Appunti completi biologia cellulare

BIOLOGIA CELLULARE 2019/2020

Introduzione e storia:

- 1885 Roux fece primi esperimenti mantenendo cervello di embrione di pollo in

• soluzione salina calda, quindi mantenendo per qualche giorno la vitalità del cervello

fuori dall’embrione.

- 1907 Harrison utilizzò campioni di midollo spinale di rana: isolo quindi queste

• cellule e le coltivo per qualche tempo mantenendole in un coagulo di linfa. Utilizzo

cellule di rana poiché gli anfibi hanno una T più bassa rispetto ai mammiferi e quindi

le ridurci a mantenere a T ambiente.

- 1909 Rous tenne in coltura cellule di embrione di pollo (a sangue caldo) in

• soluzione salina; osservo che il sarcoma poteva essere indotto non solo tramite

cellule ma anche soluzione contenente tali cellule.

- 1913 Carrel cerco di comprendere condizioni ottimali di coltura, individuando

• come condizione fondamentale la sterilità + mise appunto le condizioni osmotiche e

termiche più favorevoli, ovvero più simili possibile alle condizioni fisiologiche.

- 1948 Earle metteva appunto la crescita di cellule singole isolate da tessuto di

• mammiferi + mettere appunto i terreni di coltura. Riuscì a dimostrare che cellule

poste in coltura erano in grado di dividersi e dare origine a cloni (cellule

geneticamente identiche tra loro che originano per mitosi dalla stessa cellula).

- 1951 Gey fu il primo a mettere in coltura cellule umane tumorali derivanti dalla

• cervice uterina, le cosiddette cellule HeLa (nome che deriva dalla paziente da cui

furono estratte tramite biopsia).

- 1952 Montalcini si rese conto che trapiantando un tumore di un topo nel sistema

• nervoso dell’embrione di pollo, il SN cresceva nella direzione del tumore

dimostrando che la crescita e il differenziamento di questo apparato dipende

dall’organo target (che in questo caso è il tumore). Inoltre scopri un peptide il NGF

che è un fattore di crescita coinvolto nella crescita e differenziamento del SN.

- 1952 Dulbecco individuo una proteasi aspecifica (tripsina) per la generazione di

• sottocolture, cioè per staccare cellule dal substrato.

- 1955 Eagle dimostro che per mantenere vitali cellule in coltura era necessaria la

• presenza di siero.

- 1961 Hayflick osservo che le cellule hanno un limite di proliferazione (Hayflick

• limit), dipendente dalla vita media dell’organismo da cui vengono prelevate.

- 1986 vengono isolate cellule staminali da embrione di topo e successivamente

• staminali umane.

- Dagli anni 80 ci sono state grandi scoperte riguardanti meccanismi di regolazione,

• presenza oncogeni, colture cellule staminali e ingegneria tissutale.

Coltura cellulare -> crescita di cellule isolate (singole) dal tessuto di partenza; quindi non

dobbiamo avere aggregati ma bensì cellule singole.

Sono presenti strutture specializzate nella conservazione e propagazione di cellule su

larga scala; sin tratta di linee cellulari provenienti da diverse specie le cui caratteristiche

morfologiche, genetica e di crescita sono ben note. Si possono quindi comprare linee

cellulari (es mioblasti) per poi lavorarci su. Tali linee sono certificate soprattuto dal punto di

vista della non contaminazione + elenco di procedure come metodo di congelamento,

scongelamento ecc..

Possibili applicazioni delle colture cellulari: studi di base (regolazione metabolismo

cellulare), ma anche studi genetici, studi che riguardano le proteine coinvolte

nell’epressione genica o trasudazione del segnale, o studi tossicologici (testare efficcacia

di farmaci e non tossicità del farmaco, o inquinanti ambientali o cosmetici..), studi

immunologici (valutare efficacia ma anche produzione di vaccini); inoltre cellule coltivate

possono essere utilizzate per trapianti tissutali (ingegneria tissutale).

Vantaggi:

- Controllare caratteristiche chimico-fisiche dell’ambiente, avvicinandole il più

• possibile alle

caratteristiche fisiologiche (ph, pressione osmotica, T..)

- Mantenimento dell’omogeneità del campione + si possono fare analisi e

• esperimenti su cellule

umane; inoltre si possono validare studi fatti su animali anche per le cellule umane.

- Abbattimento dei costi: utilizzo di piastre di petri e quindi utilizzo di piccole

• quantità di sostanza

Limiti:

- Operatori devono essere competenti in quanto è richiesta sterilità assoluta; i

• contaminati

crescono molto più velocemente delle cellule di nostro interesse (eucariotiche),

andando a

invalidare il tutto.

- Si osserva un fenotipo relativo a progenitori proliferanti, ovvero ci sono cellule che

• proliferano di

più e di conseguenza saranno le più rappresentate nella coltura; però con

metodologie

possiamo ottenere comunque un differenziamento nella stessa colture.

- In coltura le cellule sono più instabili dal punto di vista genetico, quindi tendono

• maggiormente

a subire mutazioni; ci sono però degli accorgimenti che fanno fronte a ciò.

- Differenze tra cellule in vivo e cellule in vitro: perdita architettura tridimensionale

• della cellula,

mancanza della regolazione di regolazione sistemica (in quanto non c’è SN e S

endocrino), acquisizione di motilità + aumento del numero di cellule in proliferazione

attiva, mancanza di carrier per l’O (emoglobina) e dunque il metabolismo e

principalmente glicolitico.

Coltura primaria è una coltura che deriva direttamente dall’organismo di interesse.

Ci sono 2 tipi di colture:

- D’organo -> coltura in cui non abbiamo cellule singole ma un frammento d’organo.

Avendo un frammento d’organo viene mantenuta parzialmente l’architettura

tridimensionale. Usate in ambito morfologico, differenziamento embrionale e l’effetto di

sostanze sulla funzionalità dell’organo. Si pone il frammento d’organo in un terreno ma

esposto all’aria per rendere possibili scambi gassosi; il limite per le dimensione del

frammento sono dettate dalla diffusione (accesso dei nutrienti dal terreno all’organo e

scambio O/CO2 solo per diffusione), infatti la diffusione è efficace solo entro certe

dimensioni (dimensioni entro 1mm).

Svantaggi: problemi di riproducibilità, in quanto un’area può dare risultati diversi rispetto a

un’area diversa dello stesso organo dovuto a composizione cellulare diversa + durata

limitata nel tempo (Max 1settimana).

- Cellulare -> coltura di cellule isolate dall’organo o dal tessuto dell’organismo di interesse.

Si tratta dunque di cellule singole, ovvero cellule isolate le une dalle altre cosi che in vitro

possano essere coltivate come singole. Una volte poste in coltura, le cellule prolifereranno

fino a occupare tutto il substrato a disposizione; a questo punto si deve fare una

sottocoltura o passaggio. Appena effettuiamo la prima sottocoltura, non si parla più di

coltura primaria ma bensì di linea cellulare.

Le cellule possono crescere in adesione o in sospensione:

quelle in adesione sono cellule che aderiscono al substrato (quindi quasi tutte le tipologie

cellulari), mentre quelle in sospensione crescono in assenza di ancoraggio al substrato,

come le cellule ematopoietiche, tumorali che hanno perso la dipendenza all’ancoraggio o

tumorali ascite.

Cellule ancoraggio dipendenti: per ottenere cellule singole dobbiamo rompere tutti i legami

cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare. Interazione cellula-cellula sono mediate da

proteine: Caderine che presentano porzioni polisaccaridiche negative; 2 caderine si legano

tra loro grazie al Ca + che si lega a ponte tra le due caderine cariche - . Le CAM invece

sono “molecole di adesione Ca indipendenti” che quindi vanno a legare le cellule

indipendentemente dalla presenza di calcio. Caderine e CAM sono molecole di origine

proteica. Interazione Cellula- matrice sono mediate da integrine che sono proteine

transmembrana con dominio extracellulare che si lega a componenti della matrice; in

particolare si lega alla sequenza RGD grazie alla mediazione del Ca. I proteoglicani invece

sono recettori transmembrana che pero non hanno domini di segnalazione intracellulatre,

che si legano a componenti della matrice. Integrine hanno dominio di segnalazione

intracellulare, i proteoglicani no.

Cellule adesione indipendenti: cellule di questo tipo le otteniamo già singole e cosi le

possiamo mettere in un liquido di coltura rimanendo in sospensione o depositandosi sul

fondo ma senza ancorarsi ad alcun substrato. Le colture si possono fare in condizioni

statiche o in agitazione, a seconda del volume in questione. le cellule proliferano fino a

quando ci sono abbastanza nutrienti o eccessiva presenza di sostanze di rifiuto. Per

generare la linea cellulare, si prelevano dalla coltura liquida e le poniamo in un terreno

fresco.

Ricordiamo che la Coltura primaria si ottiene isolando le cellule direttamente dai tessuti

dall’organismo modello: la coltura primaria riflette meglio le attività biochimiche della

cellula in vivo, tuttavia ha una vita limitata e per progetti a lunga scadenza e necessario

prevedere differenti isolamenti. È necessario tenere presente che il tessuto e fatto da tipi

cellulari diversi tenuti insieme dal;la matrice extracellulare. Per ottenere coltura primaria

bisogna dunque rompere i legami cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare al fine di

ottenere cellule singole e procedere poi alla selezione delle cellule necessarie ai fini

sperimentali.

Metodi per ottenere una coltura primaria: Abbiamo già accennato che una coltura primaria

può essere allestita a partire da frammenti (attraverso la tecnica dell’espianto) o per

sospensione cellulare (ottenuta per disgregazione enzimatica o meccanica del tessuto):

- Espianto primario -> si pone in coltura un frammento di tessuto che viene fatto aderire a

un

tessuto di vetro o plastica; l’adesione del tessuto al substrato favorisce la proliferazione

cellulare atte ad ottenere una coltura di cellule separate (coltura primaria).

- Sospensione cellulare -> ci permette di ottenere direttamente in soluzione (sospensione)

cellule omogeneamente disperse che poi vengono fatte aderire al supporto.

A prescindere da quale delle 2 tecniche viene usata per ottenere una coltura primaria, ci

sono passaggi comuni utilizzati per entrambe le tecniche: una coltura primaria se ottenuta

da tessuti solitudine può provenire da organismi di diverso tipo (adulti, embrionali o

gameti).

Dissezione organismo modello per ottenere il tessuto di interesse; deve essere effettuata

in condizioni asettiche (sterilizzare con soluzioni di etanolo al 70% la porzione di

interesse). Una volta ottenuta la porzione di tessuto attraverso un bisturi in condizioni

asettiche (per limitare danno meccanico), viene posta in soluzioni saline bilanciate o in

terreni di coltura sterili che possono contenere antibiotici; gli antibiotici sono altamente

consigliati soprattuto se la provenienza è l’apparato respiratorio, digerente e urinario, cioè

apparati che possono avere contaminazione batterica. Omogenizzazione per

disgregazione enzimatica oppure espianto primario, entrambe per ottenere coltura

primaria.

=> a questo punto abbiamo capito i passaggi comuni alle due pratiche:

- Rimozione tessuto in modo asettico

- Trasferimento immediato in soluzione salita bilanciata/terreno sterile o con antibiotici -

Dissezione area di interesse eliminando zone di necrosi + grasso

- Sminuzzamento fine del tessuto con bisturi.

A) Concentriamoci sull’allestimento della coltura primaria con la tecnica

• dell’espianto primario: frammenti di tessuto vengono fatti aderire a un supporto; in

particolare la tecnica prevede che il tessuto di partenza sia finemente sminuzzato e

seminato in piastre che contengano elevata [ ] di siero che favorisce sia la

sopravvivenza che la migrazione+proliferazione cellulare. Entro qualche gg le

cellule dell’espianto migrano alla periferia dell’espianto e attraverso l’adesione al

substrato iniziano a proliferare (si tratta di una tecnica che l’ottenimento delle cellule

singole preveda la migrazione delle cellule dal tessuto al substrato a cui

aderiscono). Questa tecnica viene usata per piccole quantità di tessuto (es biopsie)

poiché limita al minimo la perdita di vitalità cellulare; gli svantaggi sono costituiti dal

fatto che alcuni tessuti hanno scarsa adesività, quindi tale tecnica seleziona le

cellule in grado di migrare e proliferare. Questa tecnica può essere efficace per

isolamento di fibroblasti, mioblasti, cellule epiteliali e embrionali => in grado di

migrare e proliferare. Dunque questa tecnica è utile per piccole quantità di tessuto e

le cellule selezionate sono in grado di migrare e proliferare, quindi tale tecnica può

essere impiegata solo per tessuti o che hanno queste caratteristiche. Procedura: il

tessuto che è stato selezionato viene posto in soluzione salina bilanciata e

finemente triturato fino ad ottenere frammenti di circa0,5-1mm; i frammenti vengono

poi risospeso in terreno di coltura e seminati in piastra o fiasca. Incubazione per

qualche gg in coltura favorisce che le cellule in grado di migrare migrino dall’interno

del frammento alla piastra (supporto) e siano in grado di proliferare. Esempio:

coltura primaria ottenuta da espianto di carci8noma di topo, vediamo la coltura a

due tempi diversi (dopo 3gg e dopo 7gg); dopo 3 gg iniziano a migrare le cellule

all’esterno e a proliferare. Dopo 7gg in seguito alla rimozione del frammento di

tessuto si riesce a visualizzare la crescita cellulare e l’aumento del n di cellule della

coltura primaria in stadi più avanzati; il numero di cellule ottenuto non è elevato ma

vitali. Si richiede una tempistica elevata dell’ordine di circa 7gg (altro limite della

tecnica).

B) Disgregazione enzimatica/meccanica per ottenere una sospensione cellulare

• (ovvero ottenere cellule singole disperse in sospensione al fine di farle aderire al

supporto). Questi metodi garantiscono una maggiore velocità per ottenere la coltura

primaria + numero maggiore di cellule e più rappresentativo dell’intero tessuto.

Tuttavia questo metodo seleziona i tipi cellulari che sono maggiormente resistenti al

trattamento enzimatico/meccanico.

Enzimatica -> trattamento tramite soluzione contenente enzima digestivo che rompere i

•

legami per ottenere singole cellule in sospensione cellulare; la sospensione, una volta

piastra tra dara origine alla coltura cellulare primaria. Gli enzimi più utilizzati sono tripsina

(proteasi), collagenasi, ialuronidasi, neuraminidasi, pronta si e dispasi (queste ultime 2

sono proteasi di origine batterica) e DNAasi. L’enzima più usato è la tripsina, una

serinaproteasi, che non ha un target (è dunque aspecifica): catalizza il taglio proteolitico

tra i gruppi carbossilici degli AA basici Lys e

Arg, eccetto quando questi sono legati alla Prolina. La tripsina è sintetizzata dal pancreas

come tripsinogeno e viene attivata nell’intestino; ha un Ph basico compreso tra 7.8 e 8.5

anche se in colture cellulari viene usata a ph 7.6 al fine di evitare eccessiva alcalinità alla

coltura cellulare. La tripsina agisce quindi in modo aspecifico su tutte le proteine di

superficie andando ad agire sui legami cellula-cellula e cellula-matrice mediati da proteine

andandoli a scindere favorendo l’ottenimento di una sospensione di cellule singole. La

disgregazione con tripsina è inefficace per tessuti estremamente fibrosi e lesiva per tessuti

più fragili, per cui si possono usare altri enzimi come la collagenasi (proteasi che agisce

specificatamente sul collageno) in tessuti connettivo e muscolare + epiteli e tessuti

tumorali umani (possono essere usate anche le proteasi batteriche pronasi e dispasi).

Ialuronidasi e neuraminidasi invece agiscono sui proteoglicani coinvolti nell’adesione

cellula-matrice extracellulare. Altre molecole usate per ottenere sospensione cellulare in

associazione con enzimi, sono agenti che l’anti del Ca, in particolare EDTA e EGTA

poiché la loro azione rimuove il Ca che è fondamentale nei legami mediati da caderine e

da integrine. EDTA viene usata a una [ ] di max 1 millimolare, mentre le EGTA fino a [ ]

max di 6.5 millimolare. Questi che l’anti del Ca possono essere impiegati da soli o in

associazione a enzimi, in particolare troviamo l’associazione tripsina e EDTA. Inoltre

possono essere usate le DNAasi, enzimi che degradano DNA proveniente dalle cellule

lisate e tenderebbe a favorire l’aggregazione cellulare. La disgregazione enzimatica ha il

vantaggio di produrre un numero elevato di cellule in tempo relativamente breve, e inoltre

le cellule che si ottengono sono più rappresentative del tessuto di partenza poiché la

tripsinizzazione non seleziona i tipi cellulari per migrazione+proliferazione ( come invece fa

il metodo dell’espianto primario). Tuttavia anche questa tecnica porta alla seriazione delle

cellule che sono più resistenti all’azione della tripsina e che sono quindi capaci di aderire

al substrato.

I risultati migliori per quanto riguarda la disgregazione enzimatica vengono ottenuti con

tessuti embrionali sia in termini di vitalità cellulare che in termini di maggiore attività

proliferativa; ciò è dovuto al fatto che i tessuti embrionali hanno un maggiore potenziale

replicativo + sopravvivono meglio agli stress. Infatti all’aumentare dell’età si ottengono un

minor numero vitale di cellule poiché i tessuti adulti hanno una maggiore frazione di cellule

specializzate non replicanti e una più bassa frazione di cellule proliferati ve non

differenziate. Inoltre nei tessuti adulti la matrice extracellulare è più strutturata e quindi

meno facilmente disgregabile rispetto a quella del tessuto embrionale. I tessuti adulti

richiedono dunque una azione più aggressiva per ottenere una disgregazione enzimatica

del tessuto stesso, che porta alla perdita della vitalità delle componenti più fragili. Un

esempio sono i