Appunti di biologia cellulare con laboratorio

CELLULE STAMINALI EMBRIONALI

Sono presenti in una fase precisa dello sviluppo embrionale, internamente alla blastocisti, prima che l'embrione si impianti nella mucosa uterina (una settimana dalla fecondazione). In seguito alla rimozione del trofoblasto si è riusciti ad ottenere l'embrioblasto costituito dalle staminali embrionali, queste cellule opportunamente coltivate possono essere mantenute per un tempo illimitato e possono essere indirizzate tramite il differenziamento nei diversi tipi cellulari (cambiando le condizioni di coltura).

Le cellule staminali embrionali sono state inizialmente isolate da una blastocisti di topo; Evans e Kaufman pubblicarono su Nature l'isolamento di queste cellule staminali embrionali che in vitro potevano essere mantenute per un tempo illimitato ma era anche possibile ottenere tutti i tipi cellulari derivanti dai tre foglietti embrionali. Per convincere la comunità scientifica si è dovuto dimostrare la pluripotenza di queste cellule.

per cui nel loro lavoro procedono con diversi saggi, confermando che le cellule che manipolavano erano realmente staminali embrionali murine.

Essenzialmente sono tre test:

1. test di differenziamento, per cui le cellule che crescono sul feeder layer, cambiando le condizioni di coltura e stimolandole possono generare progenitori che poi maturano in cellule derivanti dai tre foglietti embrionali, ottenendo un tipo cellulare per ciascun foglietto embrionale, si dimostrò i tre possibili destini della staminale;
2. test di formazione di chimere, prevede l'iniezione delle cellule di cui voglio testare la pluripotenza, nel blastocele di una blastocisti ospite, per cui queste sosterranno lo sviluppo di quell'embrione. Se quelle cellule sono pluripotenti allora si dovranno formare tutti i tessuti dell'individui che si sviluppa da quella blastocisti, nell'individuo dovrò ritrovare in tutti i tessuti una situazione chimerica (cellule proprie della blastocisti e cellule

di cui voglio testare la pluripotenza). Se trovo il modo di marcare le cellule da testare le posso ritrovare con facilità nei tessuti dell'organismo sviluppato, se non si ritrovano le cellule allora non saranno staminali pluripotenti; - test di formazione di teratomi, i teratomi sono tumori dei tessuti embrionali, si deve considerare la tumorigenicità delle cellule embrionali, se formano tumori sono pluripotenti in quanto le cellule staminali tissutali non sono tumorigeniche. Le cellule pluripotenti sono iniettate sottocute in un topo immunodepresso (skid), questi riceveranno un numero elevato di segnali che portano allo sviluppo di un teratoma, in questo contesto questa è la prova della loro potenza, i teratomi sono formati da cellule derivanti da tutti e tre i tessuti embrionali. Si devono quindi conoscere molto bene queste cellule per poterle poi utilizzare a livello medico, si deve tenere conto della tumorigenicità. Le cellule staminali embrionali, dopo rimozione del

strato cellulare della blastocisti, si isolano e si pongono in coltura, in specifiche condizioni si possono differenziare popolazioni cellulari che appartengono a ciascuno dei tre foglietti germinativi. Le condizioni di coltura cambiano se voglio mantenere indifferenziate o se le voglio far differenziare. Le ESC per essere mantenute indifferenziate devono esprimere alti livelli di fattori trascrizionali (Oct4 e Nanog), devono essere coltivate su un feeder layer e deve essere aggiunto al terreno LIF che è una citochina.

Quindi nell'81 si scoprono le staminali embrionali e nel 1998 Thomson comunica di essere riuscito ad isolare cellule staminali embrionali da una blastocisti umana. La pubblicazione di questi dati alzò un gran polverone dal punto di vista etico, la blastocisti umana fu ottenuta da una fecondazione artificiale, in vitro, che in seguito allo sviluppo embrionale viene inserita nella donna per poi continuare in utero. Prima di questo la donna esegue una stimolazione.

ormonale che porta allo sviluppo di più ovociti che vengono fecondati in piastra, una volta che lo zigote si sviluppa per circa un paio di giorni in seguito gli embrioni vengono impiantati nell'utero. Nel caso che la fecondazione porti alla formazione di più embrioni questi non vengono tutti impiantati, ma vengono congelati, se l'impianto va a buon fine questi rimangono in "eccesso" per cui ho queste blastocisti sovrannumerarie, avanzate dalle tecniche di fecondazione artificiale.

Thomson utilizzò queste blastocisti da cui ricavò le staminali embrionali che hanno espressi geni caratterizzanti la pluripotenza, con il test di differenziamento queste cellule potevano sostenere il differenziamento di almeno tre tipi cellulari derivanti dai foglietti embrionali, permettevano anche lo sviluppo di teratomi. Nel corso degli ultimi anni ci sono stati molti studi, in modelli animali, che dimostrano azioni promettenti nei confronti di malattie ad oggi incurabili.

Ci sono anche trial clinici per il loro utilizzo nella cura alla degenerazione maculare che porta alla perdita della vista con l'età. In vitro le cellule devono essere indirizzate ad alta efficienza verso la differenziazione in un tipo cellulare che deve essere in grado di funzionare nel tessuto malato, nel caso delle Esc ci si deve assicurare che il trattamento sia sicuro per l'insorgenza di patologie neoplastiche. Qualora si riuscisse ad utilizzare le cellule staminali embrionali umane, si renderebbero comunque necessarie terapie con immunosoppressori in quanto il sistema immunitario riconoscerebbe come not-self le cellule iniettate. Si potrebbe anche pensare di associare la terapia embrionale con la terapia genica. Con le cellule ASC, asserendo che queste staminali tissutali si ritrovano virtualmente in tutti i tessuti, si supera quella classificazione che divideva i tessuti in labili, stabili e perenni. È vero che il tessuto striato scheletrico è costituito da elementi.

perenni (che non si differenziano più e permangono in quel tessuto per un tempo molto lungo), un danno che danneggia quell'elemento prevede che gli elementi post mitotici possano riparare il danno. Il fatto che anche in questo caso ci sia un compartimento di cellule staminali, molto rare, che entrano in gioco per sostenere la vita dei progenitori fa in modo che venga meno la definizione di elemento perenne in quanto in grado di rigenerarsi. La presenza di queste cellule staminali è stata riconosciuta nei tessuti labili, ma a livello muscolare e del tessuto nervoso sono state scoperte cellule staminali in grado di sostenere lo sviluppo di nuovi neuroni ad esempio.

Anche la cellula staminale ASC è dotata di potenza differenziativa e self renewal, ristretta rispetto alle embrionali, che sostiene la generazione di un gran numero di discendenti che si differenzieranno nelle cellule del tessuto in cui risiedono. La cellula staminale genera una cellula figlia staminale, per il mantenimento del

Serbatoio staminale del tessuto, e genera anche un progenitore che non è più staminale ma è comunque in grado di proliferare per un periodo limitato. Questo fa in modo che dal progenitore si generino molte cellule che poi si differenziano nel tipo cellulare di quel tessuto, permettendo un'amplificazione della generazione di cellule preservando la staminale da un numero di divisioni elevato, per cui con questo processo riduce al minimo la possibilità di mutazioni nelle staminali. La funzione principale delle ASC è il mantenimento dell'omeostasi tissutale, questo serbatoio si mantiene tale per tutta la durata della vita di un individuo e permette la sostituzione degli elementi usurati o danneggiati di un determinato tessuto. Il microambiente, quindi la nicchia staminale, di un individuo influenza il comportamento delle cellule staminali adulte; la qualità della nicchia staminale permette di avere diversi tipi di segnali. Conoscere la nicchia

staminale è parte integrante dello studio delle cellule staminali e per potenziare le risposte rigenerative.

Le cellule staminali adulte sono presenti in tutti i distretti tessutali, anche in quelli costituiti da cellule post mitotiche, che terminalmente differenziate non possono più proliferare.

Si ha la caratterizzazione dei marcatori di una cellula staminale adulta, per cui queste devono rispondere a delle caratteristiche che rendano fattile i loro isolamento, devono rendere possibile la loro espansione (nel loro microambiente le cellule ricevevano moltissimi stimoli), quindi in piastra devo essere sicuro che le cellule amplificate siano analoghe alle cellule inizialmente isolate.

Le staminali adulte non sono tumori geniche ma in un'ottica di efficienza della terapia staminale devo essere in grado di amplificare senza snaturare la cellula, devo essere poi in grado di trapiantare queste cellule (il tessuto muscolare è molto esteso, devo trovare un modo di fare arrivare le cellule.

mediante circolazione sanguigna, nei vari distretti muscolari) ed in ultimo le cellule devono funzionare e curare il distretto malato. Le cellule staminali adulte sono presenti sia nei tessuti con un rapido ricambio fisiologico, come gli epiteli, ma anche in quei tessuti composti da elementi considerati perenni. Risale agli anni 90 la caratterizzazione delle cellule staminali neurali, nella regione dell'ippocampo sono in grado di dividersi e quindi sostengono la produzione di un numero limitato di neuroni. Queste cellule staminali sono rare e sono poco proliferanti, tendono a far proliferare molto i progenitori allo scopo di ridurre il rischio di mutazioni durante il normale meccanismo di duplicazione del DNA. Così come le staminali embrionali, anche le staminali adulte sono in grado in coltura di automantenersi e di dividersi in modo simmetrico o asimmetrico in base alle necessità della popolazione cellulare. Si può quindi avere un'espansione del compartimento staminale.nel casodi un depauperamento o viceversa una divisione simmetrica che porta allo sviluppo di due celluledifferenziate.In condizioni di equilibrio la divisione è asimmetrica, in base ai meccanismi che possonomantenere questo equilibrio 50:50 esistono: il meccanismo per asimmetria ambientale e perasimmetria divisionale. Secondo l'asimmetria divisionale, le due cellule figlie sonogià intrinsecamente diverse, una è la cellula staminale(tratto rosso) mentre l'altra è il progenitore che poi andràincontro a differenziamento terminale, per cui secondoquesto modello la divisione asimmetrica genera unaasimmetria interna in base alla quale le cellule figlie sonodotate di determinanti diversi già al momento della nascita.Nella asimmetria ambientale la cellula staminale mad