre scritto e tradotto. In assenza di lattosio Lac I produce un

repressore che si lega all’operatore e impedisce il legame della RNA polimerasi.

In presenza di lattosio questo si lega al repressore che cambia conformazione,

perde affinità per l’operatore e l’RNA polimerasi può trascrivere.

L’analisi dei mutanti ha permesso di capire il meccanismo con cui lavora l’operone Lac

e come funzionano Lac I (regolatore) e Lac O (operatore).

Organismo aploide con fenotipo mutante Lac I: non viene prodotto il repressore,

 è consentita l’espressione dei geni Lac.

Se a un merodiploide (organismo aploide con una porzione di cromosoma

 diploide) aggiungo un plasmide che porta Lac I funzionale (wild-type) viene

prodotto il repressore che reprime i geni Lac di entrambi i cromosomi. Il

repressore agisce in trans.

Se muta l’operatore, il repressore non si lega permettendo l’espressione dei

 geni Lac.

Se aggiungiamo un plasmide con operone Lac funzionale, la mutazione

 dell’operatore permette l’espressione dei geni Lac sullo stesso cromosoma

anche se è presente un operatore wild-type sull’altro cromosoma (i geni non si

esprimono). L’operatore agisce in cis.

In genetica gli elementi che operano in cis sono quelli che devono essere fisicamente

collegati per avere un effetto; gli elementi che operano in trans possono agire anche

quando non sono fisicamente collegati, sintetizzano un prodotto diffusibile.

Controllo dell’operone Lac

A. Il controllo dell’operone consta di due elementi: un repressore proteico (il

repressore Lac, sintetizzato dal gene Lac I) e una sequenza di DNA detta

operatore (Lac O) a cui si lega il repressore. Se non c’è lattosio, i geni Lac non

vengono trascritti perché il repressore è legato al sito operatore e questo

legame impedisce l’attacco della RNA polimerasi. Quando invece è presente

lattosio, viene prodotta una piccola quantità di allolattosio (isomero del lattosio)

il quale funziona da induttore dell’operone Lac: l’allolattosio si lega al repressore

determinandone la perdita di affinità e la dissociazione dall’operatore. Con il

distacco del repressore, l’operone si attiva perché l’RNA polimerasi può iniziare

a trascrivere.

B. Un altro fattore che influenza l’espressione dei geni Lac è la disponibilità di

glucosio, la principale fonte energetica di E. Coli. Quando è presente glucosio

entra in gioco un meccanismo di regolazione noto come repressione da

catabolita. In presenza di glucosio, quindi, l’operone Lac non viene espresso.

L’effetto del glucosio sull’operone è mediato dal cAMP e dalla sua proteina

recettore CRP. Quando manca glucosio, il complesso CRP-cAMP si lega ad una

regione vicina al promotore stimolando la trascrizione.

La regolazione del lac-operone avviene a due livelli:

Il repressore Lac opera una regolazione negativa. L’operone è inducibile in

 quanto il repressore viene staccato dall’induttore, l’allolattosio dipende dalle



concentrazioni di lattosio.

Il complesso cAMP-CAP opera una regolazione positiva, inducendo livelli di

 trascrizione più alti dipende dalla concentrazione di glucosio.



Operone Triptofano:

Contiene i cinque geni che codificano gli enzimi necessari a sintetizzare il

corrispondente amminoacido. È controllato negativamente dal repressore Trp e il

triptofano stesso agisce come molecola effettrice (corepressore) per il repressore. La

repressione avviene quando l’amminoacido triptofano è in eccesso. È una regolazione

diversa da quella negative dell’operone Lac, in cui il repressore lega l’operatore

quando non c’è l’induttore allolattosio. Oltre alla regolazione negativa del

repressore, c’è un altro sistema di

controllo che è l’attenuazione. È un

meccanismo di regolazione che entra in

gioco una volta che è allentata la

repressione ed è iniziata la trascrizione:

la trascrizione inizia normalmente ma

viene interrotta prima che i geni

dell’operone siano stati trascritti.

L’attenuazione è regolata dalla

concentrazione di triptofano. In caso di

basse concentrazioni di triptofano, la

RNA polimerasi scorre lungo

l’attenuatore e in questo modo i geni

strutturali vengono trascritti; in caso di

alte concentrazioni di tirptofano,

l’attenuatore causa la terminazione

prematura della trascrizione e i geni

strutturali non vengono trascritti.

Il meccanismo dell’attenuazione si basa

su una regione detta sequenza leader

(Trp L) che precede il codone di inizio del primo gene. All’interno della sequenza leader

ci sono quattro regioni di regolazione, numerate da 1 a 4. Le regioni 3 e 4, nel

trascritto RNA, possono appaiare le proprie basi per formare un terminatore, una

struttura a forcina ricca di legami GC seguita da una serie di residui di U. La

formazione del terminatore porta l’RNA polimerasi a terminare prematuramente la

trascrizione e a staccarsi dal DNA prima che i geni dell’operone possano essere

trascritti. La regione 3 può però appaiarsi anche con la regione 2: in questo modo il

terminatore (3-4) non si può formare, si forma una forcina che però non interrompe la

trascrizione. L’appaiamento delle regioni viene

stabilito dalla regione di regolazione

1 e dalla disponibilità di triptofano:

la regione 1 codifica per un peptide

leader di 14 amminoacidi, di cui

due sono triptofano. Il peptide

leader non ha alcuna funzione

cellulare, la sua sintesi è un puro

strumento di regolazione

dell’operone. Questo peptide viene

tradotto non appena l’RNA leader è

trascritto. Quando c’è molto

triptofano, anche la concentrazione

trp

di Trp-tRNA è alta. Questo

permette alla traduzione di

procedere velocemente oltre i due

codoni trp della sequenza 1 e nella

sequenza 2 prima che la sequenza

3 venga trascritta. In questa

situazione il ribosoma occupa la

regione 2, impedendo il legame con

la regione 3 che può invece

appaiarsi alla 4 formando la forcina di terminazione. Al contrario, quando la

concentrazione di trp è bassa, il ribosoma si blocca sulla regione 1 a livello dei due

codoni trp. La regione 2 e la regione 3 possono quindi appaiarsi, non si forma la forcina

di terminazione e la trascrizione procede. La quantità di trascritti prematuri diminuisce

al diminuire della concentrazione di trp.

Risposta SOS

Sono meccanismi che intervengono in caso di danno al DNA causato da rotture o

mutazioni del cromosoma batterico. La risposta SOS richiede l’intervento di due

proteine regolatrici: RecA e il repressore LexA. I geni SOS codificano per proteine utili

alla cellula con DNA danneggiato.

Il repressore LexA inibisce la

trascrizione dei geni SOS (in situazioni

di non danno genomico) legandosi

vicino ai loro promotori. L’induzione

della risposta SOS richiede la

rimozione di LexA: questa si inattiva

catalizzando un autotaglio di un

legame peptidico. Questa reazione di

autotaglio è catalizzata da RecA. Un

pesante danno al DNA causa la

formazione di numerosi interruzioni a

filamento s