Biologia Cellulare (completo)

Introduzione alla biologia cellulare

L'oggetto di studio sono le cellule di mammifero, in particolare quelle umane. Le cellule, in media, hanno una dimensione che si aggira intorno alla decina di micrometri, però ci sono anche alcune eccezioni, ad esempio, la cellula uovo può superare 150 μm e gli assoni dei motoneuroni possono arrivare a raggiungere anche lunghezze di 1 m.

L'osservazione delle cellule può essere effettuata con un microscopio ottico, ma per l'osservazione approfondita degli organuli cellulari ci dobbiamo servire del microscopio elettronico. Normalmente si osservano le cellule umane con un microscopio invertito contrasto di fase (si possono osservare le cellule in una piastra Petri, cioè un contenitore avente un indice di rifrazione più grande di un vetrino; in questo modo si possono osservare vive, senza l’ausilio di colorazioni. Si sfrutta il fatto che il mezzo, il terreno, in cui sono immesse le cellule ha un indice di rifrazione più basso delle stesse e questa differenza viene amplificata per vederle meglio.

Cenni di storia delle colture cellulari

• 1885: Wilhelm Roux condusse a termine con successo i primi esperimenti di espianto mantenendo il cervello di un embrione di pollo in una soluzione salina calda per pochi giorni.
• 1907: Ross G. Harrison compiva i primi esperimenti su colture di cellule animali, utilizzando campioni di midollo spinale di rana in un coagulo di linfa.
• 1909: Francis Peyton Rous, medico virologo statunitense, dimostrava la possibilità di mantenere in vita in una soluzione salina cellule d’embrione di pollo e scopriva che nei polli il sarcoma poteva essere indotto non solo trapiantando cellule tumorali ma anche iniettando un filtrato di tali cellule che, come fu provato più tardi, conteneva un agente sub-microscopico infettivo estratto dalle stesse cellule, denominato in seguito virus del Sarcoma di Rous (virus a RNA).
• 1913: Alexis Carrel diede notevoli contributi alla tecnica di coltivazione delle cellule in vitro, mantenendo porzioni di tessuto di 1/2 mm di diametro, espiantate da animali, in specifici terreni di coltura (in genere contenenti plasma), in condizioni asettiche e in condizioni osmotiche e termiche simili a quelle fisiologiche.
• 1948: W. R. Earle metteva a punto la crescita in vitro di cellule singole, isolate da tessuto di mammiferi, in piccole quantità di adatti terreni di coltura e dimostrava che le cellule in coltura potevano formare dei cloni (NTCT clone 929, fibroblasti da connettivo murino).
• 1951: George Otto Gey isolava, metteva in coltura e propagava per la prima volta una coltura cellulare d’origine tumorale, realizzando la prima linea cellulare in coltura continua, proveniente da un tumore umano, cioè una linea di cellule che si propagava indefinitamente, nota come linea cellulare HeLa (Henrietta Lacks).
• 1951-52: Rita Levi-Montalcini realizzò gli esperimenti fondamentali che la condussero, durante la sperimentazione di un trapianto di tumore di topo sul sistema nervoso dell’embrione di un pollo, alla scoperta in coltura della presenza del NGF (Nerve Growth Factor), un fattore di crescita del nervo che gioca un ruolo essenziale nella crescita e differenziamento delle cellule nervose sensoriali e simpatiche, come agente stimolante la crescita degli assoni.
• 1952: Dulbecco propose l’utilizzo della tripsina per la generazione di sottocolture.
• 1955: Harry Eagle compì la prima indagine sistematica sugli elementi nutritivi essenziali, necessari affinché una coltura cellulare possa essere mantenuta. Anni '50, dimostrazione che le cellule animali in coltura necessitavano di un mezzo nutritivo contenente siero (Eagle, Sanford, Harris).
• 1961: Leonard Hayflick pubblicò un lavoro nel quale riportava che fibroblasti umani in coltura smettevano di proliferare dopo circa 50 divisioni e tutte le cellule perdevano la capacità proliferativa dopo un uniforme e fissato numero di duplicazioni in dipendenza dalla vita media dell’organismo da cui erano prelevate (Hayflick limit).
• 1986: Martins ed Evans isolavano per la prima volta cellule staminali da embrioni di topo, mentre nel 1988, Thompson ed Evans isolavano per la prima volta cellule staminali umane.

Anni ‘80-2000+

• Regolazione dell’espressione genica
• Oncogeni, trasformazione, malignità
• Colture su scala industriale per il settore bio-farmaceutico
• Colture di cellule staminali embrionali umane
• Ingegneria tissutale (impianto di cellule normali da donatori o di cellule geneticamente ricostituite del paziente)

Colture cellulari

Si definisce coltura cellulare la crescita di cellule isolate dal tessuto di partenza. Collezioni di linee cellulari: strutture specializzate nella conservazione e propagazione di cellule su larga scala. Disponibilità di linee cellulari stabilizzate provenienti da diverse specie le cui caratteristiche genetiche, morfologiche e di crescita sono ben note:

• ATCC = American Type Culture Collection - Mariland - USA
• ECACC = European Collection of Animal Cell Culture - UK
• DSMZ = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) - Germany
• JCRB = Japanese Collection of Research Bioresources – Japan

Le informazioni inerenti tali linee cellulari sono raccolte in un database e coordinate dalla WFCC (World Federation for Culture Collections). L’opera di coordinamento di questa commissione consiste nella raccolta e nella distribuzione dei dati relativi a circa 500 linee cellulari distribuite in 55 paesi e nella descrizione delle loro caratteristiche.

Le cellule conservate nelle banche internazionali sono di facile acquisizione e prive di contaminanti; sono inoltre accompagnate da un certificato di garanzia che informa su: tipo di cellula, origine, terreno di coltura da utilizzare per crescita e congelamento, caratteristiche di crescita, morfologia, numero di passaggi in coltura e cariotipo.

Possibili applicazioni delle colture cellulari

Vantaggi delle colture cellulari

• Controllo delle caratteristiche fisico-chimiche dell’ambiente (pH, temperatura, pressione osmotica, composizione del terreno di coltura, tensione di O₂ e CO₂)
• Omogeneità del campione: possibilità di analisi effetti tossici su cellule umane (correlazione con modelli animali, validazione dei modelli animali)
• Riduzione del numero di animali uccisi per la sperimentazione
• Abbattimento dei costi (risultati in tempi brevi)
• Utilizzo di piccole quantità di sostanze da saggiare (cellule a contatto diretto con sostanze nel mezzo di coltura, non soggette a variabili farmacocinetiche)

Limiti delle colture cellulari

• Expertise dell’operatore (sterilità assoluta)
• De-differenziamento e selezione
• Origine delle cellule, autenticazione
• Instabilità genetica
• Differenze da cellule in vivo:
  • Perdita dell’architettura tridimensionale del tessuto (perdita delle specifiche interazioni cellulari caratteristiche dell’istologia del tessuto)
  • Mancanza di regolazione omeostatica sistemica (sistema nervoso e sistema endocrino)
  • Acquisizione di motilità
  • Crescita della frazione di cellule in proliferazione attiva
  • Mancanza di carrier dell’ossigeno (Hb) (metabolismo principalmente glicolitico)
  • Difficoltà di correlare le concentrazioni e le condizioni di esposizione alle sostanze nelle colture in vitro rispetto alla situazione in vivo

Metodi per iniziare una coltura

Si possono avere due metodi per iniziare una coltura:

• Coltura d’organo: Si mantiene, almeno parzialmente, l’architettura tridimensionale del tessuto in vivo. Piccoli pezzi di organo vengono messi in coltura. Con un bisturi si preleva dall’organismo modello. Si pone il pezzo fra aria e mezzo nutritivo, per far in modo che questo abbia accesso a gas e nutrienti necessari. Abbiamo anche una soluzione isotonica che permette di mantenere l’umidità nel contenitore.

Limite: Deve essere prelevato un tessuto avente un certo spessore (diametro di circa 1 mm, se maggiori si forma una zona necrotica da evitare).

Problemi: Difficile riproducibilità e durata limitata (giorni, al massimo settimane). Si utilizzano per studi di morfologia, embriologia, fisiologia e studio dell’effetto di sostanze sulla funzionalità d’organo. Il vantaggio è il mantenimento dell’architettura tridimensionale.

• Coltura cellulare primaria: Coltura generata isolando direttamente le cellule dai tessuti dell’organismo modello. Singole cellule prelevate dal modello e isolate. Una volta piastrate vanno incontro a proliferazione e propagazione tramite allestimento di sottocolture. Una volta occupato tutto lo spazio durante la proliferazione si ha inibizione da contatto e perciò si allestiscono sottocolture per farle propagare (passaggio). La prima volta in cui si va incontro a passaggio si passa da coltura cellulare primaria a linea cellulare.

Per tutte le cellule dei tessuti si dovranno rompere i legami cellula-cellula e i legami cellula-matrice extracellulare per piastrarle. I legami sono mediati da proteine:

• Caderine (cellula-cellula): Proteine transmembrana caricate negativamente sul versante extracellulare (dovuto a residui oligosaccaridici). Il legame fra due caderine è mediato da ioni Ca²⁺ disposti a ponte.
• CAM (cellula-cellula): Proteine che formano i legami senza bisogno di Calcio.
• Integrine (cellula-matrice extracellulare): Hanno due subunità (α e β). Il dominio citoplasmatico si lega al citoscheletro ed ha anche funzione segnalatoria. Il dominio extracellulare si lega a proteine della matrice extracellulare grazie al Ca²⁺ (con il legame al collagene non serve lo ione Calcio).
• Proteoglicani (cellula-matrice extracellulare): Recettori transmembrana che legano proteoglicani di matrice, collagene e fattori di crescita.

Tipi di colture cellulari

• Colture adesione dipendenti: Le cellule aderiscono al supporto (substrato) e si propagano (Ancoraggio dipendenza). L’adesione al substrato è un prerequisito per la sopravvivenza e la proliferazione.
• Colture in sospensione: Anche dette colture adesione indipendenti. Le cellule sono disperse omogeneamente nel liquido di coltura, crescono in vitro in un mezzo fluido e possono proliferare rimanendo in sospensione senza aderire ad una superficie (tramite agitazione). Non crescono indefinitamente (finiscono nutrienti o rilascio di prodotti catabolici). Spesso utilizzate per cellule del tessuto ematopoietico o tumori.

Allestimento di una coltura primaria

Anche se l’isolamento di differenti tessuti può richiedere diverse condizioni, alcuni requisiti sono comuni:

• Rimozione del tessuto in maniera asettica (si disinfetta l’area di cute da tagliare per raggiungere l’organo).
• Trasferimento immediato in soluzione salina bilanciata (soluzione isotonica e stesso pH) o terreni di coltura sterili contenente antibiotici (limitare contaminazioni soprattutto se si preleva un tessuto contenente alta carica microbica).
• Dissezione dell’area di interesse con rimozione del grasso, fibrosi ed eventuali zone di necrosi.
• Il tessuto deve essere sminuzzato finemente con bisturi affilato in modo da causare il minor danno cellulare.

Allestimento di una coltura primaria da frammenti di tessuto

Tecnica dell’espianto primario: Frammenti di tessuto sono fatti aderire ad un supporto di vetro o plastica, l’adesione poi favorisce la migrazione.

Sospensione cellulare: Da una sospensione ottenuta per disgregazione enzimatica o meccanica del tessuto. Le cellule del tessuto sono disperse in sospensione e poi fatte aderire al supporto.

La tecnica dell’espianto prevede che il tessuto di partenza sia sminuzzato finemente e seminato in piastre con un mezzo di coltura contenente un’alta concentrazione di siero. Le cellule, entro pochi giorni, migrano alla periferia dell’espianto, aderiscono al substrato e iniziano a proliferare. La tecnica è utile in particolare per piccole quantità di tessuto (es. biopsie) per le quali il rischio di perdita di materiale dovuto alla disgregazione meccanica o enzimatica è elevato. Gli svantaggi sono rappresentati dal fatto che alcuni tessuti hanno scarsa adesività, inoltre le cellule che migrano e crescono maggiormente sono selezionate. Le cellule che migrano dall’espianto più facilmente sono: fibroblasti, mioblasti, cellule epiteliali e cellule embrionali.

Sospensione cellulare

• Disgregazione enzimatica: Il tessuto di partenza è trattato mediante una soluzione contenente enzimi digestivi che agiscono a livello delle giunzioni cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare

Vantaggi: Produce un maggior numero di cellule, più rappresentative del tessuto di partenza e in un tempo più breve. È un metodo molto più veloce se confrontato con l’altro. Evita la selezione per migrazione. Seleziona cellule resistenti al metodo impiegato e le cellule capaci di aderire al substrato. I risultati migliori della disgregazione enzimatica si ottengono con i tessuti embrionali, sia in termini di difficoltà minore, sia in termini di resa di cellule vitali e proliferative. All’aumentare dell’età è più difficile ottenere cellule vitali e proliferative a causa di:

• Processi differenziativi
• Riduzione del pool delle cellule proliferative non differenziate
• Aumento del tessuto connettivo fibroso/ECM

Tutte queste condizioni richiedono procedure più aggressive per disgregare il tessuto che portano alla perdita delle componenti più fragili. Per esempio, nei tumori fibrosi è molto difficile ottenere la dissociazione completa e mantenere vitali le cellule tumorali.

Gli enzimi più usati sono:

• Tripsina: Enzima maggiormente utilizzato. Degrada proteine (serino-proteasi). È aspecifica e attacca tutte le proteine a livello degli aminoacidi basici. È secreta dal pancreas come tripsinogeno e viene attivata nell’intestino (pH leggermente basico, ma nelle colture si utilizza a pH un po' più basso). Facilmente inattivabile da α1-antitripsina (facile da modulare) che si trova nel siero. Si utilizza in associazione con chelanti di ioni bivalenti (in combinazione con la tripsina si rompe i legami e i chelanti sequestrano il Calcio indispensabile per la loro formazione) che sono EDTA ed EGTA. La disgregazione con tripsina è inefficace per tessuti molto fibrosi ed è troppo lesiva per tessuti fragili. Si utilizzano, perciò, gli altri enzimi

L’azione della tripsina è ben neutralizzata dal siero del mezzo di coltura. In aggiunta si possono addizionare inibitori dell’attività enzimatica. Tuttavia, è importante che l’esposizione all’enzima sia ridotta al minimo in modo da conservare al massimo la vitalità delle cellule. Il suo uso è effettuato:

• A caldo (37°C): Le cellule devono essere raccolte ogni 30 min e l’enzima deve essere neutralizzato con il siero. Si utilizza la tripsina in cicli di 30 minuti (ogni 30 minuti si interrompe l’azione con il siero) e poi si raccolgono le cellule. Utile per la disgregazione di grandi quantitativi di tessuto in poco tempo. Non è molto indicata per la disgregazione di tessuti adulti caratterizzati da un significativo contenuto di tessuto fibroso; inoltre, l’agitazione meccanica potrebbe danneggiare i tipi cellulari più sensibili, quali le cellule epiteliali
• A freddo: Primo step in cui il tessuto viene a contatto con la tripsina per 6-18 ore a 4°C (tripsina inattivata a tale temperatura. Durante questa fase si ha la massima penetrazione nel tessuto e minima attività triptica. Successivamente si fa procedere la digestione a 37°C per 20-30 minuti. Evita l’esposizione prolungata del tessuto a tripsina a 37°C che potrebbe danneggiare le cellule. L’incubazione a 4°C per 6-18 ha lo scopo di far penetrare l’enzima nel tessuto con bassa attività enzimatica. In seguito a tale procedura il tessuto necessiterà di una incubazione a 37°C di soli 20-30 min per la disgregazione. Il metodo è adatto per piccole quantità di tessuto.

Dopodiché si centrifuga. Il sopranatante contiene le cellule che verranno piastrate ed il pellet rimasto verrà sottoposto di nuovo a centrifugazione. Come abbiamo già detto, la tripsina non è sempre utilizzabile; in tal caso si utilizzano gli altri enzimi.

• Collagenasi: Per tessuto connettivo e muscolare, in quanto la matrice è ricca di collageno, per gli epiteli e per i tessuti tumorali umani
• Ialuronidasi: Colpisce i carboidrati che intervengono nell’adesione
• Neuraminidasi: Stessa cosa della Ialuronidasi
• Pronasi e dispasi: Proteasi di origine batterica
• DNAasi: Ha la funzione di disperdere il DNA proveniente dalle cellule lisate che tende a favorire la riaggregazione

Sono anche usate combinazioni di enzimi.

• Disgregazione meccanica: Rompe i legami con metodi meccanici. È un metodo utilizzato per superare gli svantaggi dell’espianto (processo lento e selettivo, adatto solo per piccole quantità di tessuto) e della disgregazione enzimatica (rischio di danno proteolitico). Non espone le cellule a danni proteolitici. Si ha selezione per cellule resistenti a danno meccanico. Il tessuto di partenza è sminuzzato finemente con bisturi o forbici in un mezzo di coltura e successivamente è passato attraverso un setaccio per ottenere una sospensione cellulare uniforme.