Appunti di biologia cellulare con laboratorio

Biologia cellulare Alessandro Giramondi

L'oggetto in studio sono cellule eucariotiche di mammifero, in particolare cellule umane, che hanno dimensioni nell'ordine di decine di micrometri e possono essere visualizzate tramite il microscopio ottico. Eccezioni possono essere la cellula uovo che misura circa 150 micrometri, i motoneuroni che possono avere assoni di lunghezza fino a un metro.

Il microscopio ottico e le osservazioni cellulari

Il microscopio ottico ha un potere di risoluzione tale che permette l'osservazione delle cellule eucariotiche umane, si osservano immagini dove i batteri hanno dimensioni al limite della risoluzione del microscopio ottico (1-2 micrometri), i lieviti hanno dimensioni di circa 5 micrometri. Per l'osservazione di organuli cellulari o del batteriofago T4 è necessario ricorrere al microscopio elettronico poiché le dimensioni sono nell'ordine dei nanometri.

Si utilizza un microscopio ottico invertito a contrasto di fase che permette di visualizzare cellule eucariotiche umane vive in un campione di grandi dimensioni come una piastra Petri. Lo spessore in questo caso sarà molto più elevato rispetto a quello di un vetrino, per questo è necessario che la luce provenga dall'alto mentre gli obiettivi si trovano in basso. Mettendo a fuoco le cellule vive si può osservare il campione senza utilizzare colorazioni, il microscopio invertito a contrasto di fase sfrutta il diverso indice di rifrazione del terreno rispetto alle cellule stesse, amplificando questo contrasto e permettendo di visualizzare le cellule vive in coltura.

Sviluppo delle colture cellulari

Alla fine del 1800, Wilhelm Roux introdusse un estratto di cervello di embrione di pollo in una soluzione salina calda per pochi giorni; gli animali a sangue caldo hanno cellule che in coltura devono essere mantenute alla stessa temperatura dell'organismo da cui provengono. La soluzione salina dovrà essere isotonica con la coltura cellulare per evitare danni osmotici alla stessa coltura.

Nel 1907, Harrison fu il primo a compiere esperimenti su colture di cellule animali utilizzando cellule del midollo spinale di rana fatte crescere su un coagulo di linfa, si accorse quindi che le cellule avevano bisogno di altre sostanze oltre alla soluzione salina per permetterne la sopravvivenza a lungo. Non si preoccupò della temperatura in quanto cellule derivanti da un organismo a sangue freddo. Fu Harrison a dimostrare che gli assoni non erano altro che processi derivanti da cellule nervose.

Contributi storici e scoperte

Nel 1909, Rous mise in coltura delle cellule di embrione di pollo anziché di un organo e riuscì a dimostrare che nei polli il sarcoma poteva essere indotto non soltanto trapiantando cellule tumorali ma anche iniettando nel pollo un filtrato delle cellule tumorali. Quindi suggerì che ci poteva essere un agente microscopico che venne in seguito isolato (virus del sarcoma di Rous) e che provocava lo sviluppo del sarcoma nel pollo. Si posero le basi per la teoria virale dei tumori.

Qualche anno dopo, Alexis Carrel mise a punto terreni di coltura dove frammenti di tessuto di 1-2 mm potevano crescere. Affinché il tessuto potesse rimanere vivo era necessario che fosse mantenuto in condizioni di sterilità. Si misero inoltre in pratica condizioni termiche e osmotiche simili a quelle fisiologiche.

Nel 1948, Earle mise in coltura cellule singole di mammifero, in particolare riuscì a mettere in coltura fibroblasti di origine murina e osservò che si potevano formare dei cloni. Nel 1951, Gey mise in coltura cellule umane di origine tumorale, in particolare tumore della cervice uterina, queste sono chiamate cellule HeLa. Si ottenne così un modello con potenzialità molto elevate in quanto si poteva studiare il tumore da cellule umane in vitro, e le cellule sono ancora oggi in commercio e sono oggetto di studio.

Studi e applicazioni delle colture cellulari

Alla metà del Novecento, Levi-Montalcini dimostrò che trapiantando un tumore di topo sul SN dell'embrione di un pollo, il tumore innervava con dei neuroni il sistema nervoso dell'embrione di pollo. Si capì che l'organo target (il tumore del topo) rilasciava il NGF, quindi un peptide che funzionava come attrattore per i neuroni. Negli stessi anni, Dulbecco propose l'utilizzo della tripsina per la generazione di sotto colture, ancora oggi utilizzato.

Sempre negli anni '50, Eagle fece un'indagine sugli elementi essenziali nutritivi per le cellule in coltura, scoprì due elementi fondamentali: il siero (fattori crescita, di sopravvivenza, ecc.) e il mezzo nutritivo. Nel 1961, Hayflick pubblicò un lavoro dove inserendo in coltura fibroblasti umani, nonostante ci fossero tutte le condizioni, dopo un certo numero finito di divisioni questi andavano incontro a senescenza e morte. Questo numero di divisioni è caratteristico per ogni specie ed è proporzionale alla vita media dell'organismo di quella specie, numero chiamato Hayflick limit.

Nel 1986, Martins ed Evans isolarono per la prima volta cellule staminali da embrioni di topo e poco dopo isolarono per la prima volta cellule staminali umane. Questo ha permesso di comprendere alcuni dei meccanismi attraverso i quali si ha la trasformazione di cellule in cellule tumorali, meccanismi molecolari di espressione genica, ecc.

Utilizzo delle colture cellulari

Una coltura cellulare è la crescita di cellule isolate dal tessuto di partenza. Proprio perché le colture cellulari sono molto utilizzate sono state istituite nel tempo collezioni di linee cellulari, in queste strutture le cellule sono propagate e conservate, le cellule saranno vendute ed è garantito che le cellule siano prive di contaminazioni oltre che la disponibilità di precise specie cellulari. Sono inoltre classificate dal punto di vista genetico, morfologico e di crescita. Sono disponibili circa 500 linee cellulari.

Le colture cellulari sono utilizzate per comprendere i meccanismi alla base dell'espressione genetica, del metabolismo, della differenziazione, ecc. Un'altra applicazione importante è nell'immunologia per sviluppare anticorpi, effettuare dei vaccini; in tossicologia permettono di studiare i meccanismi di infezione di virus ad esempio. In farmacologia permettono di capire i meccanismi di azione nelle sostanze xenobiotiche e ci sono applicazioni di ingegneria tissutale.

L'utilizzo di coltura cellulari consente di controllare le caratteristiche ambientali quali pH, pressione osmotica, temperatura, tensione di O₂ e CO₂. Si riesce inoltre ad avere un campione omogeneo, quindi questo ci permette di avere vantaggi dal punto di vista della riproducibilità del dato, inoltre ci permettono di eseguire studi su cellule umane. Ci consentono inoltre di ridurre l'utilizzo di animali come cavie da laboratorio, si riducono anche i costi di studio in quanto la concentrazione delle sostanze utilizzate sarà ridotta ed i tempi saranno più brevi.

Il fatto che la sostanza è a diretto contatto con le cellule può essere un vantaggio o uno svantaggio in quanto mancano le variabili farmacocinetiche. Uno dei limiti principali delle colture cellulari è la necessità della sterilità assoluta, per cui l'operatore deve essere formato adeguatamente, inoltre nella coltura dominano elementi proliferanti; quindi, mettendo in coltura diversi elementi saranno maggiormente rappresentati quelli con un potenziale proliferativo maggiore.

Oggi ci sono metodi di coltura che permettono di avere in vitro tutti i fenotipi differenziati di una certa cellula. Spesso in coltura si va incontro ad instabilità genetica, si perde la regolazione sistemica e la struttura tridimensionale, si può avere l'acquisizione della motilità e il metabolismo è glicolitico anziché ossidativo in quanto manca il carrier dell'O₂ ovvero l'emoglobina. Un altro problema è la difficile correlazione tra le concentrazioni in piastra e l'organismo in vivo in quanto in quest'ultimo caso la sostanza va incontro al metabolismo.

Metodi di coltura cellulare

Per iniziare una coltura ci sono due metodi: la coltura d'organo, quindi la coltura di un frammento di organo isolato dall'organismo modello; e la coltura cellulare primaria, cellule isolate direttamente dai tessuti dell'organismo modello.

La coltura d'organo non è una coltura cellulare, ovvero non si hanno cellule singole, in questo caso dei piccoli frammenti di organo sono messi in coltura, in essa è mantenuta parzialmente l'architettura del tessuto. Da un organismo modello si preleva il tessuto che verrà frammentato da un bisturi, che rende minimo il danno meccanico, e i frammenti sono inseriti in coltura in modo che la struttura tridimensionale sia mantenuta. Il limite principale è che i frammenti di organo hanno una dimensione massima dovuto al fatto che il sistema vascolare non funziona ovviamente, per cui gli scambi di nutrienti e di gas dipendono dalla diffusione, per cui il frammento deve avere dimensioni tali da permettere la diffusione di queste componenti altrimenti si genererà al suo interno una zona necrotica. Le dimensioni massime sono di diametro di circa 1 mm.

Le colture d'organo sono effettuate su particolari substrati dove si ha la possibilità di inserire il frammento di organo all'interfaccia tra il liquido (rosso) e l'aria, ci sono zone azzurre che rappresentano una soluzione salina bilanciata; quindi, isotonica che evaporando mantiene l'ambiente del contenitore umido. Le colture d'organo sono poco utilizzate in quanto si hanno grossi problemi di riproducibilità, prendendo frammenti da organi diversi le porzioni interne dell'organo saranno costituiti da strutture diverse per morfologia o numero, inoltre la durata dei campioni è molto limitata nel tempo. Sono utilizzati essenzialmente per studi di morfologia, differenziamento embrionale o fisiologia, oppure per osservare l'azione di sostanze xenobiotiche o ormoni sull'organo. Il vantaggio delle colture d'organo è proprio il mantenimento dell'architettura tridimensionale del tessuto.

Colture cellulari primarie

Le colture cellulari primarie sono colture di cellule singole, primarie in quanto le cellule derivano direttamente dall'organismo modello. Questo implica che dall'organismo modello si deve prelevare ed isolare le cellule di nostro interesse per ottenere una coltura di cellule isolate, nei tessuti le cellule interagiscono tra loro e con la matrice extracellulare per cui sarà necessario rompere questi legami. Il tessuto può avere origine animale, vegetale o batterica. Una volta che le cellule sono in piastra queste andranno incontro a proliferazione.

In un tessuto ci sono più tipi cellulari che verranno isolati dall'organismo modello, nel tempo le cellule proliferano fino a quando andranno ad occupare completamente lo spazio disponibile nel substrato (ad esempio una piastra Petri). Le cellule vanno incontro all'inibizione da contatto per cui sarà necessario diluire le cellule in modo che possano nuovamente proliferare, questo viene chiamato passaggio o sottocultura (si fanno ad esempio più piastre). La prima volta in cui le cellule vanno incontro al passaggio si parla di linea cellulare.

Nella maggior parte dei casi le cellule all'interno di un tessuto vivono interagendo tra loro e con la matrice extracellulare, se voglio mettere in coltura cellule singole questi legami devono essere rotti (eccezione cellule emopoietiche). Questi legami sono prevalentemente legati da molecole di origine proteica quali caderine e molecole CAM, le caderine sono proteine di membrana che intervengono nei legami cellula-cellula. Queste proteine sono modificate nella porzione extracellulare con residui oligosaccaridici che acquisiscono cariche negative. Quindi in questo caso i legami necessitano di ioni calcio che si inseriscono a ponte tra le caderine di due cellule adiacenti stabilizzando il legame tra le cellule. Le molecole di adesione calcio indipendenti sono anch'esse proteiche che mediano il legame tra due cellule senza calcio.

Per il legame cellula-matrice cellulare abbiamo le integrine, proteine costituite da una subunità alfa ed una beta che hanno un dominio citoplasmatico con funzione di segnalazione e che si lega al citoscheletro mentre sul versante extracellulare legano le proteine della matrice. Anche in questo caso è fondamentale il ruolo degli ioni calcio, inoltre le integrine possono legare il collagene tramite GFOGER in maniera calcio indipendente. I proteoglicani sono molecole proteiche con modificazioni glucidiche che legano proteoglicani, collagene e fattori di crescita della matrice.

Colture in adesione e sospensione

Le cellule possono crescere in adesione o in sospensione, tutte le cellule che derivano da tessuti con legami cellula-cellula o cellula-matrice vivono in adesione, questo vuol dire che le cellule si devono ancorare al substrato per sopravvivere e proliferare. Questa caratteristica si chiama ancoraggio dipendenza. Fanno eccezione le cellule del sistema ematopoietico, del tumore ascite e alcuni tipi di linee cellulari tumorali che perdono la dipendenza dall'ancoraggio.

Quando le cellule crescono in sospensione queste vengono coltivate in contenitori adeguati in modo che siano disperse in modo omogeneo, vivono in un mezzo fluido e sopravvivono senza aderire alla superficie. Generalmente per volumi maggiori di 200 ml le cellule in sospensione vengono coltivate in agitazione. Anche in questo caso il terreno si esaurirà dal punto di vista dei nutrienti e le cellule rilasceranno i prodotti del catabolismo, quindi si faranno sottoculture tramite diluizione.

Procedure per ottenere colture cellulari primarie

Ci sono passaggi comuni a tutti i metodi utilizzati per ottenere una coltura cellulare primaria, generalmente si procede con la disinfezione dell'area di cute da incidere per arrivare all'organo di nostro interesse, si cerca di lavorare in condizioni di sterilità anche se con i tessuti questo non è possibile. Una volta identificato il tessuto di interesse si taglia e si trasferisce in una soluzione salina bilanciata, isotonica con stesso pH del tessuto o in un terreno di coltura, in entrambi i casi sterili e contenente antibiotici. Questo è ancora più importante se preleviamo tessuti che sono normalmente contaminati come la vescica, l'intestino, ecc. Si rimuove dal tessuto i tessuti necrotici e le zone adipose o fibrotiche quindi tutto quello che non rappresenta il modello di nostro interesse. Si procede a sminuzzare finemente con un bisturi affilato per ridurre al minimo il danno meccanico.

A questo punto abbiamo diverse opzioni per ottenere la coltura cellulare primaria. Si può procedere con la tecnica dell'espianto primario nella quale i frammenti sono fatti aderire a un supporto di vetro o di plastica, le cellule singole sono ottenute per migrazione dal tessuto al supporto. In alternativa si può utilizzare la sospensione cellulare, quindi si rompono i legami delle cellule del tessuto tramite enzimi (disgregazione enzimatica) oppure tramite mezzi meccanici (disgregazione meccanica), si ottiene una soluzione dove le cellule sono sospese singolarmente, a questo punto le cellule sono fatte aderire al substrato.

In questa tecnica si sminuzza con un bisturi molto finemente un tessuto, i frammenti sono messi su un supporto (piastra), le cellule singole si ottengono in quanto dall'interno del tessuto le cellule migrano sul supporto in un tempo che varia da qualche giorno a una decina di giorni. Questa tecnica si utilizza ad esempio durante le biopsie, quando si hanno piccoli campioni di cellule; quindi, quando si ha scarsità del materiale. Gli svantaggi sono dovuti al fatto che questo metodo impiega un tempo abbastanza lungo, inoltre non tutti i tipi cellulari sono in grado di migrare e aderire al substrato, quindi si ha una selezione di quelle cellule che sono tipi cellulari con maggiore capacità di migrazione (fibroblasti, mioblasti, cellule embrionali..).

Abbiamo il tessuto in una soluzione salina bilanciata sterile con antibiotici, si ha una dissezione con bisturi in frammenti di circa 1 mm. I frammenti di tessuto sono trasferiti su un supporto, nel tempo le cellule migrano dall'interno del tessuto alla piastra. Per ottenere una coltura cellulare primaria in alternativa si possono preparare sospensioni cellulari tramite disgregazione meccanica o enzimatica. Nel caso della disgregazione enzimatica si utilizzano enzimi digestivi in grado di degradare le molecole coinvolte nei legami tra cellula-cellula e cellula-matrice. Gli enzimi più utilizzati sono la tripsina (proteasi), alcuni enzimi che agiscono sulla matrice (collagenasi, neuraminidasi), sostanze di natura batterica (pronasi, dispasi) o DNAasi.

La tripsina, introdotta da Dulbecco negli anni '50, è una serina proteasi, la rilevanza di questa proteasi sta nel fatto che è aspecifica quindi non ha un target, va a degradare tutte le proteine con legami peptidici che hanno AA basici.