Biologia animale 5

Citoscheletro

Strutturato in una rete complessa di filamenti e tubuli proteici interconnessi che si estendono nel citosol, dal nucleo alla faccia interna della membrana plasmatica. Struttura dinamica in grado di riorganizzarsi velocemente per svolgere diverse funzioni:

• Determina la forma della cellula, struttura e supporto,
• Trasporto intracellulare come quello delle vescicole,
• Contrattilità e motilità,
• Trasmissione nervosa,
• Organizzazione spaziale del citoplasma,
• Nella cellula in divisione è coinvolto nella suddivisione del citoplasma e del corredo cromosomico.

Componenti

• Microtubuli 25 nm (lunghi cilindri cavi di proteina tubulina, sono i più rigidi, un'estremità è legata a un unico centro di organizzatore di microtubuli)
• Filamenti intermedi 10 nm (fibre simili a corde, alcuni formano la lamina nucleare, altri si estendono nel citoplasma irrobustendo le cellule e distribuendo le sollecitazioni meccaniche cui va incontro il tessuto epiteliale, a questo scopo forma giunzioni cellulari)
• Filamenti sottili/di actina 8 nm (struttura flessibile in fasci lineari, reti bidimensionali, gel tridimensionali, si concentrano principalmente nel cortex, subito al di sotto della membrana plasmatica)

Microtubuli

Componenti di maggiori dimensioni, sono cilindri cavi con diametro esterno di 25 nm, interno 15 nm. Hanno parete spessa circa 10 nm. Lunghezza variabile 20-60 nm. Sono distribuiti in tutte le cellule. La loro parete è costituita da unità sferiche ordinate di tubulina, un eterodimero formato da due subunità di sequenza amminoacidica simile in grado di legare GTP (nel terzo dominio ammino-terminale) chiamate tubulina-alfa e tubulina-beta.

Gli eterodimeri ab di tubulina polimerizzano a formare protofilamenti molto instabili e quindi assemblati in 13 a formare il microtubulo. All'interno del microtubulo i dimeri di tubulina sono orientati nella stessa direzione, in modo che tutte le subunità di tubulina-a sono rivolte verso la stessa estremità. Questo orientamento uniforme dei dimeri di tubulina comporta che le due estremità del protofilamento siano diverse dando origine a una polarità intrinseca nel protofilamento e quindi del microtubulo. La polarità intrinseca non si basa su cariche elettriche ma sul fatto che le due estremità sono diverse chimicamente. Ogni microtubulo ha un'estremità + che coincide con la tubulina-B e una – che coincide con la tubulina-a.

Formazione dei microtubuli

La formazione dei microtubuli avviene in un'area denominata MTOC o centro organizzatore dei microtubuli che serve come punto di ancoraggio e di crescita. La porzione negativa del microtubulo è collegata con il MTOC. Nell'interfase il MTOC prende il nome di centrosoma ed è associato a due centrioli circondati da materiale granulare diffuso detto materiale pericentriolare. (Aspetto importante: durante il processo di duplicazione cellulare il centrosoma come i due centrioli vanno in contro a una divisione e i due centrosomi migrano agli estremi della cellula.)

Le pareti dei centrioli sono costituite da 9 triplette di microtubuli, orientati ad angolo retto. Il materiale pericentriolare PCM presenta due proteine:

• Tubulina gamma: conformazione ad anello alla base del microtubulo nascente e serve da stampo alla nucleazione.
• Pericentrina: funge da collante tra gamma tubulina e microtubulo.

Gli MTOC influenzano anche il numero di microtubuli presenti nella cellula in quanto essi possiedono un numero limitato di siti di nucleazione e ancoraggio. I centrosomi associati al fuso mitotico hanno attività di nucleazione massima durante la profase e la metafase. La loro importanza è stata dimostrata al fatto che la loro eliminazione impedisce la nucleazione.

Nucleazione dei microtubuli

Una tappa critica nella formazione dei microtubuli è la nucleazione, cioè l'aggiunta di dimeri di tubulina in gruppi detti oligomeri che servono da "nuclei" da cui i nuovi microtubuli possono crescere. È la fase più lenta definita fase di ritardo. Quando un microtubulo è stato nucleato, cresce per aggiunta di dimeri di tubulina a un'estremità, fase di allungamento, veloce. La massa dei microtubuli aumenta fino a che la concentrazione di tubulina libera diventa limitante, questo conduce alla fase di stabilizzazione (plateau) in cui l'assemblaggio e il disassemblaggio si bilanciano.

Ogni microtubulo segue continui cicli di polimerizzazione e depolarizzazione regolati da un equilibrio dinamico. Studi in vitro hanno messo in vista come dimeri di tubulina si assemblano in modo spontaneo e come la crescita dipenda dalla loro concentrazione. Quando la concentrazione dei dimeri di tubulina raggiunge la concentrazione critica la crescita bilancia la disgregazione quindi siamo nella fase di plateau. Cresce se [T] libera > di quella critica, depolimerizzano se [T] libera < di quella critica.

Cinetica di assemblaggio in vitro

Le due estremità hanno due velocità di crescita diversa riflettendo le diverse richieste di concentrazione di tubulina critica per l'assemblaggio: è più veloce all'estremità + che presenta concentrazione critica più bassa (bastano meno eterodimeri per l'allungamento). All'estremità – è lenta e la concentrazione critica è più elevata, la tubulina deve essere più concentrata affinché l'allungamento avvenga anche da questa estremità.

Quando la concentrazione di tubulina libera è più alta di quella critica all'estremità + ma più bassa della concentrazione critica all'estremità –, i microtubuli vengono aggiunti all'estremità + che cresce ma vengono tolti all'estremità –. Processo detto treadmilling che si verifica quando una data molecola di tubulina incorporata all'estremità + si sposta progressivamente lungo il microtubulo in crescita e si stacca all'estremità opposta.

Fattori che influenzano la dinamicità dei microtubuli

• Concentrazione di tubulina libera: maggiore è la concentrazione di tubulina libera, maggiore sarà la polimerizzazione (più veloce all'estremità positiva in funzione della concentrazione critica).
• Idrolisi del GTP legato alla B-tubulina: l'idrolisi del GTP a GDP+P destabilizza la tubulina e si ha depolimerizzazione.

Ogni eterodimero lega due GTP. Il GTP legato alla subunità Beta è idrolizzato a GDP solo quando l'eterodimero si associa a un microtubulo. Il microtubulo cresce con l'aggiunta di eterodimeri di cui la subunità B lega un GTP. Il microtubulo si accorcia perdendo eterodimeri legati a GDP (il GTP ha subito idrolisi nel momento in cui il dimero si è legato al microtubulo). La presenza di GDP però destabilizza il microtubulo, l'associazione di eterodimeri di tubulina legati al GDP è troppo debole.

Si è visto che le molecole che legano GTP proteggono i microtubuli prevenendo il distacco delle subunità dall'estremità positiva; la presenza di un gruppo di tubuline associate a GTP all'estremità positiva crea un cappuccio di GTP a cui si possono associare stabilmente altri dimeri. La concentrazione di tubulina-GTP è fondamentale per l'instaurarsi di un equilibrio dinamico. Il microtubulo cresce se la velocità delle tubuline-GTP dipendente dalla loro concentrazione che si aggiungono al microtubulo è maggiore della velocità di idrolisi del GTP incorporato, così da permettere la formazione del cappuccio. Se la concentrazione di tubuline-GTP scende sotto una soglia limite, la velocità di aggiunta diminuisce oltrepassando la velocità di idrolisi della GTP a una delle due estremità, si ha lo sfaldamento del cappuccio di GTP.

Quando il cappuccio scompare i microtubuli diventano instabili e viene favorita la perdita di dimeri associati a GDP. Evidenze sperimentali mostrano che un microtubulo alterna fasi di crescita e di contrazione e quando inizia a contrarsi, nella fase di collasso può scomparire completamente o può improvvisamente riprendere a crescere, in una fase di ripresa. La frequenza del collasso è inversamente proporzionale alla concentrazione di tubulina libera. Qualunque sia la concentrazione di tubulina il collasso è più probabile all'estremità positiva del microtubulo. In sostanza l'instabilità dinamica del microtubulo è più evidente all'estremità positiva.

Proteine associate ai microtubuli

I microtubuli sono finemente organizzati all'interno della cellula grazie all'esistenza di un gran numero di proteine non motrici che controllano la struttura, l'assemblaggio e le funzioni dei microtubuli. Le proteine associate ai microtubuli sono dette MAP. Le MAP si legano a intervalli regolari lungo la parete dei microtubuli permettendo l'interazione con altri filamenti e strutture cellulari.

Movimento intracellulare basato su microtubuli

Le proteine motrici utilizzano i microtubuli come vie di trasporto di vescicole e organelli: chinesine percorre il microtubulo verso l'estremità +, verso l'esterno; dineine verso il –, verso il nucleo. Prendono energia dall'idrolisi di ATP e GTP. Sono costituite da due teste motrici globulari che si legano ai microtubuli e sono coinvolte nell'idrolisi di ATP, una coda avvolta a elica e una catena leggera che trasporta un carico. Una delle due teste globulari si sposta in avanti e stabilisce un legame con una nuova subunità di B-tubulina, seguito dal distacco della testa globulare arretrata che può formare un nuovo legame con una regione più avanzata del microtubulo. Chinesine e dineine trasportano le vescicole sinaptiche: le prime si occupano del trasporto centrifugo delle vescicole sinaptiche verso il terminale assonico +, le dineine si occupano del trasporto centripeto verso il corpo cellulare –.

Motilità basato su ciglia e flagelli

I microtubuli sono cruciali anche per il movimento delle appendici mobili di cellule eucarioti come ciglia e flagelli. Ciglia e flagelli condividono una base strutturale simile ma differiscono per la lunghezza, nel numero per cellula e nella modalità di battito.

Ciglia: strutture contrattili usate dalla cellula per spostarsi o per spostare qualcosa come il muco. Sono tipiche dell'epitelio respiratorio. Si presentano numerose sulle superfici ciliate, hanno battito a remo coordinato.

Flagelli: muovono le cellule in ambiente fluido. Sono più lunghi delle ciglia e sono limitati a 1 o pochi per cellula. Differiscono poi dalle ciglia per la natura del loro battito a gomito. Presentano una struttura microtubulare chiamato assonema, connesso a un corpo basale, il tutto circondato da un'estensione di membrana plasmatica, è quindi una struttura intracellulare. Tra assonema e corpo basale c'è una zona di transizione in cui la disposizione dei microtubuli del corpo basale si converte in quella tipica dell'assonema. Struttura dell'assonema con disposizione 9 + 2: 9 doppiette periferiche e una coppia centrale. Le 9 doppiette sono costituite da un tubulo A completo a 13 protofilamenti e un tubulo B incompleto a 11 protofilamenti, mentre la coppia interna è costituita da tubuli A completi.

Sostanze che bloccano la mitosi agendo sul citoscheletro sono utilizzate per la cura del cancro:

• Colchina, colcemide, vincristina, vinblastina: si legano alla tubulina e impediscono la polimerizzazione della tubulina impedendo la mitosi.
• Taxolo: stabilizza i microtubuli bloccando la mitosi.

Filamenti intermedi (IF)

Hanno diametro 8-12 nm. I filamenti intermedi in ogni tipo cellulare sono formati da polimeri di proteine diverse, ma tutte simili per dimensioni e struttura. Organizzati in fasci proteici di elevate resistenza meccanica in quanto hanno ruolo di struttura, di sostegno della tensione cellulare, aiutano l'adesione cellula-cellula. Sono le strutture più stabili e meno solubili del citoscheletro. Divisi in: Citoplasmatici (cheratine negli epiteli, vimentina nel tessuto connettivo, neurofilamenti nelle cellule nervose) e nucleari (nelle lamine nucleari). Tutte le proteine sono fibrose.

Struttura: Monomeri polipeptidici lineari lunghi mediamente 48 nm, dotati di una testa amminoterminale, un dominio a bacchetta ad α elica e una coda carbossiditerminale. Il dominio centrale è un polipeptide piuttosto conservato in tutte le proteine della classe, formato da una sequenza di sette amminoacidi ripetuta per tutta la regione che costituiscono 4 regioni a elica inframezzate da 3 corti segmenti di connessione. I due terminali sono globulari. I monomeri si polimerizzano in dimero coiled-coil paralleli, allineati. Essi si associano lateralmente in modo antiparallelo e sfalsato in tetrameri, la subunità stabile dei filamenti intermedi; tale accoppiamento fa sì che il tetramero termini con due domini amminici, rendendo il polipeptide non polare. I tetrameri liberi si compattano, quindi si allineano ed affiancano con disposizione a elica in un filamento cavo: 2 tetrameri formano un protofilamento, da 8 protofilamenti connessi coda-coda formano un filamento intermedio. L'assemblamento avviene spontaneamente nell'ambiente citoplasmatico, ma può essere regolato da vari fattori. Il più importante è la fosforilazione di residui di serina degli amminoterminali, il quale provoca disassemblaggio.

Microfilamenti (MF)

Con diametro 7 nm sono le strutture citoscheletriche più sottili del citoscheletro. Principalmente conosciuti per l'azione contrattile nelle cellule muscolari dei microfilamenti di actina che interagiscono con filamenti più spessi di miosina. I microfilamenti sono coinvolti poi nella migrazione cellulare tramite lamellopodi e filopodi, supporto strutturale. Il costituente proteico fondamentale dei microfilamenti è l'actina le cui singole molecole si chiamano actina G, globulare. Una volta sintetizzata si organizza in una struttura a U con una cavità centrale che lega ATP o ADP. In condizioni adeguate le molecole di actina G polimerizzano a formare i microfilamenti e sotto questa forma l'actina è chiamata actina F, filamentosa. Ogni filamento è costituito da due protofilamenti che si avvolgono. Tutte le subunità hanno lo stesso orientamento.

Polimerizzazione dell'actina

Ogni monomero di actina (actina globulare, [G]) ha siti di legame forti che mediano le interazioni testa-coda con due altri monomeri. Perciò i monomeri di actina polimerizzano formando filamenti (actina filamentosa [F]). Poiché tutti i monomeri di actina sono orientati nella stessa direzione, i filamenti di actina hanno una polarità distinta nelle loro estremità: Estremità barbigli o sfrangiata ("barbed"), estremità più (+) polimerizza velocemente; Estremità appuntita ("pointed"), estremità meno (-) polimerizza lentamente. La diversa velocità di allungamento riflette in una differenza nella concentrazione critica per l'aggiunta di monomeri.

L'actina legata a ATP si associa con estremità a barbigli che si accresce rapidamente ed è poi idrolizzata ad ADP. Dato che ADP-actina si dissocia dal filamento più velocemente di ATP-actina. La concentrazione critica dei monomeri di actina è più alta per l'aggiunta alla terminazione appuntita rispetto a quella a barbigli. Un equilibrio viene raggiunto alla concentrazione di monomeri intermedia tra le due concentrazioni critiche. I filamenti di actina vanno incontro a continui rimaneggiamenti e cicli di polimerizzazione e depolimerizzazione. Actina globulare = 375 aa con associata una molecola di ATP. La polimerizzazione dell'actina richiede Mg²⁺, K⁺ ed ATP. Si ha una fase di latenza, in cui si nucleano nuovi filamenti e poi una fase di polimerizzazione rapida, in cui si allungano i filamenti. Dopo la polimerizzazione, l'ATP si idrolizza ad ADP, che resta intrappolato nel polimero. L'estremità con ADP depolimerizza più rapidamente. Si parla anche qui di treadmilling.

Filamenti di actina e comportamento cellulare

• Polarizzazione della cellula
• Protrusione della membrana plasmatica
• Adesione cellulare
• Segnali esterni possono direzionare la migrazione cellulare

Le cellule controllano spazialmente il processo di polimerizzazione dell'actina. A questo scopo le cellule usano proteine associate all'actina non motrici e il controllo avviene a livelli diversi della polimerizzazione, ci sono proteine che legano i monomeri.