Biologia cellulare con laboratorio - Parte 2

LIMITI IN VITRO

● Farmacocinetica: tempo di esposizione e concentrazione del farmaco, velocità di

variazione della concentrazione e metabolismo del farmaco.

● Metabolismo: la tossicità di molte sostanze varia in seguito a metabolizzazione da

parte del fegato,

Per ovviare a questo problema sono stati fatti studi in cui le cellule prima sono state fatte

crescere con colture di epatociti o di epatoma, cellule del fegato, per essere sicuri che la

cellula entri in contatto proprio con la forma della molecola di cui stiamo studiando

tossicità.

● Risposta tissutale e sistemica (es. febbre, vasodilatazione...)

NATURA DEL SAGGIO

La scelta del saggio dipende dall’agente oggetto di studio, dalla natura della risposta

attesa e dal particolare target cellulare.

I saggi in vitro si dividono in 3 categorie principali:

● Saggi di vitalità: valutano una risposta immediata o a breve termine. Basati sulla

valutazione della permeabilità di membrana aumentata o incontrollata (test di

esclusione di coloranti/test di assunzione di coloranti). Come sappiamo la

membrana plasmatica è una mebrana altamente selettiva semi permeabile, a

seguito di danno può essere alterata la suddetta permeabilità.

I metodi più comuni impiegano coloranti e si dividono in 2 macrogruppi:

1. test di esclusione di coloranti quali Trypan blue, Eritrosina B e Nigrosina.

PRINCIPIO:

Si valuta integrità si membrana. La membrana cellulare integra non consente il passaggio

dei coloranti e le cellule non sono colorate. Le cellule danneggiate/ morte, invece, sono

permeabili e sono colorate.

LIMITI: ▪ Il test fornisce informazioni sull’integrità della membrana, ma non indica se

le cellule saranno in grado di aderire al substrato e di proliferare.

▪ Inoltre, le cellule che sono state tripsinizzate, o provengono da

disgregazione del tessuto o sono state scongelate possono avere subito

danni reversibili che provocano l’assunzione dei coloranti.

l più usato è il Trypan blu : molto rapido.

Molecola estremamente grande con peso molecolare 960,81 g/mol, è composto da 4

gruppi solforati carichi negativamente, ciò fa sì che le cellule con membrana integra

(cellule vive) non ne permettano il passaggio.

Al contrario, le cellule con membrana plasmatica danneggiata (identificate come morte)

permettono al trypan blu di penetrare, che grazia alla presenza di questi 4 gruppi solforati

si lega alle proteine e non esce dalla cellula.

Quindi mettendo la soluzione cellulare, a seguito di trattamento con trypan blu, su

emocitometro si può avere stima di numero di cellule vive e cellule morte.

Sarebbe oppurtuno effettuare il test in assenza di siero, in quanto il trypan blu legherebbe

anche proteine contenute nel siero.

Inoltre bisogna essere molto rapidi, massimo 10 minuti, in quanto tutte le cellule

diventerebbero blu, indipendentemente dall'integrità di membrana.

Di solito questo metodo viene utilizzato prima di effettuare piastramento della sottocultura.

2. test di assunzione di coloranti quali fluoresceina diacetato

PRINCIPIO: la fluoresceina diacetato è un derivato non fluorescente idrofobico della

fluoresceina. Essendo idrofobico permea la membrana plasmatica. Le cellule vitali

assumono il colorante e lo idrolizzano a fluoresceina da esterasi la quale è fluorescente e

a cui la membrana cellulare integra è impermeabile in quanto carica.

Le cellule vive emettono fluorescenza verde a causa della fluoresceina presente nel loro

citoplasma (λecc: 490 nm; λemetterà: 525 nm), le morte no, in quanto anche se ci fossero

dei residui di esterasi attivi, la fluoresceina non rimarrebbe comunque all'interno della

cellula in quanto la membrana è danneggiata. Le cellule morte possono invece essere

colorate con ioduro di propidio ( intercalante delle basi, si va a legare al DNA) ed

emettere fluorescenza rossa. Colorante impermeabile nelle cellule vive.

● Saggi di sopravvivenza: conservazione a lungo termine della capacità replicativa

(ovvero capacitò di proliferare -considerata come potenziale rigenerativo) e

misurata ad esempio mediante variazione netta delle dimensioni della popolazione

(curve di crescita) o variazioni nella massa cellulare (DNA o proteine totali). Già

studiati in precedenza.

● Saggi metabolici: valutazione quantitativa di una risposta metabolica (es. attività

di un enzima)

1. MTT

Si tratta di un test colorimetrico che valuta l’attività di deidrogenasi mitocondriali ( enzimi

che vengono inattivati quando la cellula va incontro a danno) : le cellule vitali riducono il

–

reattivo MTT (3-(4,5-dimetil)tiazol-2-yl-2,5-difenil tetrazolio bromuro di colore giallo e

solubile in acqua) a formazano (porpora e insolubile in acqua).

Il sale di tetrazolio (MTT) giallo è ridotto nelle cellule metabolicamente attive a cristalli di

formazano insolubile di colore porpora.

Questi cristalli vanno a depositarsi nei mitocondri (dove viene sintetizzato), e quindi non

avremo terreno colorato di porpora ma al microscopio osserveremo che nelle cellule

metabolicamente attive ci saranno dei puntini neri che definiscono i cristalli di formazano.

Perciò avremo tanto sale di formazano quanto più le cellule staranno bene.

Le cellule sono lisate e il prodotto solubilizzato in solvente (dimetil soflossido, che è un

liquido incolore che lisa immediatamente le cellule) non acquoso;dopodiche il colore è

quantificato λ= 595 nm con spettrofotometro.

Questo metodo , provocando la morte cellulare, si può effettuare solo una volta su

quell'esperimento.

Il DMSO è tossico, e inoltre può veicolare attraverso l'epidermide e anche guanti di

gomma alcune sostanze pericolose che non sono solubili in acqua.

2. TEST WST-1

Anche in questo caso si sfrutta la capacità delle deidrogenesi mitocondriali di cellule

integre dal punto di vista metabolico per ridurre un sale di tetrazolio, WST-1 a formazano.

Il metodo è sostanzialmente simile a quello con MTT.

WST-1 ha il vantaggio di produrre prodotti solubili in acqua che possono essere misurati

senza la necessità di lisare le cellule.

è più stabile dell’MTT.

Inoltre WST-1

Colorazione rossa, dopo 30 minuti possiamo andare al lettore di piastra e misurare

assorbanza a 450nm.

Nel caso in cui valori di assorbanza sia troppo basso, noi semplicemente prendere le

nostre cellule con wst1 e rincubarle ed effettuare vari studi di assorbanza.

STUDIO DELLA PROLIFERAZIONE

Ci sono vari modi per poter studiare la proliferazione cellulare tra cui:

1. Studio delle curve di crescita di una popolazione,

Immunochimica per l’analisi di proteine specifiche del ciclo cellulare

2. • Division Index: frazione di cellule proliferanti, frazioni che sono in ciclo

(qualsiasi fase del ciclo).

Division Index: n cellule che esprimono marker di cellule in crescita

n tot di cellule

per l’analisi di proteine marker di cellule in

Questo metodo utilizza Immunochimica

crescita nella popolazione cellulare.

1. ◦ Ki-67 è una proteina nucleare espressa durante tutte le fasi del ciclo

cellulare, ad eccezione della G0 . Metodo ottimale perciò per

analizzare il numero di cellule in ciclo, in quanto la fase G0 è

un'uscita in ciclo. alla M, dove l’espressione è massima.

Mostra un incremento progressivo dalla G1

◦ PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) proteina necessaria per

la sintesi di DNA, la sua espressione è elevata nelle fasi G1/S mentre

cellule senescenti e quiescenti hanno livelli di espressione di PCNA

molto bassi. Usato come marker della proliferazione cellulare, nche

se comunque è un'approssimazione in quanto riconosce solo le

cellule in ciclo G1/S, ma visto che le cellule proliferanti passano la

maggior parte del tempo di ciclo in G1/S è considerato accettabile.

◦ Cicline venivano utilizzate in passato, ma proprio a causa della loro

natura, perchè ogni ciclina è espressa in una fase del ciclo ben

precisa, il loro utilizzo è andato scemando.

Per determinare quante e quale cellule le esprimono ci affidiamo alla immunochimica.

Definizione di IMMUNOCHIMICA → si intende un insieme di tecniche che permettono

l’identificazione e la localizzazione di antigeni in situ mediante l’impiego di anticorpi

specifici (in vitro e in vivo su preparati istologici).

Si basa su:

• →reazione altamente specifica.

reazione antigene-anticorpo

ANTICORPO: proteina (immunoglobulina) prodotta dall’organismo in risposta

ad una sostanza eterologa definita ANTIGENE.

L’anticorpo riconosce una parte (definita EPITOPO) dell’antigene, al quale si combina

chimicamente ed in modo altamente specifico.

• sistema di rivelazione → I sistemi di rivelazione prevedono l’impiego di

molecole che, coniugate agli anticorpi, permettono di visualizzare il sito di

reazione, e quindi di localizzare l’antigene. Ne possiamo utilizzare 2 tipi :

1) FLUOROFORI Isotiocianato di fluoresceina (eccitata a 488 nm e rilascia

lunghezza d'onda di 550 nm), Acido disulfonico di rodamina →

IMMUNOFLUORESCENZA (microscopio a fluorescenza/citofluorimetro)

(visualizzare solo in campo scuro e più instabile nel tempo)

• E’ il fenomeno per cui una molecola colpita da una radiazione luminosa

di definita λ ne emette un’altra a λ maggiore e ad energia inferiore.

Il fluoroforo assorbe energia dal laser, l'energia fornita avrà lunghezza d'onda tale da

eccitare il fluoroforo.

Lo stato eccitato ha una vita breve, intorno all'ordine di 1-10 nanosecondi e durante

questo stato perde parzialmente la sua energia rilasciandola. Passa ad uno stato eccitato

a energia minore.

Le molecole fluorescenti sono in grado di tornare al loro stato fondamentale tramite

l'emissione di fluorescenza.

Il fluoroforo rilascia l’energia assorbita per:

◦ Vibrazione e dissipazione di calore

◦ Emissione di fotoni di una lunghezza d’onda maggiore

Perossidasi di rafano, β-galattosidasi, fosfatasi alcalina →

2) ENZIMI:

IMMUNOISTOCHIMICA (microscopio) (anche in campo chiaro e stabile nel

tempo)

Questo metodo si basa il concetto per cui al complesso antigene-anticorpo è coniugato un

enzima, cniugato all'anticorpo.

Al preparato verrà fornito un sub strato croogeno dell'enzima, cioè all'enzima viene fornito

un substrato, che in presenza dell'enzima, diventa un prodotoo colorato e insolubile.

L'insolubilità fa sì che si formi un precipitato sul sito di reazione, ovvero in prossimità del

complesso anticorpo- antigene.

Al microscopio possiamo notare, che nel sito di reazione è presente un accumulo di

colore. • L’enzima p