Biologia animale 5

CITOSCHELETRO

Strutturato in una rete complessa di filamenti e tubuli proteici interconnessi che si estende

nel citosol, dal nucleo alla faccia interna della membrana plasmatica.

Struttura dinamica in grado di riorganizzarsi velocemente per svolgere diverse funzioni:

-determina la forma della cellula, struttura e supporto,

-trasporto intracellulare come quello delle vescicole,

-contrattilità e motilità

-trasmissione nervosa

-organizzazione spaziale del citoplasma

-nella cellula in divisione è coinvolto nella suddivisione del citoplasma e del corredo cromosomico

Componenti:

-microtubuli 25nm (lunghi cilindri cavi di proteina tubulina, sono i più rigidi, un’estremità è legata

a un unico centro di organizzatore di microtubuli)

-filamenti intermedi 10nm (fibre simili a corde, alcuni formano la lamina nucleare, altri si

estendono nel citoplasma irrobustendo le cellule e distribuendo le sollecitazioni meccaniche cui

va incontro il tessuto epiteliale, a questo scopo forma giunzioni cellulari)

-filamenti sottili/di actina 8nm (struttura flessibile in fasci lineari, reti bidimensionali, gel

tridimensionali, si concentrano principalmente nel cortex, subito al di sotto della membrana

plasmatica) MICROTUBULI

Componenti di maggiori dimensioni, sono cilindri cavi con

dimetro esterno di 25nm, interno 15nm Hanno parete spessa

circa 10 nm. Lunghezza variabile 20-60nm. Sono distribuiti

in tutte le cellule. La loro parete è costituita da unità

sferiche ordinate di TUBULINA, un eterodimero formato

da due subunità di sequenza amminoacidica simile in grado di

legare GTP (nel terzo dominio ammino-terminale) chiamate

TUBULINA-ALFA e TUBULINA-BETA.

Gli eterodimeri ab di tubulina polimerizzano a formare

PROTOFILAMENTI molto instabili e quindi assemblati in 13

a formare IL MICROTUBULO. All’interno del microtubulo i

dimeri di tubulina sono orientati nella stessa direzione, in

modo che tutte le subunità di tubulina-a sono rivolte verso

la sessa estremità. Questo orientamento uniforme dei

dimeri di tubulina comporta che le due estremità del

protofilamento siano diverse dando origine a una polarità

intrinseca nel protofilamento e quindi del microtubulo. La

polarità intrinseca non si basa su cariche elettriche ma sul fatto che le due estremità sono

diverse chimicamente. Ogni microtubulo ha un’estremità + che coincide con la tubulina-B e una

– che coincide con la tubulina-a. 104

FORMAZIONE DEI MICROTUBULI:

La formazione dei microtubuli avviene in un’area denominata

MTOC o centro organizzatore dei microtubuli che serve come

punto di ancoraggio e di crescita. La porzione negativa del

microtubulo è collegata con il MTOC. Nell’interfase il MTOC

prende il nome di CENTROSOMA ed è associato a due

CENTRIOLI circondati da materiale granulare diffuso detto

materiale pericentriolare. (Aspetto importante: durante il

processo di duplicazione cellulare il centrosoma come i due

centrioli vanno in contro a una divisione e i due centro somi migrano agli estremi della

cellula.) Le pareti dei centrioli sono costituite da 9 triplette di microtubuli, orientati ad angolo

retto. Il materiale pericentriolare PCM presenta due proteine:

-TUBULINA GAMMA: conformazione ad anello alla base del microtubulo nascente e serve da

stampo alla nucleazione.

-PERICENTRINA: funge da collante tra gamma tubulina e microtubulo.

Gli MTOC influenzano anche il numero di microtubuli presenti nella cellula in quanto essi

possiedono un numero limitato di siti di nucleazione e ancoraggio. I centrosomi associati al fuso

mitotico hanno attività di nucleazione massima durante la profase e la metafase. La loro

importanza è stata dimostrata al fatto che la loro eliminazione impedisce la nucleazione.

Una tappa critica nella formazione dei microtubuli è la NUCLEAZIONE cioè l’aggiunta di dimeri

di tubulina in gruppi detti OLIGOMERI che servono da “nuclei” da cui i nuovi microtubuli possono

crescere. È la fase più lenta definita fase di ritardo.

Quando un microtubulo è stato nucleato, cresce per aggiunta di dimeri di tubulina a

un’estremità, FASE DI ALLUNGAMENTO, veloce. La massa dei microtubuli aumenta fino a che

la concentrazione di tubulina libera diventa limitante, questo conduce alla FASE DI

STABILIZZAZIONE (plateau)

in cui l’assemblaggio e il

disassemblaggio si bilanciano.

Ogni microtubulo segue continui

cicli di polimerizzazione e

depolarizzazione regolati da un

equilibrio dinamico. Studi in

vitro hanno messo in vista come dimeri di tubulina si assemblano in modo

spontaneo e come la crescita dipenda dalla

loro concentrazione. Quando la

concentrazione dei dimeri di tubulina raggiuge

la CONCENTRAZIONE CRITICA la crescita

bilancia la disgregazione quindi siamo nella

fase di plateau.

Cresce se [T] libera > di quella critica

Depolimerizzano se [T]libera< di quella critica

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Cinetica di assemblaggio in vitro.

Le due estremità hanno due velocità di crescita diversa riflettendo le diverse richieste di

concentrazione di tubulina critica per l’assemblaggio: è più veloce all’estremità + che presenta

concentrazione critica più bassa (bastano meno eterodimeri per l’allungamento).

All’estremità – è lenta e la concentrazione critica è più elevata, la tubulina deve essere più

concentrata affinché l’allungamento avvenga anche da questa estremità.

Quando la concentrazione di tubulina libera è più

 alta di quella critica all’estremità + ma più bassa

della concentrazione critica all’ estremità -, i

microtubuli vengono aggiunti all’estremità + che

cresce ma vengono tolti all’estremità -.

Processo detto: TREADMILLING che si verifica

quando una data molecola di tubulina incorporata

all’estremità + si sposta progressivamente lungo il

microtubulo in crescita e si stacca all’estremità

opposta.

FATTORI CHE INFLUENZANO LA DINAMICITA’ DEI MICROTUBULI:

- Concentrazione di tubulina libera: maggiore è la concentrazione di tubulina libera, maggiore

sarà la polimerizzazione (più veloce all’estremità positiva in funzione della concentrazione

critica)

- Idrolisi del GTP legato alla B-tubulina: l’idrolisi del GTP a GDP+P destabilizza la tubulina e

si ha depolimerizzazione.

Ogni eterodimero lega due GTP. Il GTP legato alla subunità Beta è idrolizzato a GDP solo quando

l’eterodimero si associa a un microtubulo. Il microtubulo cresce

con l’aggiunta di eterodimeri di cui la subunità B lega un GTP. Il

microtubulo si accorcia perdendo eterodimeri legati a GDP (il GTP

ha subito idrolisi nel momento in cui il dimero si è legato al

microtubulo). La presenza di GDP però destabilizza il

microtubulo, l’associazione di eterodimeri di tubulina legati al GDP

è troppo debole.

Si è visto che le molecole che legano GTP proteggono i microtubuli

prevenendo il distacco delle subunità dall’estremità positiva; la

presenza di un gruppo di tubuline associate a GTP all’estremità

positiva crea un CAPPUCCIO DI GTP a cui si possono associare

stabilmente altri dimeri. La concentrazione di tubulina-GTP è

fondamentale per l’instaurarsi di un equilibrio dinamico.

Il microtubulo cresce se la velocità delle tubuline-GTP dipendente

dalla loro concentrazione che si aggiungono al microtubulo è

maggiore della velocità di idrolisi del GTP incorporato, così da

permettere la formazione del cappuccio. Se la concentrazione di

tubuline-GTP scende sotto una soglia limite, la velocità di aggiunta

diminuisce oltrepassando la velocità di idrolisi della GTP a una

delle due estremità, si ha lo sfaldamento del cappuccio di GTP. 106

Quando il cappuccio scompare i microtubuli diventano instabili e viene favorita la perdita di

dimeri associati a GDP. Evidenza sperimentali mostrano che un microtubulo alterna fasi di

crescita e di contrazione e quando inizia a contrarsi, nella fase di COLLASSO può scomparire

completamente o può improvvisamente riprendere a crescere, in una fase di RIPRESA. La

frequenza del collasso è inversamente proporzionale alla concentrazione di tubulina libera.

Qualunque sia la concentrazione di tubulina il collasso è più probabile all’estremità positiva del

microtubulo. In sostanza l’instabilità dinamica del microtubulo è più evidente all’estremità

positiva.

PROTEINE ASSOCIATE AI MICROTUBULI

I microtubuli sono finemente organizzati all’interno della cellula grazie all’esistenza di un gran

numero di proteine non motrici che controllano la struttura, l’assemblaggio e le funzioni dei

microtubuli. Le proteine associate ai microtubuli sono dette MAP. Le MAP si legano a intervalli

regolari lungo la parete dei microtubuli permettendo l’interazione con altri filamenti e strutture

cellulari.

MOVIEMENTO INTRACELLULARE BASATO SU MICROTUBULI:

Le proteine motrici utilizzano i microtubuli come vie di trasporto di

vescicole e organelli: CHINESINE percorre il microtubulo verso

l’estremità +, verso l’esterno; DINEINE verso il -, verso il nucleo.

Prendono energia dall’idrolisi di ATP e GTP. Sono costituite da due

teste motrici globulari che si legano ai microtubuli e sono coinvolte

nell’idrolisi di ATP, una coda avvolta a elica e una catena leggera che

trasporta un carico. Una delle due teste globulari si sposta in avanti

e stabilisce un legame con una nuova subunità di B-tubulina, seguito

dal distacco della testa globulare arretrata che può formare un

nuovo legame con una regione più avanzata del microtubulo.

Chinesine e dineine trasportano le vescicole sinaptiche: le prime si

occupano del trasporto centrifugo delle vescicole sinaptiche verso

il terminale assonico +, le dineine si occupano del trasporto centripeto verso il corpo cellulare -

.

MOTILITA’ BASATO SU CIGLIA E FLAGELLI: i microtubuli sono cruciali anche per il

movimento delle appendici mobili di cellule eucarioti come ciglia e flagelli. Ciglia e flagelli

condividono una base strutturale simile ma differiscono per la lunghezza, nel numero per cellula

e nella modalità di battito.

CIGLIA: strutture contrattili usate dalla cellula per spostarsi o per spostare qualcosa come il

muco. Sono tipiche dell’epitelio respiratorio. Si presentano numerose sulle superfici ciliate,

hanno battito a remo coordinato.

FLAGELLI: muovono le cellule in ambiente fluido. Sono più lunghi delle ciglia e sono limitati a 1

o pochi per cellula. Differiscono poi dalle ciglia per la natura del loro battito a gomito.

Presentano una struttura microtubulare chiamato ASSONEMA, connesso a un corpo basale, il

tutto circondato da un’estensione di membrana plasmatica, è quindi una struttura intracellulare.

Tra assonema e corpo basale c’è una zona di transizione in cui la disposizione dei microtubuli del

corpo basale si converte in quella tipica dell’assonema. Struttura dell’assonema con disposizione

9 + 2: 9 doppiette periferiche e una coppia centrale.

Le 9 doppiette sono costituite da un tubulo A completo a 13 protofilamenti e un tubulo B

incompleto a 11 protofilamenti, mentre la coppia interna è costituita da tubuli A completi. 107

Sostanze che bloccano la mitosi agendo sul citoscheletro sono utilizzate per la cura del cancro:

- Colchina, colcemide, vincristina, vinblastina: si legano alla tubulina e impediscono la

polimerizzazione della tubulina impedendo la mitosi

- Taxolo: stabilizza i microtubuli bloccando la mitosi.

FILAMENTI INTERMEDI IF

Hanno diametro 8-12 nm. I filamenti intermedi in ogni tipo cellulare sono formati da polimeri di

proteine diverse, ma tutte simili per dimensioni e struttura. Organizzati in fasci proteici di

elevate resistenza meccanica in quanto hanno ruolo di struttura, di sostegno della tensione

cellulare, aiutano l’adesione cellula-cellula. Sono le strutture più stabili e meno solubili del

citoscheletro. Divisi in: Citoplasmatici (cheratine negli epiteli, vimentina nel tessuto connettivo,

neurofilamenti nelle cellule nervose) e nucleari (nelle lamine nucleari). Tutte le proteine sono

fibrose. Struttura: MONOMERO: monomeri polipeptidici lineari lunghi mediamente 48 nm,

dotati di una testa amminoterminale, un dominio a bacchetta ad α elica e una coda

carbossiditerminale. Il dominio centrale è un polipeptide piuttosto conservato in tutte le

proteine della classe, formato da una sequenza di sette amminoacidi ripetuta per tutta la

regione che costituiscono 4 regioni a elica inframezzate da 3 corti segmenti di connessione. I

due terminali sono globulari. I monomeri si polimerizzano in DIMERO coiled-coil paralleli,

allineati. Essi si associano lateralmente in modo antiparallelo e sfalsato in TETRAMERI, la

subunità stabile dei filamenti intermedi; tale accoppiamento fa sì che il tetramero termini con

due domini amminici, rendendo il polipeptide

non polare.

I tetrameri liberi si compattano, quindi si

allineano ed affiancano con disposizione ad

elica in un filamento cavo: 2 tetrameri formano un PROTOFILAMENTO, da 8 protofilamenti

connessi coda-coda formano un FILAMETNO INTERMEDIO. L'assemblamento avviene

spontaneamente nell'ambiente citoplasmatico, ma può essere regolato da vari fattori. Il più

importante è la fosforilazione di residui di serina degli amminoterminali, il quale provoca

disassemblaggio. MICROFILAMENTI MF

Con diametro 7 nm sono le strutture citoscheletriche più sottili del citoscheletro.

Principalmente conosciuti per l’azione contrattile nelle cellule muscolari dei microfilamenti di

actina che interagiscono con filamenti più spessi di miosina. I microfilamenti sono coinvolti poi

nella migrazione cellulare tramite lamellopodi e filopodi, supporto strutturale.

Il costituente proteico fondamentale dei microfilamenti è l’ACTINA le cui singole molecole si

chiamano ACTINA G, globulare. Una volta sintetizzata si organizza in una struttura a U con una

cavità centrale che lega ATP o ADP. In condizioni adeguate le molecole di actina G polimerizzano

a formare i microfilamenti e sotto questa forma l’actina è chiamata ACTINA F, filamentosa.

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Ogni filamento è costituito da due protofilamenti che si avvolgono. Tutte le subunità hanno lo

stesso orientamento.

POLIMERIZZAZIONE DELL’ACTINA

Ogni monomero di actina (actina globulare, [G]) ha siti di legame forti che mediano le interazioni

testa-coda con due altri monomeri Perciò i monomeri di actina polimerizzano formando filamenti

(actina filamentosa [F]) Poichè tutti i monomeri di actina sono orientati nella stessa direzione,

i filamenti di actina hanno una polarità

distinta nelle loro estremità: Estremità

a barbigli o sfrangiata (“barbed”),

estremità più (+) polimerizza

velocemente; Estremità appuntita

(“pointed”), estremità meno (-)

polimerizza lentamente. La diversa

velocità di allungamento riflette in una

differenza nella concentrazione critica

per l’aggiunta di monomeri. L’actina

legata a ATP si associa con estremità a

barbigli che si accresce rapidamente ed è poi idrolizzata ad ADP. Dato che ADP-actina si

dissocia dal filamento più velocemente di ATP-actina. La concentrazione critica dei monomeri

di actina è più alta per l’aggiunta alla terminazione appuntita rispetto a quella a barbigli. Un

equilibrio viene raggiunto alla concentrazione di monomeri intermedia tra le due concentrazioni

critiche. I filamenti di actina vanno incontro a continui rimaneggiamenti e cicli di

polimerizzazione e depolimerizzazione Actina globulare = 375 aa con associata una molecola di

ATP. La polimerizzazione dell’actina richiede Mg2+, K+ ed ATP. Si ha una fase di latenza, in cui

si nucleano nuovi filamenti e poi una fase di polimerizzazione rapida, in cui si allungano i

filamenti. Dopo la polimerizzazione, l’ATP si idrolizza ad ADP, che resta intrappolato nel

polimero. L’estremità con ADP depolimerizza più rapidamente. Si parla anche qui di

TREADMILLING. Filamenti di actina e comportamento cellulare:

- polarizzazione della cellula

- protrusione della membrana plasmatica

- adesione cellulare

- segnali esterni possono direzionare la migrazione cellulare

Le cellule controllano spazialmente il processo di polimerizzazione dell’actina. A questo scopo le

cellule usano proteine associate all’actina non motrici e il controllo avviene a livelli diversi della

polimerizzazione, ci sono proteine che:

- legano i monomeri, - che form