Biologia animale 4

CONTROLLO/REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA

REGOLAZIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI:

Le cellule di un organismo hanno tutte lo stesso GENOMA: insieme dei geni che caratterizzano

un organismo (EQUIVALENZA GENOMICA), ma le informazioni contenute nel genoma non si

esprimono contemporaneamente e sono finemente regolate da MECCANISMI DI CONTROLLO.

Tutte le cellule hanno la stessa POTENZIALITA’ GENOMICA. La regolazione dell’espressione

genica è fondamentale sia durante l’embriogenesi in cui la cellula zigote deve iniziare a

proliferare per dare l’embrione ma anche differenziarsi per avere comportamenti diversi e

sintetizzare proteine diverse; ma anche nelle cellule adulte già differenziate durante la sua

vita non sono prodotte sempre tutte le stesse proteine.

I geni possono essere:

-Geni ad espressione costitutiva (housekeeping): tutte le cellule esprimono questi geni sempre

-Geni ad espressione condizionale (inducibili, reprimibili) geni presenti in tutte le cellule ma

non sempre trascritti

-Geni specializzati (espressi solo in cellule di tessuto-specifici, che a loro volta possono essere

costitutivi o condizionali)

È evidente dall’analisi del TRASCRITTOMA: insieme di mRNA prodotti da una determinata

popolazione cellulare; e del PROTEOMA: insieme delle proteine prodotte da una determinata

popolazione cellulare. È possibile che le cellule abbiamo stesso trascrittoma con la sintesi degli

stessi mRNA ma producono proteine diverse in base a se servono o no alla cellula.

Per comprenderla facciamo una parentesi sui procarioti.

REGOLAZONE GENICA NEI PROCARIOTI:

-Finalità: rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali risparmiando il più possibile

energia, quindi niente mRNA o proteine che non servano subito.

-Base fisiologica: -la maggior parte dei geni è espressa costitutivamente -pochi geni sono

regolati, ognuno con il proprio meccanismo individuale, di induzione o di repressione - la

traduzione è subito successiva alla trascrizione - gli mRNA hanno vita breve.

Due esempi di geni regolati nei procarioti: OPERONE LAC - INDUCIBILE (induzione della

trascrizione dei geni strutturali da substrato) e OPERONE TRIPTOFANO - REPRIMIBILE

(repressione della trascrizione dei geni strutturali da prodotto finale)

OPERONI: complesso funzionale sul cromosoma batterico, comprende un insieme di geni e cioè

più GENI STRUTTURALI, un PROMOTORE, un OPERATORE ed è preceduto da un gene

regolatore.

>>OPERONE LAC - INDUCIBILE: gruppo di geni batterici adiacenti che codificano per gli enzimi

coinvolti nel metabolismo del lattosio (glucosio+galattosio disaccaride) e la cui trascrizione è

selettiva inibita dal REPRESSORE LAC. È una via catabolica (di degradazione) normalmente

inattiva (non espressa/silente) che viene attivata (INDOTTA) dalla presenza della molecola da

degradare, il lattosio. Se entra lattosio nella cellula esso dice di attivare la trascrizione di

questo operone per il suo metabolismo. Operone policistronico, 3 geni strutturali qui codificano

per 3 proteine per il metabolismo del lattosio.

-lac Z: per la betagalattosilasi: scinde lattosio in glucosio e galattosio 82

-lac Y: galattoside permeasi: proteina di membrana che permette il trasporto del lattosio

all’interno della cellula.

-lac A: tiogalattoside acetiltransferasi

In assenza di lattosio una PROTEINA

REPRESSORE, codificata da un GENE

REPRESSORE adiacente all’operone, si lega

all’OPERATORE (che non c’è negli eucarioti),

e siccome essa è ingombrante copre parte

del promotore e la RNA polimerasi non può

legarsi bloccando la trascrizione di geni

strutturali.

A monte di questo c’è la sequenza PROMOTORE

(uguale negli eucarioti) dove si lega la RNA

polimerasi.

Arriva lattosio nella cellula quindi ho bisogno

degli enzimi. Un metabolita del lattosio,

ALLOLATTOSIO si lega alla proteina

repressore in un sito allosterico allontanandola

dall’operatore. A questo punto l’operone e il

promotore sono liberi e si lega RNA polimerasi

per cominciare trascrizione dell’operone.

Il promotore del gene è DEBOLE. Non basta che entri il lattosio nella

cellula. È necessario che contemporaneamente anche i livelli di glucosio

dentro la cellula siano bassi. Se i livelli di glucosio nella cellula sono

bassi si va attivare l’enzima adenilato ciclasi che agisce sull’adenosina

trifosfato, togliendogli due fosfati. Formazione di adenosin

monofofato ciclico cAMP. cAMP si lega con un ATTIVATORE, la

proteina CAP e stimola il suo legame alle sequenze regolatrici dei vari

operoni implicati nel metabolismo degli zuccheri. CAP interagisce con

la subunità alfa della RNA polimerasi per facilitare il legame della

polimerasi al promotore.

Il promotore debole per essere trascritto richiede il legame di un

attivatore CAP che facilita il legame tra promotore e RNA polimerasi.

La proteina CAP ha un suo sito di attacco a monte del promotore

– lattosio + glucosio -> si repressore / no CAP + lattosio + glucosio -> no repressore / no CAP

- lattosio – glucosio -> si repressore / si CAP + lattosio -glucosio -> no repressore / si CAP

Operone acceso 83

>>OPERONE TRIPTOFANO- REPRIMIBILE: gruppo di geni batterici adiacenti che codificano

per gli enzimi per la sintesi dell’amminoacido triptofano.

È una via anabolica normalmente attiva (espressa) che viene INATTIVATA/REPRESSA dalla

presenza del prodotto degli enzimi codificati.

Operone è policistronico, 5 enzimi.

E’ attivo quando la cellula batterica deve

sintetizzare triptofano perché i livelli sono

bassi. La proteina repressore è inattiva ed è

quindi incapace di impedire la trascrizione, non

può legarsi all’operatore. L’RNA polimerasi si

lega al promotore e si ha la trascrizione.

Quando i livelli intracellulari di triptofano sono

elevati la trascrizione degli enzimi viene

repressa. Il prodotto finale dell’azione dei

enzimi, l’amminoacido triptofano, si lega ad un

sito allosterico della proteina repressore che si

attiva e si può legare all’operatore coprendo

parzialmente anche il promotore che non viene

riconosciuto dalla RNA polimerasi. Vi rimane

legato finché il triptofano non sia di nuovo

richiesto dalla cellula.

Promotore FORTE, quando la RNA polimerasi si lega al suo promotore funziona senza bisogno di

altre proteine come l’esempio di prima.

Concetto: l’espressione di un gene è regolata da sequenze di DNA che stanno a monte di quel

gene. Nel caso degli operoni dei procarioti ci sono due sequenze regolatrici a monte rispetto il

sito di inizio della trascrizione: promotore e operatore. Sul promotore va la RNA polimerasi.

Capire questo ha reso possibile la comprensione di quello che avviene negli eucarioti dove il gene

a monte ha solo promotore senza operatore.

Differenze:

-Eucarioti hanno genoma più vasto e complesso -compartimentazione del genoma che nei

procarioti non è compartimentato -organizzazione strutturale del genoma -modificazione post

traduzionale delle proteine (due cellule in cui ho stesso gene trascritto in RNA con stessa

proteina ma in due cellule diverse una subisce trasformazione chimica e viene attivata mentre

un’altra no)-stabilità dell’mRNA.

REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI

Discorso più complesso. I meccanismi avvengono a livelli diversi nella via che va dal DNA alle

proteine.

Finalità:

-permettere il differenziamento cellulare- risposta a messaggi che arrivano da altre cellule-

risposta a cambiamenti ambientali (molte sostanze chimiche nell’ambiente sono in grado una

volta entrati nelle cellule di regolarne l’espressione genica). 84

Per passare da un gene a proteina funzionale passo attraverso tutti i meccanismi che sono i

principali LIVELLI DI REGOLAZIONE/ESPRESSIONE GENICA:

nel nucleo:

-controllo genomico (meccanismi epigenetici): a livello della cromatina come la decondensazione

della cromatina, la metilazione del DNA, l’acetilazione degli istoni. (Ora il gene è utilizzabile

per l’espressione)

-trascrizione: che è controllata da fattori di trascrizione (si forma il pre-mRNA) (da qui in poi

si chiamano meccanismi post-trascrizionali). Importante perché i controlli operano per

determinare quali geni vengono trascritti e per quanto tempo.

-maturazione dell’mRNA (con lo splicing e altri eventi di maturazione). Importanti perché

determinano quali parti dei trascritti primari entrano a far parte degli mRNA.

-esportazione dal nucleo

Nel citoplasma

-traduzione dell’mRNA controllata da fattori di inizio e repressori della traduzione oppure

degradazione dell’mRNA. (i polipeptidi sono sintetizzati) importanti perché determinano se un

mRNA deve essere tradotto e per quanto tempo e quanto frequentemente.

-post-traduzione ci sono vari eventi come il ripiegamento e l’assemblaggio della proteina, il

dislocamento in organelli o la degradazione

1° LIVELLO- CONTROLLO TRASCRIZIONALE

RNA polimerasi II si deve legare alla TATA BOX (promotore costitutivo che si trova circa 25

nucleotidi a monte del sito di inizio della trascrizione) e intervengono fattori di trascrizioni

detti TFIID (TBP) e a seguire TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIIH (fosforila la RNA

polimerasi II). Si forma il COPLESSO BASALE DI INIZIO TRASCRIZIONE che si deve per

forza formare se no la trascrizione non inizia.

A monte, a distanza variabile del promotore costitutivo (tata box) possono essere presenti

SITI REGOLATIVI/altre sequenze regolatrici dette ENHANCER (intensificatori) o

SILENCER (silenziatori).

I siti regolativi vengono riconosciuti da

proteine che sono anch’esse fattori di

trascrizione e vi si legano. Dal momento

che enhancer e silencer possono essere

lontani dal gene che regolano, la proteina

insieme a coattivatori proteici induce un

cambiamento conformazionale del DNA

che forma un’ansa in modo che la proteina

che ha attivato l’enhancer si trova a

contatto con il complesso basale. Se

questo era enhancer la trascrizione inizia o aumenta velocità, se era silencer la trascrizione

viene silenziata. In genere coinvolto anche un mediatore ovvero un altro coattivatore che

facilita il corretto posizionamento dei fattori trascrizionali generali e la RNA polimerasi II a

livello del promotore. Alcuni geni a monte della tata box non hanno una sola sequenza regolatrice

ma molte, a cui si legano proteine diverse FATTORI DI TRASCRIONE. 85

Un esempio di fattori di trascrizione sono i recettori degli ormoni steroidei.

In questo esempio, un ormone (un glucocorticoide) si lega a un recettore citoplasmatico, che

migra nel nucleo e funge da attivatore della trascrizione. L’ormone entra nella cellula dal fluido

extracellulare, diffonde attraverso il doppio strato fosfolipidico, entra nel citoplasma dove si

lega a un recettore per glucocorticoidi. Il legame

dell’ormone cambia la conformazione del

recettore e ne determina la traslocazione nel

nucleo, dove agisce da fattore di trascrizione

legandosi ad un elemento di risposta ai

glucocorticoidi (GRE) del DNA. Il legame di due

molecole adiacenti di recettore porta alla

formazione di un dimero che attiva la

trascrizione del DNA, portando alla sintesi di

specifiche proteine nel citoplasma.

2° LIVELLO- CONTROLLO POST-TRASCRIZIONALE: controllo dello splicing alternativo

Due cellule che esprimono lo stesso gene danno lo stesso pre-mRNA ma in esse questo può

andare in contro a un processo di splicing diverso-> alternativo. Una sequenza di RNA che in una

cellula è esone quindi mantenuta nell’mRNA maturo, in un’altra è considerato introne e viene

tagliato. Ho isoforme proteiche, due proteine diverse.

3° LIVELLO- CONTROLLO TRADUZIONALE: controlla il grado e l’efficienza con cui gli mRNA

sono utilizzati come stampo nella sintesi delle proteine.

In due cellule diverse è stato trascritto lo stesso gene, l’mRNA è maturato in modo uguale. Non

è detto che venga tradotto nello stesso modo.

Esempio: FERRITINA (elementi IRE di risposta al ferro)

proteina che ha il compito di legare il ferro nelle cellule.

Quando la concentrazione di ferro è bassa, una proteina

repressore IRP (proteina regolatrice del ferro repressore),

si lega ad una sequenza specifica nel 5’-UTR dell’mRNA per la

ferritina, chiamata IRE, che è ripiegata a formare un’ansa a

forcina situata a monte del codone di inizio. Con questa

proteina ingombrante i ribosomi non possono scorrere lungo

l’mRNA che non può essere tradotto. Quando il ferro è

disponibile, esso si lega a IRP modificandone la

conformazione e causando la sua dissociazione dall’IRE; in tal

modo, l’mRNA può essere tradotto in ferritina.

La lunghezza della coda di poli-A regolano la stabilità dell’mRNA e quindi ne regolano la

traduzione. 86

MICRORNA

Meccanismo dei micro RNA, miRNA ovvero piccole

sequenze di RNA, 21-22 nucleotidi, che la cellula è in

grado di attivare quando vuole attivare la traduzione

di mRNA già presente e maturo nella cellula. I geni che

producono i microRNA sono inizialmente trascritti in

molecole di RNA più lunghe dette, i pri-miRNA ovvero

microRNA primari, che si ripiegano in forcine. Nel

nucleo c’è un enzima detto DROSHA taglia i pri-

miRNA in RNA a forcina più piccoli detti precursori

dei microRNA, i pre-miRNA lunghi circa 70 nucleotidi.

I pre-miRNA sono esportati nel citoplasma dove

DICER li taglia in microRNA maturi a singolo filamento

rompendo i legami a idrogeno della lunghezza di 21-22

nucleotidi. Essi vengono associati a un complesso

proteico RISC formando miRISC. Ogni miRISC

silenzia l’espressione degli mRNA contenenti sequenze

complementari a quella del microRNA contenuto nel

miRNA. Se i miRISC sono parzialmente

complementari all’mRNA bersaglio si ha l’inibizione

della traduzione, se invece sono completamente complementari si ha la degradazione dell’mRNA.

La presenza dei primi miRNA risale al 1993 nel C.elegans. 1998 Premio nobel Fire e Mello che li

descrivono. Solo nel 2001 se ne è compresa la funzione.

Fire e Mello mostrarono il meccanismo che permette all’RNA a doppio filamento di silenziare

l’espressione di alcuni geni target specifici, meccanismo seguito dai virus che producono RNA a

doppio filamento. Loro creano delle sequenze di RNA a doppio filamento dsRNA - Double-

stranded RNA (Il dsRNA costituisce il materiale genetico di alcuni virus (virus RNA a doppio

filamento)). Nella cellula una ribonucleasi DICER taglia il dsRNA in tanti siRNA small-

interfering RNA, corti frammenti a doppio filamento di 21-22 nucleotidi. Meglio detti exo-

siRNA in quanto sono introdotti in modo esogeno. Essi si combinano con un complesso proteico

detto RISC (RNA-induced silencing complex, complesso di silenziamento indotto dall’RNA) che

determina il degrado di uno dei due siRNA. Si forma un siRISC a singolo filamento. Allo stesso

modo di miRISC quando siRISC si lega al gene target per l’appaiamento delle basi complementari

e ne determina l’inibizione o il degrado per opera di una ribonucleasi SLICER facente parte del

RISC.

4° LIVELLO- CONTROLLO POST-TRADUZIONALE:

La quantità di proteina dipende dalla stabilità dell’mRNA o della proteina stessa. Quando l’mRNA

esce dal nucleo può essere degradato o tradotto. Qua